EP1865974A1 - Combinaison d'un fixateur histologique ou cytologique, et d'un ou plusieurs composes photoactivables de la famille des quinones, en particulier l 'hypericine, l'hypocrelline a et hypocrelline b - Google Patents

Combinaison d'un fixateur histologique ou cytologique, et d'un ou plusieurs composes photoactivables de la famille des quinones, en particulier l 'hypericine, l'hypocrelline a et hypocrelline b

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Publication number
EP1865974A1
EP1865974A1 EP06743663A EP06743663A EP1865974A1 EP 1865974 A1 EP1865974 A1 EP 1865974A1 EP 06743663 A EP06743663 A EP 06743663A EP 06743663 A EP06743663 A EP 06743663A EP 1865974 A1 EP1865974 A1 EP 1865974A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
cells
tissue
hypericin
sample
solution
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP06743663A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Peltier Eric
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Maclip SARL
Original Assignee
Novacyt SA
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Filing date
Publication date
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Withdrawn legal-status Critical Current

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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/12—Ketones
    • A61K31/122—Ketones having the oxygen directly attached to a ring, e.g. quinones, vitamin K1, anthralin
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/30—Staining; Impregnating ; Fixation; Dehydration; Multistep processes for preparing samples of tissue, cell or nucleic acid material and the like for analysis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo

Definitions

  • the invention relates to the combination, in a solution or kit, of a histological or cytological fixator, and one or more photoactivatable compounds of the family of quinones.
  • the invention also relates to a method for labeling cells or tissues with one or more photoactivatable compounds of the quinone family, wherein the cells or tissues contacted with a histological or cytological fixator are labeled, simultaneously or afterwards, with the photoactivatable compounds of the family of quinones.
  • Photoactivatable compounds of the quinone family include, in particular, polycyclic quinones such as hypericin, hypocrelline A or hypocrelline B, or derivatives thereof.
  • “Derivative” means a chemically modified compound in which the modification is considered routine by the ordinary skill chemist, such as an ester or amide of an acid, protecting groups, such as a benzyl group for a alcohol or a thiol, and a tert-butoxycarbonyl group for an amine.
  • hypocrelline A (1H-Cyclohepta [ghi] perylene-5,11-dione, 1-acetyl-2,3-dihydro-2,6,12-trihydroxy-4,8,9,13-tetramethoxy-2- methyl-, cis-) and hypocrelline B
  • hypocrellin A hypocrellin B
  • the absorption and fluorescence emission maxima, measured in methanol, are respectively 463 nm and 600 nm for hypocrelline A, and 459 nm and
  • Hypericin has the chemical formula 1, 3,4,6,8,13-Hexahydroxy-10,11-dimethylphenanthro (1,10,9,8, opqra) perylene-7,14-dione:
  • Hypericin is a natural pigment isolated from plants of the genus Hypericum, which is a potent selective inhibitor of protein kinase C.
  • Hypericin has a variety of pharmacological properties ranging from antibacterial or antiviral activity to antineoplastic activity and induction of apoptosis. Hypericin has long been known for its effects photosensitizers and as part of the composition of an antidepressant (St. John's Wort).
  • Hypericin infused into the bladder has been shown to accumulate selectively in urothelial carcinomatous cells. This characteristic, associated with its photosensitizing and fluorescent properties, led several teams to propose a diagnosis of bladder cancer by fluorescence cytology ex vivo (Olivo et al., 2003a, Olivo et al., 2003b, Pytel and Schmeller, 2002). The use of hypericin as a photodynamic treatment of carcinomatous lesions of the bladder has also been proposed (Kamuhabwa et al., 2004). These methods involve in vivo infusion of hypericin into the patient's bladder.
  • hypericin is a lipophilic molecule that can be incorporated into the lipid bilayer of cell membranes.
  • the exact integration mechanisms are not known but it is assumed that this integration is mediated by active transport. So far, hypericin has only been used on living cells.
  • hypericin labeling on living cells, for example by culturing in vitro cells in a solution containing hypericin, or by hypericin extemporaneously in contact with freshly harvested cells or tissues, so that hypericin can be incorporated by living cells.
  • hypericin mixed with a fixative
  • hypericin is incorporated very rapidly by tumor cells suspended in the fixative / hypericin mixture, even though the cells have been killed by the contact with the fixer.
  • Fixation is an operation intended to kill the cells in order to preserve them, as much as possible, in the state they were during life.
  • fault fixation there is a risk of autolysis.
  • the best fixators are those which, while acting rapidly, produce as little as possible of secondary modifications or artifices likely to give a very false idea of the internal morphology of the cells.
  • the invention therefore relates to a solution comprising a histological or cytological fixator and one or more photoactivatable compounds of the quinone family.
  • the photoactivatable compound (s) of the family of quinones are selected from the group consisting of hypericin, hypocrellin A and hypocrellin B. More preferably, said composition comprises, or consists of, a histological or cytological fixator and hypericin.
  • cytological fixator or “histological or cytological fixation solution” is meant a solution commonly used in histological or cytological analysis to achieve the fixation of cells or tissues.
  • cytological fixatives include fixatives based on ethyl alcohol, methyl alcohol, or polyethylene glycol (PEG).
  • histological fixatives include formaldehyde-based fixatives, such as a 10% pure formalin solution ("pure formalin” corresponding to the 40% aqueous formaldehyde solution, generally sold commercially as “formalin””), A formalin-NaCl solution (constituted for example by mixing 10 ml of pure formalin, 0.9 g of NaCl and 90 ml of water), a solution of formaldehyde - acetic acid (for example 100 ml of pure formalin, 50 ml of glacial acetic acid and 850 ml of water ), alcoholic liquor liquor (or Duboscq Brasil, for example 250 ml of pure formalin, 70 ml of glacial acetic acid, 5 g of picric acid and 680 ml of 70 ° ethanol).
  • formaldehyde-based fixatives such as a 10% pure formalin solution (“pure formalin” corresponding to the 40% aqueous formaldehyde solution, generally sold commercial
  • fixatives include alcohol-formaldehyde-acetic acid fixative (20 ml of pure formalin, 50 ml of glacial acetic acid, 750 ml of absolute ethyl alcohol, and 180 ml of water), or fixatives. based on zinc chloride (10% formalin, 10-50 g / l zinc chloride, and 5% acetic acid or NaCl 9 g / l, optionally 75% absolute alcohol).
  • the solution according to the invention advantageously comprises 1 to 20 micromoles / ml, preferably 1 to 15 micromoles / ml, preferably 1 to 10 micromoles / ml, and more preferably 1 to 2 micromoles / ml of photoactivatable compounds of the family of quinones.
  • the invention also relates to a kit comprising a histological or cytological fixator and one or more photoactivatable compounds of the quinone family.
  • the photoactivatable compound (s) of the family of quinones are selected from the group consisting of hypericin, hypocrellin A and hypocrellin B.
  • the kit according to the invention comprises a histological fixator or cytological and hypericin.
  • the kit may optionally further comprise an appropriate wash buffer, a user's manual or any other suitable solution or device.
  • the invention also relates to a method for ex vivo labeling of cells or tissue with one or more photoactivatable compounds of the quinone family.
  • the method comprises the steps of: a) contacting a sample of cells or tissue with a histological or cytological fixation solution; b) simultaneously or consecutively, contacting said sample of cells or tissue with a solution comprising one or more photoactivatable compounds of the quinone family, for a time sufficient for the cells or tissue to incorporate them; and c) optionally washing said sample of cells or tissue.
  • the solution comprising the photoactivatable compound (s) of the quinone family is the histological or cytological fixation solution.
  • Steps a) and b) are then implemented simultaneously.
  • the delay fixation of a cell suspension is very short (of the order of a few minutes) and that of tissue sample of the order of one hour.
  • the incorporation of photoactivatable compounds of the family of quinones, especially hypericin, by cells in suspension generally takes 1 to 2 hours.
  • the difference in the time of incorporation of the photoactivatable compounds of the family of quinones and in the time of fixation of the cells or tissues ensures that, according to the method of the invention, the photoactivatable compounds of the quinone family are incorporated while the cells have already been fixed, in other words are dead.
  • the photoactivatable compound (s) of the quinone family are selected from the group consisting of hypericin, hypocrellin A and hypocrellin B. More preferably the method is a method for ex vivo cell labeling. or a tissue by hypericin.
  • the cells or the tissue are preferably tumor cells or suspected to be tumorous.
  • the sample of cells or tissue can thus be obtained by sampling or biopsy in a patient suspected of having a cancer and in whom it is sought to demonstrate the presence of tumor cells.
  • the sample may also have been obtained from a patient who has been diagnosed with cancer and for whom the efficacy of a therapeutic treatment is assessed by measuring the time course of hypericin incorporation by patients. cancer cells.
  • the cells or tissue can come from any organ, for example the uterus, liver, stomach, lung, esophagus, bladder, prostate, breast, etc.
  • a sample of cells may for example be a fluid sample such as urine, ascites, pleural or pericardial fluid; a smear such as cervical, vaginal, vulvar, or oesophageal smear; a malignant discharge or organ puncture, for example a superficial gland such as breast, thyroid and parotid or deep organ, such as the kidney, liver, ovaries, etc.
  • a tissue sample can be a biopsy or a total or partial excision of any organ.
  • the patient may be an animal, preferably a mammal such as a human, a rodent, a dog, a cat. Preferably the patient is a human.
  • the invention also relates to the use of a solution comprising a histological and cytological fixator and one or more photoactivatable compounds of the family of quinones, for the diagnosis of cancer or dysplasia, or the monitoring of the therapeutic efficacy of a treatment or cancer.
  • the invention more specifically proposes a method for diagnosing cancer or dysplasia, in which cells or tissue are stained with one or more photoactivatable compounds of the quinone family according to the method described above. and wherein the presence of cells or tissue labeled with the photoactivatable compound (s) of the quinone family is indicative of the presence of tumor or dysplastic cells.
  • the photoactivatable compound (s) of the quinone family are selected from the group consisting of hypericin, hypocrellin A and hypocrellin B.
  • the method of diagnosing cancer or dysplasia comprising the steps of: a) contacting a sample of cells or tissue with a histological or cytological fixation solution; b) simultaneously or consecutively, contacting said sample of cells or tissue with a solution comprising hypericin for a time sufficient for the cells or tissue to incorporate hypericin; c) optionally washing said sample of cells or tissue; and d) detecting the presence of hypericin-labeled cells or tissue; wherein the presence of hypericin-labeled cells or tissue is indicative of the presence of cancer or dysplasia.
  • Detection of cell or tissue labeling by photoactivatable compounds of the quinone family can be easily performed by measuring the fluorescence emitted by the cells or the tissue, especially at around 600 nm for hypericin, hypocrellin A or hypocrelline B.
  • step d), and preferably all the steps are performed in an automated manner, thus allowing the automatic screening of samples.
  • perinuclear cell labeling is detected.
  • the invention is illustrated in more detail in the following examples, given without limitation.
  • Cells of a human strain glioblastoma are cultured on a petri dish.
  • Hypericin is suspended in Sakomano cytological fixative solution, with a concentration of 2 micromoles per ml, four hours before the experiments.
  • the fixative solution comprising hypericin is kept away from light.
  • the glioblastoma cells are fixed directly by placing them in the hypericin-based fixative solution for one hour.
  • Comparative tests are carried out with a microspectrofluorimeter to compare the level of fluorescence intensity and the quality of the fluorescence spectrum measured in cultures of identical live glioblastoma cells, incubated at the same concentration for one hour in Sakomano cytological fixative solution. containing hypericin, and the cells attached.
  • squamous cell carcinoma squamous cell carcinoma of the cervix type HELA are grown on a Petri dish. They are then fixed in a Sakomano-type cytological fixator already containing normal epithelial cells from a cervix smear in order to verify the affinity of hypericin for the tumor cells in a cell suspension containing several types. normal cells and tumor cells. Hypericin is then suspended for one hour in the fixed cell suspension at a concentration of 2 ⁇ M / ml and stored protected from light.
  • Tests are conducted with a microspectrofluorimeter to compare the level of fluorescence intensity and the quality of the fluorescence spectrum measured. for the different cells of the suspension, incubated at the same concentration for one hour in Sakomano cytological fixative solution containing rhypericin.
  • the cells thus having a particular marking can be detected by automatic recognition means. Also, it is possible to consider an automated screening of cytological samples including cervical smear in order to select only pathological cell smears.

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Abstract

L'invention concerne la combinaison, dans une solution ou dans un kit, d'un fixateur histologique ou cytologique, et d'un ou plusieurs composés photoactivables de la famille des quinones, en particulier l'hypericine, l'hypocrelline A et/ou l'hypocrelline B. L'invention concerne également une méthode de marquage de cellules ou tissus par un ou plusieurs composés photoactivables de la famille des quinones, dans laquelle les cellules ou tissus mis en contact avec un fixateur histologique ou cytologique sont marqués, simultanément ou après, par le ou les composés photoactivables de la famille des quinones.

Description

COMBINAISON D ' UN FIXATEUR HISTOLOGIQUE OU CYTOLOGIQUE , ET D ' UN OU PLUSIEURS
COMPOSES PHOTOACTIVABLES DE LA FAMILLE DES QUINONES , EN PARTICULIER L ' HYPERICINE , L ' HYPOCRELLINE A ET HYPOCRELLINE B
L'invention concerne la combinaison, dans une solution ou dans un kit, d'un fixateur histologique ou cytologique, et d'un ou plusieurs composés photoactivables de la famille des quinones.
L'invention concerne également une méthode de marquage de cellules ou tissus par un ou plusieurs composés photoactivables de la famille des quinones, dans laquelle les cellules ou tissus mis en contact avec un fixateur histologique ou cytologique sont marqués, simultanément ou après, par le ou les composés photoactivables de la famille des quinones.
Des composés photoactivables de la famille des quinones incluent en particulier des quinones polycycliques telles que l'hypericine, l'hypocrelline A ou l'hypocrelline B, ou des dérivés de celles-ci.
"Dérivé" signifie un composé modifié chimiquement dans lequel la modification est considérée comme une routine par le chimiste à compétences ordinaires, tel qu'un ester ou un amide d'un acide, des groupes de protection, tels qu'un groupe benzyle pour un alcool ou un thiol, et un groupe tert-butoxycarbonyle pour une aminé.
L'hypocrelline A (1 H-Cyclohepta[ghi]perylene-5,11-dione, 1-acétyl-2,3- dihydro-2,6,12-trihydroxy- 4,8,9,13-tétraméthoxy-2-méthyl-, cis-) et Phypocrelline B
(1 H-Cyclohepta[ghi]perylene-5,12-dione, 3-acétyl-6,11-dihydroxy-4,8,9,13- tétramethoxy-2-méthyl) sont des quinones isolées à partir des champignons Hypocrella bambusae et Shiraia bambusicola.
hypocrelline A hypocrelline B
Ces pigments ont été utilisés en combinaison avec une photothérapie pour le traitement de différentes maladies de la peau. Récemment des propriétés antivirales ont été identifiées et il a été montré que ces quinones constituent de puissants photosensibilisants dans le traitement photodynamique du cancer
(Hirayama et al., 1997 ; Zhang et al., 1998).
Les maxima d'absorption et d'émission de fluorescence, mesurés dans le méthanol, sont respectivement 463 nm et 600 nm pour l'hypocrelline A, et 459 nm et
616 nm pour l'hyprocrelline B.
L'hypericine a pour formule chimique 1 , 3,4,6,8, 13-Hexahydroxy-10,11 -di- méthylphénanthro(1 ,10,9,8,opqra)perylène-7,14-dione :
L'hypericine est un pigment naturel isolé de plantes du genre Hypericum, qui constitue un puissant inhibiteur sélectif de la protéine kinase C.
L'hypericine présente une diversité de propriétés pharmacologiques qui vont d'une activité antibactérienne ou antivirale, à une activité antinéoplasique et à l'induction de l'apoptose. L'hypericine est connue de longue date pour ses effets photosensibilisants et comme entrant dans la composition d'un antidépresseur (le millepertuis).
C'est une molécule fluorescente qui présente un maximum d'absorption à 591 nm et un maximum d'émission de fluorescence à 594 nm, mesuré dans 5 l'éthanol.
Il a été montré que l'hypericine perfusée dans la vessie s'accumule sélectivement dans les cellules carcinomateuses urothéliales. Cette caractéristique, associée à ses propriétés photosensibilisantes et fluorescentes, a conduit plusieurs équipes à proposer un diagnostic du cancer de la vessie par cytologie de 0 fluorescence ex vivo (Olivo et al., 2003a ; Olivo et al., 2003b ; Pytel et Schmeller, 2002). L'utilisation d'hypericine en tant que traitement photodynamique des lésions carcinomateuses de la vessie a été également proposée (Kamuhabwa et al., 2004). Ces méthodes impliquent l'infusion in vivo d'hypericine dans la vessie du patient.
Il est connu que l'hypericine est une molécule lipophile qui peut être 5 incorporée dans la bicouche lipidique des membranes cellulaires. Les mécanismes exacts d'intégration ne sont pas connus mais il est supposé que cette intégration est médiée par un transport actif. Aussi, à ce jour l'hypericine n'a été utilisée que sur des cellules vivantes.
Jusqu'à présent, il était en effet considéré comme nécessaire de pratiquer 0 un marquage à l'hypericine sur des cellules vivantes, par exemple en cultivant in vitro des cellules dans une solution contenant de l'hypericine, ou encore en mettant l'hypericine extemporanément en contact des cellules ou des tissus fraîchement prélevés, de manière à ce que l'hypericine puisse être incorporée par les cellules vivantes.
-5 Contre toute attente, l'inventeur a maintenant démontré que l'hypericine, mélangée à un fixateur, est incorporée très rapidement par des cellules tumorales mises en suspension dans le mélange fixateur/hypericine, alors même que les cellules ont été tuées par le contact avec le fixateur. La mise en évidence de ce que l'hypericine est fixée aussi efficacement par les cellules, qu'elles soient vivantes ou
O mortes, ouvre de nouvelles possibilités pour le marquage cytologique ou histologique à l'hypericine, et plus généralement à l'aide de composés photoactivables de la famille des quinones.
La fixation est une opération destinée à tuer les cellules pour les conserver, autant que possible, en l'état où elles se trouvaient pendant la vie. Faute de fixation, il y a risque d'autolyse. Les meilleurs fixateurs sont ceux qui, tout en agissant rapidement, produisent le moins possible de modifications secondaires ou d'artifices susceptibles de donner une idée très fausse de la morphologie interne des cellules. Désormais, il est possible d'étudier les cellules ou les tissus à tout moment, sans être obligé de les maintenir en vie, en réalisant un marquage avec un ou plusieurs composés photoactivables de la famille des quinones, notamment à l'hypericine, simultanément ou consécutivement à la fixation des cellules ou tissus par un fixateur cytologique ou histologique. En outre, il a été mis en évidence que lorsque des cellules tumorales sont mises en suspension dans une solution de fixateur contenant des doses micromolaires d'hypericine, l'affinité de l'hypericine pour les cellules est telle que la quasi-totalité de l'hypericine est incorporée par les cellules. La phase liquide de la suspension cellulaire ne contenant pratiquement plus d'hypericine, il est alors possible de réaliser une analyse directe des cellules (analyse morphologique et/ou de l'émission de fluorescence) sans rinçage de la suspension cellulaire. Cette propriété permet donc d'envisager une automatisation de la préparation cellulaire/tissulaire et de l'analyse des cellules.
L'invention concerne donc une solution comprenant un fixateur histologique ou cytologique et un ou plusieurs composés photoactivables de la famille des quinones. De préférence, le ou les composés photoactivables de la famille des quinones sont sélectionnés dans le groupe constitué de l'hypericine, de l'hypocrelline A et de l'hypocrelline B. De manière préférentielle encore, ladite composition comprend, ou est constituée de, un fixateur histologique ou cytologique et d'hypericine.
Par « fixateur histologique ou cytologique » ou « solution de fixation histologique ou cytologique », on entend une solution couramment utilisée en analyse histologique ou cytologique pour réaliser la fixation de cellules ou tissus. Des exemples de fixateurs cytologiques incluent des fixateurs à base d'alcool éthylique, d'alcool méthylique, ou de polyéthylène glycol (PEG). Des exemples de fixateurs histologiques incluent des fixateurs à base de formaldéhyde, comme une solution de formol pur à 10% (le « formol pur » correspondant à la solution aqueuse de formaldéhyde à 40%, généralement vendue dans le commerce sous la dénomination de « formol »), une solution de formol - NaCI (constituée par exemple par mélange de 10 ml de formol pur, 0,9 g de NaCI et 90 ml d'eau), une solution de formol - acide acétique (par exemple 100 ml de formol pur, 50 ml d'acide acétique glacial et 850 ml d'eau), le liquide de Bouin alcoolique (ou Duboscq Brasil ; par exemple 250 ml de formol pur, 70 ml d'acide acétique glacial, 5 g d'acide picrique et 680 ml d'éthanol à 70°). D'autres exemples de fixateurs incluent le fixateur alcool - formol - acide acétique (20 ml de formol pur, 50 ml d'acide acétique glacial, 750 ml d'alcool éthylique absolu, et 180 ml d'eau), ou encore des fixateurs à base de chlorure de zinc (formol 10%, 10-50 g/l de chlorure de zinc, et acide acétique 5% ou NaCI 9 g/l, éventuellement alcool absolu 75 %). La solution selon l'invention comprend avantageusement 1 à 20 micromoles/ml, de préférence 1 à 15 micromoles/ml, de préférence 1 à 10 micromoles/ml, et de préférence encore 1 à 2 micromoles/ml de composés photoactivables de la famille des quinones.
L'invention concerne également un kit comprenant un fixateur histologique ou cytologique et un ou plusieurs composés photoactivables de la famille des quinones. De préférence, le ou les composés photoactivables de la famille des quinones sont sélectionnés dans le groupe constitué de l'hypericine, de l'hypocrelline A et de l'hypocrelline B. De préférence encore, le kit selon l'invention comprend un fixateur histologique ou cytologique et de l'hypericine. Le kit peut optionnellement comprendre en outre un tampon de lavage approprié, une notice d'utilisation ou toute autre solution ou dispositif approprié.
L'invention concerne aussi une méthode de marquage ex vivo de cellules ou d'un tissu par un ou plusieurs composés photoactivables de la famille des quinones. Ladite méthode comprend les étapes consistant à : a) mettre en contact un échantillon de cellules ou de tissu avec une solution de fixation histologique ou cytologique ; b) simultanément ou consécutivement, mettre en contact ledit échantillon de cellules ou de tissu avec une solution comprenant un ou plusieurs composés photoactivables de la familles des quinones, pendant un temps suffisant pour que les cellules ou le tissu les incorporent; et c) éventuellement laver ledit échantillon de cellules ou de tissu.
De manière préférentielle, la solution comprenant le ou les composés photoactivables de la famille des quinones est la solution de fixation histologique ou cytologique. Les étapes a) et b) sont alors mises en œuvre simultanément. Le délai de fixation d'une suspension cellulaire est très court (de l'ordre de quelques minutes) et celui d'échantillon tissulaire de l'ordre d'une heure. Or l'incorporation de composés photoactivables de la familles des quinones, notamment de l'hypericine, par des cellules en suspension prend généralement de 1 à 2 heures. La différence dans le délai d'incorporation des composés photoactivables de la familles des quinones et dans le délai de fixation des cellules ou tissus garantit que, selon la méthode de l'invention, les composés photoactivables de la familles des quinones sont incorporés alors que les cellules ont déjà été fixées, autrement dit sont mortes.
De préférence, le ou les composés photoactivables de la famille des quinones sont sélectionnés dans le groupe constitué de l'hypericine, de l'hypocrelline A et de l'hypocrelline B. De préférence encore la méthode est une méthode de marquage ex vivo de cellules ou d'un tissu par l'hypericine.
Les cellules ou le tissu sont préférentiellement des cellules tumorales ou suspectées d'être tumorales. L'échantillon de cellules ou de tissu peut ainsi être obtenu par prélèvement ou biopsie chez un patient suspecté d'être atteint d'un cancer et chez qui on cherche à mettre en évidence la présence de cellules tumorales. L'échantillon peut également avoir été obtenu d'un patient chez qui on a diagnostiqué un cancer et pour lequel on évalue l'efficacité d'un traitement thérapeutique en mesurant l'évolution au cours du temps de l'incorporation d'hypericine par les cellules cancéreuses.
Les cellules ou tissu peuvent provenir de n'importe que l'organe, par exemple l'utérus, le foie, l'estomac, le poumon, l'œsophage, la vessie, la prostate, sein, etc. Un échantillon de cellules peut par exemple être un prélèvement de liquide tel que les urines, l'ascite, le liquide pleural ou péricardique ; d'un frottis tel qu'un frottis cervical, vaginal, vulvaire, ou oesophagien ; d'un écoulement mamellaire ou encore d'une ponction d'organe, par exemple une glande superficielle telle que le sein, la thyroïde et la parotide ou d'organe profond, tel que le rein, le foie, les ovaires, etc. Un échantillon de tissu peut être une biopsie ou une exérèse totale ou en partie de n'importe quel organe. Le patient peut être un animal, de préférence un mammifère tel qu'un humain, un rongeur, un chien, un chat. De préférence le patient est un humain.
L'invention concerne également l'utilisation d'une solution comprenant un fixateur histologique et cytologique et un ou plusieurs composés photoactivables de la famille des quinones, pour le diagnostic d'un cancer ou d'une dysplasie, ou le suivi de l'efficacité thérapeutique d'un traitement ou d'un cancer.
L'invention propose plus spécifiquement une méthode de diagnostic d'un cancer ou d'une dysplasie, dans laquelle on réalise un marquage de cellules ou d'un tissu par un ou plusieurs composés photoactivables de la famille des quinones selon la méthode décrite plus haut, et où la présence de cellules ou d'un tissu marqué par le ou les composés photoactivables de la famille des quinones est révélatrice de la présence de cellules tumorales ou dysplasiques. De préférence, le ou les composés photoactivables de la famille des quinones sont sélectionnés dans le groupe constitué de l'hypericine, de l'hypocrelline A et de l'hypocrelline B.
Selon un mode de réalisation, la méthode de diagnostic d'un cancer ou d'une dysplasie comprenant les étapes consistant à : a) mettre en contact un échantillon de cellules ou de tissu avec une solution de fixation histologique ou cytologique ; b) simultanément ou consécutivement, mettre en contact ledit échantillon de cellules ou de tissu avec une solution comprenant de l'hypericine, pendant un temps suffisant pour que les cellules ou le tissu incorporent l'hypericine ; c) éventuellement laver ledit échantillon de cellules ou de tissu ; et d) détecter la présence de cellules ou tissu marqué par l'hypericine ; dans laquelle la présence de cellules ou tissu marqué par l'hypericine est révélatrice de la présence d'un cancer ou d'une dysplasie.
La détection d'un marquage des cellules ou tissu par des composés photoactivables de la famille des quinones peut être aisément effectuée en mesurant la fluorescence émise par les cellules ou le tissu, notamment aux alentours de 600 nm pour l'hypericine, l'hypocrelline A ou l'hypocrelline B.
Les résultats montrent qu'il existe une grande affinité de l'hypericine pour certaines cellules tumorales avec une localisation préférentielle périnucléaire, alors que les cellules normales ne montrent qu'une très faible affinité avec une localisation périphérique au niveau de la membrane cellulaire. Aussi, selon un mode de réalisation de l'invention, au moins l'étape d), et de préférence toutes les étapes, sont réalisées de manière automatisée, permettant ainsi le criblage automatique d'échantillons.
De préférence, on détecte alors un marquage périnucléaire des cellules. L'invention est illustrée plus en détail dans es exemples suivants, donnés à titre non limitatif.
EXEMPLES EXEMPLE 1
Des cellules d'un glioblastome de souche humaine sont cultivées sur boîte de Pétri.
De l'hypericine est mise en suspension dans une solution de fixateur cytologique Sakomano, avec une concentration de 2 micromoles par ml, quatre heures avant les expérimentations. La solution de fixateur comprenant l'hypericine est conservée à l'abri de la lumière.
Les cellules de glioblastome sont fixées directement en les mettant dans la solution de fixateur préparée à base d'hypericine pendant une heure.
Des tests comparatifs sont menés avec un microspectrofluorimètre pour comparer le niveau d'intensité de fluorescence et la qualité du spectre de fluorescence mesurés dans des cultures de cellules de glioblastome vivantes identiques, incubées à la même concentration pendant une heure dans la solution de fixateur cytologique Sakomano contenant de l'hypericine, et les cellules fixées.
Les résultats montrent que les spectres sont totalement superposables et que les intensités de fluorescence sont identiques entre les cellules encore vivantes et les cellules fixées.
EXEMPLE 2
Des cellules d'une lignée de carcinome malpighien épidermoïde du col de l'utérus de type HELA sont cultivées sur boîte de Pétri. Elles sont ensuite fixées dans un fixateur cytologique de type Sakomano renfermant déjà des cellules épithéliales normales provenant d'un frottis du col de l'utérus de façon à vérifier l'affinité de l'hypericine pour les cellules tumorales dans une suspension cellulaire contenant plusieurs types de cellules normales et des cellules tumorales. De l'hypericine est ensuite mise en suspension pendant une heure dans la suspension cellulaire fixée à une concentration de 2 //m/ml et conservée à l'abri de la lumière.
Des tests sont menés avec un microspectrofluorimètre pour comparer le niveau d'intensité de fluorescence et la qualité du spectre de fluorescence mesurés pour les différentes cellules de la suspension, incubées à la même concentration pendant une heure dans la solution de fixateur cytologique Sakomano contenant de rhypericine.
Les résultats montrent qu'il existe une grande affinité de rhypericine pour les cellules tumorales HELA avec une localisation préférentielle très particulière péri nucléaire, alors que les cellules normales ne montrent qu'une très faible affinité avec une localisation périphérique au niveau de la membrane cellulaire.
Les cellules présentant ainsi un marquage particulier peuvent être détectées par des moyens de reconnaissance automatiques. Aussi, il est possible d'envisager un criblage automatisé des prélèvements cytologiques et notamment du frottis du col de l'utérus afin de ne sélectionner que les étalements cellulaires pathologiques.
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Claims

REVENDICATIONS
1. Solution pour le marquage de cellules ou de tissus comprenant un fixateur histologique ou cytologique et un ou plusieurs composés photoactivables de la famille des quinones sélectionnés dans le groupe constitué de l'hypericine, de l'hypocrelline A et de l'hypocrelline B.
2. Solution selon la revendication 1 , comprenant 1 à 20 micromoles /ml de composés photoactivables de la famille des quinones.
3. Solution selon l'une quelconque des revendications précédentes, comprenant un fixateur histologique ou cytologique et de l'hypericine.
4. Kit comprenant un fixateur histologique ou cytologique et un ou plusieurs composés photoactivables de la famille des quinones sélectionnés dans le groupe constitué de l'hypericine, de l'hypocrelline A et de l'hypocrelline B.
5. Kit selon Ia revendication 4, comprenant un fixateur histologique ou cytologique et de l'hypericine.
6. Méthode de marquage ex vivo de cellules ou d'un tissu par un ou plusieurs composés photoactivables de la famille des quinones, ladite méthode comprenant les étapes consistant à : a) mettre en contact un échantillon de cellules ou de tissu avec une solution de fixation histologique ou cytologique ; b) simultanément ou consécutivement, mettre en contact ledit échantillon de cellules ou de tissu avec une solution comprenant un ou plusieurs composés photoactivables de la famille des quinones sélectionnés dans le groupe constitué de l'hypericine, de l'hypocrelline A et de l'hypocrelline B, pendant un temps suffisant pour que les cellules ou le tissu incorporent le ou les composés photoactivables de la famille des quinones; c) éventuellement laver ledit échantillon de cellules ou de tissu.
7. Méthode selon la revendication 6, dans laquelle ladite solution comprenant un ou plusieurs composés photoactivables de la famille des quinones est la solution de fixation histologique ou cytologique et les étapes a) et b) sont mises en œuvre simultanément.
8. Méthode selon la revendication 6 ou 7, dans laquelle on marque des cellules ou un tissu par l'hypericine.
9. Méthode selon l'une quelconque des revendications 6 à 8, dans laquelle l'échantillon de cellules ou de tissu provient d'un patient suspecté d'être atteint d'un cancer.
10. Méthode selon l'une quelconque des revendications 6 à 9, dans laquelle l'échantillon des cellules est un prélèvement de liquide, un frottis, un écoulement mamellaire, ou une ponction d'organe.
11. Méthode selon l'une quelconque des revendications 6 à 10, dans laquelle l'échantillon de tissu est une biopsie ou une exérèse totale ou partielle d'un organe.
12. Utilisation d'une solution selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, pour le diagnostic in vitro d'un cancer ou d'une dysplasie, ou pour le suivi de l'efficacité thérapeutique d'un traitement du cancer.
13. Méthode de diagnostic in vitro d'un cancer ou d'une dysplasie comprenant les étapes consistant à : a) mettre en contact un échantillon de cellules ou de tissu avec une solution de fixation histologique ou cytologique ; b) simultanément ou consécutivement, mettre en contact ledit échantillon de cellules ou de tissu avec une solution comprenant un ou plusieurs composés photoactivables de la famille des quinones sélectionnés dans le groupe constitué de l'hypericine, de l'hypocrelline A et de l'hypocrelline B, pendant un temps suffisant pour que les cellules ou le tissu incorporent le ou les composés photoactivables de la famille des quinones ; c) éventuellement laver ledit échantillon de cellules ou de tissu ; et d) détecter la présence de cellules ou tissu marqué par le ou les composés photoactivables de la famille des quinones ; dans laquelle la présence de cellules ou tissu marqué par le ou les composés photoactivables de la famille des quinones est révélatrice de la présence d'un cancer ou d'une dysplasie.
14. Méthode de diagnostic in vitro d'un cancer ou d'une dysplasie selon la revendication 13, comprenant les étapes consistant à : a) mettre en contact un échantillon de cellules ou de tissu avec une solution de fixation histologique ou cytologique ; b) simultanément ou consécutivement, mettre en contact ledit échantillon de cellules ou de tissu avec une solution comprenant de l'hypericine, pendant un temps suffisant pour que les cellules ou le tissu incorporent l'hypericine ; c) éventuellement laver ledit échantillon de cellules ou de tissu ; et d) détecter la présence de cellules ou tissu marqué par l'hypericine ; dans laquelle la présence de cellules ou tissu marqué par l'hypericine est révélatrice de la présence d'un cancer ou d'une dysplasie.
15. Méthode selon la revendication 13 ou 14, dans laquelle au moins l'étape d) est réalisée de manière automatisée.
16. Méthode selon l'une des revendications 13 à 15, dans laquelle on détecte un marquage périnucléaire.
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