CN103868869A - 一种绿盲蝽唾液酶中蛋白酶与纤维素酶的体外提取测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种绿盲蝽唾液酶中蛋白酶与纤维素酶的体外提取测定方法，利用Paraflim膜，采取膜夹营养法提取绿盲蝽唾液酶，并测定绿盲蝽中蛋白酶与纤维素酶的活性，Paraflim膜法提取绿盲蝽唾液酶利用Paraflim膜、胶卷盒、纱布、橡皮筋、位于两层Paraflim膜间的液体营养介质，利用酶与底物反应的原理，测定绿盲蝽唾液中蛋白酶、纤维素酶的活性。本方法材料易得，操作简单方便，制作成本低，占空间小，可实现绿盲蝽唾液酶的大量、批量提取，并且绿盲蝽可继续回收利用。

Description

一种绿盲蝽唾液酶中蛋白酶与纤维素酶的体外提取测定方法

技术领域

本发明涉及植物保护领域，尤其涉及一种绿盲蝽唾液酶中蛋白酶与纤维素酶的体外提取测定方法。

背景技术

绿盲蝽是棉田的一种间歇性害虫，主要以刺吸式口器刺吸为害植物柔嫩组织，形成孔洞，造成“破叶疯”。随着转基因抗虫棉的大面积推广种植，以及棉田用药量的减少，导致转基因棉田的“非靶标害虫”-绿盲蝽大爆发，并且，逐渐从棉田继续向其他寄主迁移，威胁到了葡萄、苹果树、桃树、樱桃、梨树等果树的生长，成为多种植物的新虫害。

绿盲蝽不同于蚜虫、粉虱等汁液取食者，它主要取食植物细胞的细胞质和细胞核，属于细胞取食者。取食时，先将口针插入植物细胞内或细胞间，然后通过口针的剧烈活动撕碎植物细胞同时分泌唾液，将要取食的食物变成泥浆状，再进行吸食。昆虫的唾液成分是昆虫与植物相互关系中起联系作用的纽带，因为昆虫取食植物过程中，除咬食或刺探所造成的损伤外，唾液是昆虫对植物施加影响的主要因素。植食性昆虫唾液中含有的酶类和各种有机成分，能诱导植物的一系列生化反应。研究绿盲蝽的唾液消化酶种类并测定其含量，可以一定程度揭示绿盲蝽刺吸危害爆发成灾的原因，为绿盲蝽的持续控制提供科学依据。

绿盲蝽相较于蚜虫或者烟粉虱个体较大，活动能力较强，简单易操作的唾液酶体外提取方法较少。目前，绿盲蝽唾液酶体外提取方式一般为切头处理，加入乙酸-乙酸钠缓冲液在研钵内对其进行低温研磨，离心机低温离心，取上清以待测定其唾液酶种类及含量。该方法操作相对繁琐，需要的虫量较大，对环境条件要求严格，条件不易控制，操作不当对于结果有较大影响。

鉴于上述缺陷，本发明创作者经过长时间的研究和实践终于获得了本创作。

发明内容

本发明的目的在于提供一种绿盲蝽唾液酶中蛋白酶与纤维素酶的体外提取测定方法，用以克服上述技术缺陷。

为实现上述目的，本发明提供一种绿盲蝽唾液酶中蛋白酶与纤维素酶的体外提取测定方法，该具体过程为：

步骤a，提取绿盲蝽唾液酶；

取3龄绿盲蝽10头，饥饿6h后，置于两端开口的胶卷盒内，顶端覆以两层Paraflim膜，并在两膜间的间隙内用移液枪加入100μL液体营养介质，底端覆以纱布保持通气，重复10次；

将装置放入光照培养箱中，待绿盲蝽刺吸取食6h后，移走绿盲蝽，用移液枪收集其唾液混合物，放入1.5mL离心管中，同时，设不加绿盲蝽的对照；

步骤b，蛋白酶活性测定；

步骤b1，制作标准曲线；

首先配制浓度为1mg/mL的酪氨酸标准溶液，测定时以蒸馏水稀释至10、20、40、80、160、320和640μg/mL；取8支1.5mL离心管编号，①管加50μL水，其余每管依次分别加入50μL浓度为10、20、40、80、160、320和640μg/mL的酪氨酸溶液；每管再各加入140μL(0.55mol/L)碳酸钠溶液和20μL的Folin酚溶液，40℃下反应15min，利用分光光度计测定680nm处的OD值；

步骤b2，活性测定；

取20μL待测酶混合液于1.5mL的离心管中，加入0.5％酪蛋白50μL，40℃下反应15min，再加入10％三氯乙酸50μL于离心机在1000rpm，4℃条件下离心20min，对照组加入20μL不含酶的营养液，重复10次；取上清50μL加入20μL Folin酚和140μL0.55mol/L的碳酸钠溶液，40℃下反应15min，于分光光度计680nm处测定两组的OD值；

步骤c，纤维素酶活性测定；

步骤c1，标准曲线制作；

葡萄糖溶液：用蒸馏水溶解27mg葡萄糖定容到25ml，取10支1mL的离心管编号，并按下表1所示加入各种试剂，于分光光度计490nm处测定其OD值；

步骤c2，活性测定；

取50μL待测酶混合液于1.5mL离心管中，加入200μL0.625％的羧甲基纤维素钠溶液，再加入50μL NaoH(2mol/L)和100μL显色剂DNS(3g/L)，以不含酶营养液为对照组调零，重复10次，于分光光度计490nm处测定其OD值。

进一步，在上述步骤a中，所述培养箱施以温度为25℃±1℃，光周期为16L∶8D。

进一步，在上述步骤a中，覆膜时，在顶端开口2先覆一层足够薄的Paraflim封口膜，用移液枪在膜上滴加100μL的液体营养物质，再覆以一层Paraflim封口膜，在盒身与膜接触处压紧贴合以防止液体营养介质外漏流失，将饥饿过的绿盲蝽放入虫室，迅速以纱布覆住底端开口，以保持通气，用橡皮筋封住，以防止绿盲蝽逃逸。

进一步，在上述步骤a中，所述的液体营养介质为20％蔗糖、100mmol/L丝氨酸、100mmol/L蛋氨酸、100mmol/L天冬氨酸；配制方法为准确称取20g的蔗糖，1.05g的丝氨酸，1.49g的蛋氨酸，1.33g的天冬氨酸，用蒸馏水定容至100mL。食料灭菌后，置4℃冰箱中(不超过7天)。

进一步，在上述步骤a中，使用装置的胶卷盒包括两端开口，顶端开口以两层Paraflim膜覆盖，两层膜间为液体营养介质；胶卷盒瓶身为收集绿盲蝽的虫室，底端开口以纱布覆盖，并以橡皮筋固定。

进一步，所述胶卷盒外径为3.2cm，内径为3.0cm；胶卷盒材质为硬质塑料，高度为5.0cm，壁厚为0.1cm。

进一步，所述Paraflim封口膜为高弹性封口膜；所述的虫室体积为113.0cm³。

与现有技术相比较本发明的有益效果在于：方法材料易得，操作简单方便，制作成本低，占空间小，需要绿盲蝽数量少，可实现绿盲蝽唾液酶的大量、批量提取，并且绿盲蝽可继续回收利用。

附图说明

图1为本发明的唾液提取装置的结构示意图。

具体实施方式

以下结合附图，对本发明上述的和另外的技术特征和优点作更详细的说明。

请参阅图1所示，其为本发明的唾液提取装置的结构示意图，所述装置包括Paraflim封口膜1、顶端开口2、虫室3、底端开口4、纱布5、橡皮筋6和液体营养介质7，在本发明中，胶卷盒包括两端开口，顶端开口2以两层Paraflim膜1覆盖，两层膜间为液体营养介质；胶卷盒瓶身为收集绿盲蝽的虫室3，底端开口4以纱布5覆盖，并以橡皮筋6固定。

所述的液体营养介质为20％蔗糖、100mmol/L丝氨酸、100mmol/L蛋氨酸、100mmol/L天冬氨酸。配制方法为准确称取20g的蔗糖，1.05g的丝氨酸，1.49g的蛋氨酸，1.33g的天冬氨酸，用蒸馏水定容至100mL。食料灭菌后，置4℃冰箱中(不超过7天)。

其中，胶卷盒外径为3.2cm，内径为3.0cm；胶卷盒材质为硬质塑料，高度为5.0cm，壁厚为0.1cm。

所述Paraflim封口膜2为高弹性封口膜。所述的虫室3体积为113.0cm³。

该具体测定过程为：

步骤a，提取绿盲蝽唾液酶；

取3龄绿盲蝽10头，饥饿6h后，置于两端开口的胶卷盒内，顶端覆以两层Paraflim膜，并在两膜间的间隙内用移液枪加入100μL液体营养介质，底端覆以纱布保持通气。将装置放入光照培养箱中，培养箱施以温度为25℃±1℃，光周期为16L∶8D，待绿盲蝽刺吸取食6h后，移走绿盲蝽，用移液枪收集其唾液混合物，放入1.5mL离心管中。

在上述步骤a前，洗净胶卷盒灭菌；覆膜时，在顶端开口2先覆一层足够薄的Paraflim封口膜，用移液枪在膜上滴加100μL的液体营养物质，再覆以一层Paraflim封口膜，在盒身与膜接触处压紧贴合以防止液体营养介质外漏流失，将饥饿过的绿盲蝽放入虫室，迅速以纱布覆住底端开口，以保持通气，用橡皮筋封住，以防止绿盲蝽逃逸。

步骤b，蛋白酶活性测定；

步骤b1，制作标准曲线；

首先配制浓度为1mg/mL的酪氨酸标准溶液，测定时以蒸馏水稀释至10、20、40、80、160、320和640g/mL。取8支1.5mL离心管编号，①管加50μL水，其余每管依次分别加入50μL浓度为10、20、40、80、160、320和640μg/mL的酪氨酸溶液。每管再各加入140μL0.55mol/L的碳酸钠溶液和20μL的Folin酚溶液，40℃下反应15min，利用分光光度计测定680nm处的OD值。

步骤b2，活性测定；

取20μL待测酶混合液于1.5mL的离心管中，加入0.5％酪蛋白50μL，40℃下反应15min，再加入10％三氯乙酸50μL，于1000rpm，4℃的离心机条件下离心20min，对照组加入20μL不含酶的营养液，重复10次。取上清50μL加入20μL Folin酚和140μL0.55mol/L的碳酸钠溶液，40℃下反应15min，利用分光光度计测定680nm处两组实验的OD值。

在40℃下每分钟水解酪蛋白产生1μg麦芽糖，定义为1个淀粉酶活力单位。

经测定每头绿盲蝽唾液中蛋白酶最终含量为：5.41U/μg。

步骤c，纤维素酶活性测定；

步骤c1，标准曲线制作；

葡萄糖溶液：用蒸馏水溶解27mg葡萄糖定容到25mL。取10支1mL的离心管编号，并按下表1所示加入各种试剂，利用分光光度计测定490nm处的OD值。

表1

步骤c2，活性测定；

取50μL待测酶混合液于1.5mL离心管中，加入200μL0.625％的羧甲基纤维素钠溶液，再加入50μL NaoH(2mol/L)和100μL显色剂DNS(3g/L)，以不含酶营养液为对照组调零，重复10次，利用分光光度计测定490nm处的OD值。

在50℃下每分钟水解羧甲基纤维素钠产生1μg葡萄糖，定义为1个纤维素酶活力单位。

经测定每头绿盲蝽唾液中纤维素酶的活力为：24.33U/μg。

本发明还能够对绿盲蝽唾液酶中果胶酶和淀粉酶活性进行测定；具体步骤如下：

步骤d，测定绿盲蝽唾液酶中果胶酶活性；

步骤d1，制作1mg/mL D-半乳糖醛酸标准曲线；

配制1mg/mL D-半乳糖醛酸的溶液，取10支离心管编号，并按下表2所示加入各种试剂，在沸水浴中加热5min，冷却后，在分光光度计540nm处，以①号试管为标准空白样测定其它试管内溶液的OD值，利用回归分析求得标准曲线方程和相关系数。

表2

步骤d2，活性测定；

取50μL待测酶混合液与100μL果胶溶液(5g/L)放入1.5mL离心管中，加入100μL乙酸-乙酸钠溶液(PH4.8，0.2mol/L)，对照组加入50μL不含消化酶的营养液，进行反应，沸水终止反应。再取反应液100μL加入蒸馏水150μL和DNS溶液(3g/L)150μL，沸水浴5min，立即冷却，以不含消化酶的营养液空白调零，重复10次，利用分光光度计测定540nm处待测酶混合液的OD值。

定义50℃下每分钟水解果胶产生1μg半乳糖醛酸为1个果胶酶活力单位。

经测定每头绿盲蝽唾液中果胶酶的活性为：23.08U/μg。

步骤e，淀粉酶活性测定；

步骤e1，制作标准曲线；

首先配制浓度为5.0mg/mL的麦芽糖标准溶液10mL，测定时分别稀释至0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/mL。依次取上述溶液40μL分别置于1.5mL离心管，每管各加入40μL显色剂DNS(3g/L)，然后置于沸水浴5min，冰浴冷却后再加入蒸馏水160μL，利用分光光度计测定490nm处的OD值。

步骤e2，活性测定：

取20μL浓度为1％的淀粉溶液于1.5mL离心管中，加入20μL制备好的待测酶混合液，对照组加入20μL不含酶的营养液，混合均匀，于29℃温浴3min后，再加入40μL显示剂DNS(3g/L)和160μL蒸馏水，利用分光光度计分别测定490nm处两组实验的OD值，重复10次。

在29℃下每分钟水解淀粉产生1μg麦芽糖，定义为1个淀粉酶活力单位。

经测定每头绿盲蝽唾液中淀粉酶的活力为：193.81U/μg。

绿盲蝽唾液中消化酶活性如表3所示：

表3

以上所述仅为本发明的较佳实施例，对发明而言仅仅是说明性的，而非限制性的。本专业技术人员理解，在发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效，但都将落入本发明的保护范围内。

Claims (7)

1.一种绿盲蝽唾液酶中蛋白酶与纤维素酶的体外提取测定方法，其特征在于，该具体过程为：

步骤a，提取绿盲蝽唾液酶；

取3龄绿盲蝽10头，饥饿6h后，置于两端开口的胶卷盒内，顶端覆以两层Paraflim膜，并在两膜间的间隙内用移液枪加入100μL液体营养介质，底端覆以纱布保持通气，重复10次；

将装置放入光照培养箱中，待绿盲蝽刺吸取食6h后，移走绿盲蝽，用移液枪收集其唾液混合物，放入1.5mL离心管中；于4℃下，16000g/min离心30min，取上清，-20℃冰箱中备用；

步骤b，蛋白酶活性测定；

步骤b1，制作标准曲线；

首先配制浓度为1mg/mL的酪氨酸标准溶液，测定时以蒸馏水稀释至10、20、40、80、160、320和640μg/mL；取8支1.5mL离心管编号，①管加50μL水，其余每管依次分别加入50μL浓度为10、20、40、80、160、320和640μg/mL的酪氨酸溶液；每管再各加入140μL0.55mol/L的碳酸钠溶液和20μL的Folin酚溶液，40℃下反应15min，利用分光光度计测定680nm处的OD值；

步骤b2，活性测定；

取20μL待测酶混合液于1.5mL的离心管中，加入0.5％酪蛋白50μL，40℃下反应15min，再加入10％三氯乙酸50μL于离心机在1000rpm，4℃条件下离心20min，对照组加入20μL不含酶的营养液，重复10次；取上清50μL加入20μL Folin酚和140μL0.55mol/L的碳酸钠溶液，40℃下反应15min，于分光光度计680nm处测两组的OD值；

步骤c，纤维素酶活性测定；

步骤c1，标准曲线制作；

葡萄糖溶液：用蒸馏水溶解27mg葡萄糖定容到25ml，取10支1mL的离心管编号，并按下表1所示加入各种试剂，于分光光度计490nm处测定其OD值；

步骤c2，活性测定；

取50μL待测酶混合液于1.5mL离心管中，加入200μL0.625％的羧甲基纤维素钠溶液，再加入50μL NaoH(2mol/L)和100μL显色剂DNS(3g/L)，以不含酶营养液为对照组调零，重复10次，利用分光光度计测定490nm处的OD值。

2.根据权利要求1所述的绿盲蝽唾液酶中蛋白酶与纤维素酶的体外提取测定方法，其特征在于，在上述步骤a中，所述培养箱施以温度为25℃±1℃，光周期为16L∶8D。

3.根据权利要求1或2所述的绿盲蝽唾液酶中蛋白酶与纤维素酶的体外提取测定方法，其特征在于，在上述步骤a中，覆膜时，在顶端开口2先覆一层足够薄的Paraflim封口膜，用移液枪在膜上滴加100μL的液体营养物质，再覆以一层Paraflim封口膜，在盒身与膜接触处压紧贴合以防止液体营养介质外漏流失，将饥饿过的绿盲蝽放入虫室，迅速以纱布覆住底端开口，以保持通气，用橡皮筋封住，以防止绿盲蝽逃逸。

4.根据权利要求1所述的绿盲蝽唾液酶中蛋白酶与纤维素酶的体外提取测定方法，其特征在于，在上述步骤a中，所述的液体营养介质为20％蔗糖、100mmol/L丝氨酸、100mmol/L蛋氨酸、100mmol/L天冬氨酸；配制方法为准确称取20g的蔗糖，1.05g的丝氨酸，1.49g的蛋氨酸，1.33g的天冬氨酸，用蒸馏水定容至100mL；食料灭菌后，置4℃冰箱中，不超过7天。

5.根据权利要求1或4所述的绿盲蝽唾液酶中蛋白酶与纤维素酶的体外提取测定方法，其特征在于，在上述步骤a中，所述的胶卷盒两端开口，顶端开口以两层Paraflim膜覆盖，两层膜间为液体营养介质；胶卷盒瓶身为收集绿盲蝽的虫室，底端开口以纱布覆盖，并以橡皮筋固定。

6.根据权利要求5所述的绿盲蝽唾液酶中蛋白酶与纤维素酶的体外提取测定方法，其特征在于，所述胶卷盒外径为3.2cm，内径为3.0cm；胶卷盒材质为硬质塑料，高度为5.0cm，壁厚为0.1cm。

7.根据权利要求6所述的绿盲蝽唾液酶中蛋白酶与纤维素酶的体外提取测定方法，其特征在于，所述Paraflim封口膜为高弹性封口膜；所述的虫室体积为113.0cm³。

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