CN105693591B - 一种比率型pH荧光探针及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种比率型pH荧光探针及其制备方法与应用，该荧光探针的化学结构式如式Ⅰ所示：其中，R为‑OH或亚细胞器定位受体，该亚细胞器定位受体包括或中的一种。与现有技术相比，本发明比率型pH荧光探针光稳定性好，选择性高，pH值检测范围广且灵敏度高，制备方法简单，能够用于检测化学体系的pH值或生物活细胞内的pH值。
Description
技术领域
本发明属于小分子荧光探针领域，涉及一种比率型pH荧光探针及其制备方法与应用，尤其是涉及一种基于吲哚半花菁结构的比率型pH荧光探针及其制备方法与应用。
背景技术
化学反应的进行或完成与pH值密切相关，而组织、细胞或酶的许多生理过程如细胞增殖或凋亡、离子运输、内吞作用、多药物耐药性或肌肉收缩等活动也与人体内的pH值紧密相关，pH值的改变还会通过间隙连接和信号通路的变化影响到突触传递、神经元兴奋性和细胞间耦合等神经系统活动。pH值异常会引发一些疾病，如癌症或阿氏综合征，有报道指出细胞酸化是癌细胞凋亡的早期特征。在正常生理条件下，根据pH值不同可以把细胞划分为两个部分：酸性细胞器(pH＝4.5-6.0)及细胞质(pH＝6.8-7.4)。因此，细胞内酸性或碱性太强，都会引起细胞功能障碍。
玻璃电极法是测定pH值的常用方法，但由于其存在电化学干扰或机械损伤等缺陷，而不适合用于活体和极端pH值的测定。荧光探针检测法是基于光学信号变化的pH值测定方法，是利用一些有机化合物的荧光特性来指示目标介质酸碱度的变化。用荧光探针测定pH值是一种非侵入性的方法，既不会破坏样品，同时具有灵敏度高、选择性好、细胞毒性低、细胞膜透过性好及测试方法简单等特点。荧光探针检测法不仅可以用于荧光显微学研究，还可以实时监测细胞内pH值的变化和动态分布。
具有花菁染料结构的化合物具有优越的光谱性能，目前已经被广泛应用于生物标记、荧光成像以及靶向治疗等诸多领域。由于该类分子的光谱性能对周围环境的变化异常敏感，因而其也常被用于研究溶剂的极性性质。目前，基于这一特点，采用该结构并将其应用于溶液pH值检测的工作，特别是利用比值型荧光探针检测pH的工作受到更多的关注。相比于on-off型探针，比值型探针在检测时通过荧光光谱图两个峰变化对同一物质进行检测，使其具备了内在的自校准功能，因而检测结果更为准确和可靠。
1-(4-苄基苯甲酸)-2,3,3-甲基吲哚溴化物在游离状态下，其氮原子带正电荷，会离域在整个吲哚环上。当α-碳上接入供电子基团时，离域在吲哚环上的正电荷被中和，吲哚结构与供电子基团发生共轭，导致新分子的共轭程度增大，其电子轨道更稳定，所需的激发光能量更低，同时伴随有光谱的红移，因此该类化合物是一类较好的ICT机理荧光骨架。
申请公布号为CN 104086536 A的中国发明专利公开了一种用于检测pH值的荧光探针及其制备方法与专用检测试剂盒。该发明提供的用于检测pH值的荧光探针的结构如下所示：
该发明同时提供了该化合物的制备方法，包括如下步骤：(1)二羟基苯甲醛和吗啉经还原反应，得到取代吗啉甲基苯基二醇；(2)惰性气氛下，在碱存在的条件下，取代吗啉甲基苯基二醇与三碳菁类染料经取代分解重排反应，即得上述化合物。该发明提供的用于检测pH值的试剂盒，包括上述化合物和溶剂。上述专利公布的技术方案中，制得的荧光探针及其专用检测试剂盒对溶液的pH值具有良好的响应性，能够实现对溶酶体的标记和细胞溶酶体pH值的测定，但其pH值检测范围较窄，且仅限于细胞溶酶体pH值的检测，适用范围较小，有很大的局限性。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种光稳定性好、选择性高、合成方法简单且应用范围广的比率型pH荧光探针及其制备方法与应用。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
一种比率型pH荧光探针，该荧光探针的化学结构式如式Ⅰ所示：
其中，R为-OH或亚细胞器定位受体，该亚细胞器定位受体包括或中的一种。
当R为-OH时，该方法具体包括以下步骤：
(1)在酸性溶剂中加入式Ⅱ所示化合物及式Ⅲ所示化合物，于110-130℃加热回流4-6h，后经蒸馏，即得到式Ⅴ所示化合物，该过程化学反应式如下所示：
(2)在有机溶剂A中加入式Ⅴ所示化合物及式Ⅵ所示化合物，于70-90℃加热回流11-13h，后经蒸馏，即得到式Ⅶ所示化合物，该过程化学反应式如下所示：
(3)在有机溶剂B中加入式Ⅶ所示化合物及对羟基苯甲醛，于75-95℃加热回流22-26h，后经蒸馏、提纯，即得到式Ⅰ所示化合物，即：
需要说明的是，步骤(1)中，式Ⅱ所示化合物及式Ⅲ所示化合物反应先生成中间体式Ⅳ所示化合物，然后式Ⅳ所示化合物进一步反应生成式Ⅴ所示化合物，式Ⅳ所示化合物的化学结构式如下：
步骤(3)所述的提纯方法为硅胶层析法，展开剂为二氯甲烷与甲醇的混合液，该混合液中二氯甲烷与甲醇的质量比为10-20:1。
将与及缩合剂一起加入到有机溶剂B中，于室温下搅拌8-12h，后经水洗、蒸馏，即制得R为的pH荧光探针。
所述的与缩合剂的摩尔比为1:1.1-1.3:1.4-1.8。
作为优选的技术方案，所述的与缩合剂的摩尔比为1:1.1:1.5。
将与及缩合剂一起加入到有机溶剂B中，于室温下搅拌8-12h，后经水洗、蒸馏，即制得R为的pH荧光探针。
所述的与缩合剂的摩尔比为1:1.1-1.3:1.4-1.8。
作为优选的技术方案，所述的与缩合剂的摩尔比为1:1.1:1.5。
所述的缩合剂为DCC(中文名称为二环己基碳二亚胺)/DMAP(中文名称为4-二甲氨基吡啶)、DIC(中文名称为N,N-二异丙基碳二亚胺)/DMAP、EDC(中文名称为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)/HOBt(中文名称为1-羟基苯并三唑)/NMM(中文名称为N-甲基吗啉)或HATU(中文名称为2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯)/NMM中的一种。
步骤(1)所述的式Ⅱ所示化合物、式Ⅲ所示化合物及酸性溶剂的摩尔比为1:1:8-10，优选1:1:10。
步骤(2)所述的式Ⅴ所示化合物、式Ⅵ所示化合物及有机溶剂A的摩尔比为1:1.2:8-10，优选1:1.2:10；
步骤(3)所述的式Ⅶ所示化合物、对羟基苯甲醛及有机溶剂B的摩尔比为1:1.1:8-10，优选1:1.1:10。
所述的酸性溶剂为冰醋酸，所述的有机溶剂A为乙腈，所述的有机溶剂B为N,N-二甲基甲酰胺。
所述的荧光探针用于检测化学体系的pH值或生物活细胞内的pH值。
在实际应用时，可提前将本发明荧光探针存放于检测试剂盒中，当实验人员需要测定pH值时，直接取出使用，摆脱了繁重的试剂配制及优化过程，简化了操作。
本发明基于1-(4-苄基苯甲酸)-2,3,3-甲基吲哚溴化物，在其4号位上引入了苄基苯甲酸，苄基的引入使其光稳定性增强，可用于连续、长时间动态跟踪的荧光检测；而苯甲酸的位点可以非常方便地偶联各类亚细胞器定位基团如定位溶酶体的吗啉基团和定位线粒体的三苯基膦基团。此外，以对羟基苯甲醛作为pH响应基团，提高了该荧光探针的灵敏性，拓宽了pH的检测范围。本发明荧光探针为pH值的检测、相关化学反应的实时监测与机理研究以及各类化学生物学研究的后续测试平台的建立提供了一种高效、准确的方法。
在实际应用时，pH值检测范围为3.0-11.0，先通过测定不同pH值的探针水溶液得到相应pH值对应的紫外-可见吸收光谱和荧光发射光谱，测试采用荧光仪中常用的Scan模块进行，所得到的数据用Origin处理。利用荧光探针最大吸收波长535nm处的吸收强度对pH值作图得到的曲线，再代入公式进行计算可以得出该探针的pKa的值。利用荧光探针最大发射波长(559nm和522nm)强度的比值对pH值作图即可以看出pH值对该比值的影响过程。生物活细胞内pH环境成像测试以贴壁的HeLa细胞为考察对象，所用仪器为莱卡(Leica)激光共聚焦显微镜优化荧光成像的合适条件和相关参数(包括激发波长、时间和光强)，即可实现细胞内不同pH值的荧光成像。
与现有技术相比，本发明具有以下特点：
1)光稳定性好，在该3H-吲哚菁染料的N原子上引入苄基，大大提高了荧光探针的光稳定性；
2)pH值检测范围广且灵敏度高，从强酸性(pH＝3)到强碱性(pH＝11)，荧光变化明显，背景荧光弱，信噪比好；
3)选择性高，与其他常见的干扰离子和氨基酸作用基本没有荧光变化；
4)合成方法简单，合成步骤少，操作简便；
5)应用范围广，探针所在的水溶液颜色变化迅速，既可用于即时测定荧光化学体系的酸碱度，又可方便地进入活细胞，以检测生物活细胞内的pH值或对亚细胞器进行定位。
附图说明
图1为实施例1制得的探针Cy2在pH＝3-11时的紫外-可见吸收光谱图；
图2为不同pH值的探针Cy2溶液在535nm处的紫外吸收强度变化图；
图3为实施例1制得的探针Cy2在pH＝3-11时的荧光发射光谱图；
图4为不同pH值的探针Cy2溶液在559/522nm处的荧光强度比值变化图；
图5为不同pH值的探针Cy2溶液光稳定性测试图；
图6为实施例1制得的探针Cy2溶液对不同pH值的可逆性测试图；
图7为pH＝6.8时探针Cy2溶液的选择性和抗干扰能力测试图；
图8为pH＝8.0时探针Cy2溶液的选择性和抗干扰能力测试图；
图9为实施例1制得的探针Cy2溶液的细胞毒性测试图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例1-7中所使用的化学试剂和溶剂都购自商业途径，不需要进一步纯化即可使用。在硅胶板上进行薄层层析(TLC)，使用300-400目的硅胶(Hailang，青岛)进行柱层析。用以ppm表示化学位移的Bruker AV-400光谱仪(在氘代二甲基亚枫中，用Me4Si作为内标)上记录1H和13C NMR。
实施例1：
荧光探针Cy2的合成：
(1)2,3,3-三甲基-3H-吲哚(A)的制备：
(2)1-(4-苄基苯甲酸)-2,3,3-二甲基吲哚溴化物(B)的制备：
(3)1-(4-苄基苯甲酸)-2-[2-(4羟基苯基)-乙烯基]-3，3-二甲基吲哚溴化物(Cy2)的制备：
步骤(3)中，将化合物A和化合物B溶解于脱水二甲基甲酰胺(DMF)中，温度80度加热搅拌24h，TLC跟踪反应，待化合物B完全反应后，旋转蒸发仪蒸干，得到粗产物，再用柱层析硅胶提纯，二氯甲烷：甲醇＝15:1作展开剂，得到暗红色固体的产物Cy2。
探针Cy2的基本数据如下：
暗红色固体粉末
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.52(d,J＝15.8Hz,1H),8.11(t,J＝8.7Hz,2H),7.96(d,J＝8.3Hz,2H),7.89(dd,J＝6.2,2.3Hz,1H),7.68(dd,J＝6.5,2.0Hz,1H),7.58(d,J＝15.9Hz,1H),7.54(t,J＝2.6Hz,1H),7.46(d,J＝8.3Hz,2H),6.94(s,1H),6.92(s,1H),6.04(s,2H),1.86(s,6H).
13C NMR(400MHz,DMSO-d6)δ183.41,167.46,164.96,156.85,143.98,141.56,139.40,135.03,131.40,130.82,129.74,129.49,127.64,126.66,123.82,117.37,115.51,109.24,52.71,49.46,26.93.HRMS(ES+):C26H24NO3[M]计算值398.1756，实际值398.1759。
实施例2：
探针Cy2在不同pH值水溶液中的颜色变化：
将探针Cy2溶于二甲基亚砜(DMSO)中，配成探针母液。取一定体积该母液加入到40mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲溶液，使得探针Cy2最终浓度为20μM，用1N氢氧化钠溶液和1N盐酸调节pH值，得到10个不同pH值条件下的探针溶液，取出相同体积并放入小瓶中，可以看出，探针从酸性到碱性，其水溶液由浅黄色变成粉红色，为用肉眼观察得出pH值提供了可能。
实施例3：
探针Cy2pH滴定的光谱性能测试：
将探针Cy2溶于二甲基亚砜(DMSO)中，配成10-3M探针母液。取200μL母液加入到超纯水中，得20ml浓度为10μM的Cy2水溶液，用0.1N盐酸和0.1N氢氧化钠溶液调节pH，测定不同pH(3-11)的紫外-可见吸收光谱如图1所示和荧光发射光谱光谱如图3所示(激发波长为471nm)。
从图1可以得出，探针Cy2有2个吸收峰，分别是431nm和535nm，随着pH值减小431nm处吸收强度减小，535nm处吸收强度增大，并且等吸收点为471nm。
图2表示最大吸收535nm处的吸收强度-pH值变化曲线，根据亨德森-哈塞尔巴尔赫方程(如下式所示)算出探针分子的pKa值为7.12。
Log[(Amax-A)/(A-Amin)]＝pH-pKa
式中，Amax、Amin、A分别是A-pH曲线中吸收强度的最大值、最小值和选取的pH值相对应的吸收强度。从图3可以看出，荧光发射峰有两处，分别是522nm、559nm，探针溶液的pH值在3.0-11.0，随着pH升高，559nm处荧光发射峰强度逐渐增大，522nm处荧光发射峰强度逐渐降低。这两处荧光强度比值随pH值变化曲线如图4所示。
实施例4：
探针Cy2稳定性测试：
将探针Cy2溶于DMSO中配置含1％DMSO，10μM的探针水溶液，用氢氧化钠溶液和盐酸调节其pH，得到三个不同pH值的相同浓度的探针水溶液。每个pH值的探针水溶液分别加2ml至3个石英比色皿中，每个比色皿都隔7分钟测定其荧光发射光谱，连续测19次，然后Origin软件作图得到荧光发射峰强度比值-时间图像，结果可参见图5。
由图5可以得知，探针Cy2的荧光发射峰强度比值在pH值分别为4.0，7.8和10.4保持稳定，表明探针Cy2能对不同H+浓度持续响应，并且测试的探针水溶液体系对光和空气稳定。
实施例5：
探针Cy2可逆性测试：
将探针Cy2溶于二甲基亚砜(DMSO)中，配成10-3M探针母液。取200μL母液加入到超纯水中，得20ml浓度为10μM的Cy2水溶液，用0.1N盐酸和0.1N氢氧化钠溶液调节pH值，从pH＝3.0调节到pH＝11.0，循环6次，测定每次循环中2个pH值的探针的荧光发射光谱，用Origin软件处理谱图得到荧光发射峰强度比值-循环次数图像，结果可参见图6。
在不同pH水溶液中，探针的响应和恢复时间都小于1秒。由图6可以看出探针水溶液pH值在3.0和11.0之间来回调节的过程中，同一pH值的探针荧光发射峰强度比值几乎保持不变。
实施例6：
探针Cy2与H+结合的选择性研究：
pH探针在实际应用到细胞或者其他复杂环境中，应该具有较好的响应性能，即该探针在检测时不受到环境内其他因素干扰，例如不受除H+其他离子影响，考虑到胺类化合物在水溶液状态下能对许多金属离子有包合作用，探针Cy2的选择性测试按如下方法测试：
将探针Cy2溶于DMSO中，配成探针母液；分别配制pH值是6.8和8.0的40mM HEPES缓冲液，将配好的缓冲液分装至22个4mL EP管中，第一个不加作为空白对照，其余22个再分别加入氯化铝，氯化锌，氯化钙，硫酸铜，氯化亚铁，氯化铁，氯化镁，氯化铵，氟化钠，氯化钠，溴化钠，碘化钠，硫酸钠，硫化钠和稀盐酸，半胱氨酸，高半胱氨酸，甘氨酸，精氨酸，组氨酸，谷胱甘肽，葡萄糖至每种试剂浓度为50μM，而后分别加入探针Cy2母液，使终浓度为10μM，反应1min，测定荧光强度。激发波长均为471nm，结果如图7-8所示。
由图7-8可以看出，生物体内浓度较高的K+、Na+等离子不会对该pH值下559nm与522nm荧光强度比值产生明显的影响，同样，过渡金属和重金属离子如Zn2+，Cu2+，Fe3+和不同种类生物小分子不会对F559nm/F522nm的比值产生明显变化，表明探针Cy2的pH响应性能没有受到环境内其他因素的明显干扰。
实施例7：
探针PDS-2的细胞毒性测试：
采用CCK-8法测试探针Cy2的细胞毒性，收集对数期Hela细胞，铺板，96孔板每孔加入100μL完全培养基(10％小牛血清和90％DMEM培养基)，5％CO2，37℃孵育12h，至细胞单层贴壁，加入浓度梯度的探针Cy2，分别孵育12h和24h，每孔加入10μL的CCK-8溶液，孵育0.5h，用酶标仪测吸光度，Origin处理数据得到图9。
从图9可以得出，当探针Cy2的浓度为30μM时，孵育24h，细胞存活率仍然在80％以上，该探针生物相容性高，利于探针在后续生物样品测试中的应用。
实施例8：
一种比率型pH荧光探针，该荧光探针的化学结构式如式Ⅰ所示：
其中，R为-OH，其制备方法具体包括以下步骤：
(1)在酸性溶剂中加入式Ⅱ所示化合物及式Ⅲ所示化合物，于110℃加热回流6h，后经蒸馏，即得到式Ⅴ所示化合物，该过程化学反应式如下所示：
(2)在有机溶剂A中加入式Ⅴ所示化合物及式Ⅵ所示化合物，于70℃加热回流13h，后经蒸馏，即得到式Ⅶ所示化合物，该过程化学反应式如下所示：
(3)在有机溶剂B中加入式Ⅶ所示化合物及对羟基苯甲醛，于75℃加热回流26h，后经蒸馏、提纯，即得到式Ⅰ所示化合物，即：
需要说明的是，步骤(1)中，式Ⅱ所示化合物及式Ⅲ所示化合物反应先生成中间体式Ⅳ所示化合物，然后式Ⅳ所示化合物进一步反应生成式Ⅴ所示化合物，式Ⅳ所示化合物的化学结构式如下：
另外，步骤(3)中的提纯方法为硅胶层析法，展开剂为二氯甲烷与甲醇的混合液，该混合液中二氯甲烷与甲醇的质量比为15:1。
步骤(1)中，式Ⅱ所示化合物、式Ⅲ所示化合物及酸性溶剂的摩尔比为1:1:9，其中，酸性溶剂为冰醋酸。
步骤(2)中，式Ⅴ所示化合物、式Ⅵ所示化合物及有机溶剂A的摩尔比为1:1.2:9，其中，有机溶剂A为乙腈；
步骤(3)中，式Ⅶ所示化合物、对羟基苯甲醛及有机溶剂B的摩尔比为1:1.1:9，其中，有机溶剂B为N,N-二甲基甲酰胺。
该荧光探针用于检测化学体系的pH值。
在实际应用时，可提前将本实施例荧光探针存放于检测试剂盒中，当实验人员需要测定pH值时，直接取出使用，摆脱了繁重的试剂配制及优化过程，简化了操作。
本实施例基于1-(4-苄基苯甲酸)-2,3,3-甲基吲哚溴化物，在其4号位上引入了苄基苯甲酸，苄基的引入使其光稳定性增强，可用于连续、长时间动态跟踪的荧光检测；而苯甲酸的位点可以非常方便地偶联各类亚细胞器定位基团如定位溶酶体的吗啉基团和定位线粒体的三苯基膦基团。此外，以对羟基苯甲醛作为pH响应基团，提高了该荧光探针的灵敏性，拓宽了pH的检测范围。本实施例荧光探针为pH值的检测、相关化学反应的实时监测与机理研究以及各类化学生物学研究的后续测试平台的建立提供了一种高效、准确的方法。
在实际应用时，pH值检测范围为3.0-11.0，先通过测定不同pH值的探针水溶液得到相应pH值对应的紫外-可见吸收光谱和荧光发射光谱，测试采用荧光仪中常用的Scan模块进行，所得到的数据用Origin处理。利用荧光探针最大吸收波长535nm处的吸收强度对pH值作图得到的曲线，再代入公式进行计算可以得出该探针的pKa的值。利用荧光探针最大发射波长(559nm和522nm)强度的比值对pH值作图即可以看出pH值对该比值的影响过程。生物活细胞内pH环境成像测试以贴壁的HeLa细胞为考察对象，所用仪器为莱卡(Leica)激光共聚焦显微镜优化荧光成像的合适条件和相关参数(包括激发波长、时间和光强)，即可实现细胞内不同pH值的荧光成像。
实施例9：
一种比率型pH荧光探针，该荧光探针的化学结构式如式Ⅰ所示：
其中，R为-OH，其制备方法具体包括以下步骤：
(1)在酸性溶剂中加入式Ⅱ所示化合物及式Ⅲ所示化合物，于130℃加热回流4h，后经蒸馏，即得到式Ⅴ所示化合物，该过程化学反应式如下所示：
(2)在有机溶剂A中加入式Ⅴ所示化合物及式Ⅵ所示化合物，于90℃加热回流11h，后经蒸馏，即得到式Ⅶ所示化合物，该过程化学反应式如下所示：
(3)在有机溶剂B中加入式Ⅶ所示化合物及对羟基苯甲醛，于95℃加热回流22h，后经蒸馏、提纯，即得到式Ⅰ所示化合物，即：
需要说明的是，步骤(1)中，式Ⅱ所示化合物及式Ⅲ所示化合物反应先生成中间体式Ⅳ所示化合物，然后式Ⅳ所示化合物进一步反应生成式Ⅴ所示化合物，式Ⅳ所示化合物的化学结构式如下：
另外，步骤(3)中的提纯方法为硅胶层析法，展开剂为二氯甲烷与甲醇的混合液，该混合液中二氯甲烷与甲醇的质量比为10:1。
步骤(1)中，式Ⅱ所示化合物、式Ⅲ所示化合物及酸性溶剂的摩尔比为1:1:10，其中，酸性溶剂为冰醋酸。
步骤(2)中，式Ⅴ所示化合物、式Ⅵ所示化合物及有机溶剂A的摩尔比为1:1.2:10，其中，有机溶剂A为乙腈；
步骤(3)中，式Ⅶ所示化合物、对羟基苯甲醛及有机溶剂B的摩尔比为1:1.1:10，其中，有机溶剂B为N,N-二甲基甲酰胺。
该荧光探针用于检测生物活细胞内的pH值。
实施例10：
一种比率型pH荧光探针，该荧光探针的化学结构式如式Ⅰ所示：
其中，R为-OH，其制备方法具体包括以下步骤：
(1)在酸性溶剂中加入式Ⅱ所示化合物及式Ⅲ所示化合物，于120℃加热回流5h，后经蒸馏，即得到式Ⅴ所示化合物，该过程化学反应式如下所示：
(2)在有机溶剂A中加入式Ⅴ所示化合物及式Ⅵ所示化合物，于80℃加热回流12h，后经蒸馏，即得到式Ⅶ所示化合物，该过程化学反应式如下所示：
(3)在有机溶剂B中加入式Ⅶ所示化合物及对羟基苯甲醛，于85℃加热回流24h，后经蒸馏、提纯，即得到式Ⅰ所示化合物，即：
需要说明的是，步骤(1)中，式Ⅱ所示化合物及式Ⅲ所示化合物反应先生成中间体式Ⅳ所示化合物，然后式Ⅳ所示化合物进一步反应生成式Ⅴ所示化合物，式Ⅳ所示化合物的化学结构式如下：
另外，步骤(3)中的提纯方法为硅胶层析法，展开剂为二氯甲烷与甲醇的混合液，该混合液中二氯甲烷与甲醇的质量比为20:1。
步骤(1)中，式Ⅱ所示化合物、式Ⅲ所示化合物及酸性溶剂的摩尔比为1:1:8，其中，酸性溶剂为冰醋酸。
步骤(2)中，式Ⅴ所示化合物、式Ⅵ所示化合物及有机溶剂A的摩尔比为1:1.2:8，其中，有机溶剂A为乙腈；
步骤(3)中，式Ⅶ所示化合物、对羟基苯甲醛及有机溶剂B的摩尔比为1:1.1:8，其中，有机溶剂B为N,N-二甲基甲酰胺。
该荧光探针用于检测化学体系的pH值。
实施例11：
一种比率型pH荧光探针，该荧光探针的化学结构式如式Ⅰ所示：
其中，R为亚细胞器定位受体，该亚细胞器定位受体为其制备方法具体包括以下步骤：
(1)在酸性溶剂中加入式Ⅱ所示化合物及式Ⅲ所示化合物，于110℃加热回流6h，后经蒸馏，即得到式Ⅴ所示化合物，该过程化学反应式如下所示：
(2)在有机溶剂A中加入式Ⅴ所示化合物及式Ⅵ所示化合物，于70℃加热回流13h，后经蒸馏，即得到式Ⅶ所示化合物，该过程化学反应式如下所示：
(3)在有机溶剂B中加入式Ⅶ所示化合物及对羟基苯甲醛，于75℃加热回流26h，后经蒸馏、提纯，得到
(4)将与及缩合剂一起加入到有机溶剂B中，于室温下搅拌12h，后经水洗、蒸馏，即制得R为的pH荧光探针。
需要说明的是，步骤(1)中，式Ⅱ所示化合物及式Ⅲ所示化合物反应先生成中间体式Ⅳ所示化合物，然后式Ⅳ所示化合物进一步反应生成式Ⅴ所示化合物，式Ⅳ所示化合物的化学结构式如下：
另外，步骤(3)中，提纯方法为硅胶层析法，展开剂为二氯甲烷与甲醇的混合液，该混合液中二氯甲烷与甲醇的质量比为10:1。
步骤(1)中，式Ⅱ所示化合物、式Ⅲ所示化合物及酸性溶剂的摩尔比为1:1:9，其中，酸性溶剂为冰醋酸。
步骤(2)中，式Ⅴ所示化合物、式Ⅵ所示化合物及有机溶剂A的摩尔比为1:1.2:9，其中，有机溶剂A为乙腈；
步骤(3)中，式Ⅶ所示化合物、对羟基苯甲醛及有机溶剂B的摩尔比为1:1.1:9，其中，有机溶剂B为N,N-二甲基甲酰胺。
步骤(4)中，与缩合剂的摩尔比为1:1.2:1.8。其中，缩合剂为EDC(中文名称为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)/HOBt(中文名称为1-羟基苯并三唑)/NMM(中文名称为N-甲基吗啉)。
该荧光探针用于检测生物活细胞内的pH值。
实施例12：
一种比率型pH荧光探针，该荧光探针的化学结构式如式Ⅰ所示：
其中，R为亚细胞器定位受体，该亚细胞器定位受体为其制备方法具体包括以下步骤：
(1)在酸性溶剂中加入式Ⅱ所示化合物及式Ⅲ所示化合物，于130℃加热回流4h，后经蒸馏，即得到式Ⅴ所示化合物，该过程化学反应式如下所示：
(2)在有机溶剂A中加入式Ⅴ所示化合物及式Ⅵ所示化合物，于90℃加热回流11h，后经蒸馏，即得到式Ⅶ所示化合物，该过程化学反应式如下所示：
(3)在有机溶剂B中加入式Ⅶ所示化合物及对羟基苯甲醛，于95℃加热回流22h，后经蒸馏、提纯，得到
(4)将与及缩合剂一起加入到有机溶剂B中，于室温下搅拌8h，后经水洗、蒸馏，即制得R为的pH荧光探针。
需要说明的是，步骤(1)中，式Ⅱ所示化合物及式Ⅲ所示化合物反应先生成中间体式Ⅳ所示化合物，然后式Ⅳ所示化合物进一步反应生成式Ⅴ所示化合物，式Ⅳ所示化合物的化学结构式如下：
另外，步骤(3)中，提纯方法为硅胶层析法，展开剂为二氯甲烷与甲醇的混合液，该混合液中二氯甲烷与甲醇的质量比为20:1。
步骤(1)中，式Ⅱ所示化合物、式Ⅲ所示化合物及酸性溶剂的摩尔比为1:1:10，其中，酸性溶剂为冰醋酸。
步骤(2)中，式Ⅴ所示化合物、式Ⅵ所示化合物及有机溶剂A的摩尔比为1:1.2:10，其中，有机溶剂A为乙腈；
步骤(3)中，式Ⅶ所示化合物、对羟基苯甲醛及有机溶剂B的摩尔比为1:1.1:10，其中，有机溶剂B为N,N-二甲基甲酰胺。
步骤(4)中，与缩合剂的摩尔比为1:1.3:1.4，其中，缩合剂为DIC(中文名称为N,N-二异丙基碳二亚胺)/DMAP。
该荧光探针用于检测化学体系的pH值。
实施例13：
一种比率型pH荧光探针，该荧光探针的化学结构式如式Ⅰ所示：
其中，R为亚细胞器定位受体，该亚细胞器定位受体为其制备方法具体包括以下步骤：
(1)在酸性溶剂中加入式Ⅱ所示化合物及式Ⅲ所示化合物，于120℃加热回流5h，后经蒸馏，即得到式Ⅴ所示化合物，该过程化学反应式如下所示：
(2)在有机溶剂A中加入式Ⅴ所示化合物及式Ⅵ所示化合物，于80℃加热回流12h，后经蒸馏，即得到式Ⅶ所示化合物，该过程化学反应式如下所示：
(3)在有机溶剂B中加入式Ⅶ所示化合物及对羟基苯甲醛，于85℃加热回流24h，后经蒸馏、提纯，得到
(4)将与及缩合剂一起加入到有机溶剂B中，于室温下搅拌10h，后经水洗、蒸馏，即制得R为的pH荧光探针。
需要说明的是，步骤(1)中，式Ⅱ所示化合物及式Ⅲ所示化合物反应先生成中间体式Ⅳ所示化合物，然后式Ⅳ所示化合物进一步反应生成式Ⅴ所示化合物，式Ⅳ所示化合物的化学结构式如下：
另外，步骤(3)中，提纯方法为硅胶层析法，展开剂为二氯甲烷与甲醇的混合液，该混合液中二氯甲烷与甲醇的质量比为15:1。
步骤(1)中，式Ⅱ所示化合物、式Ⅲ所示化合物及酸性溶剂的摩尔比为1:1:8，其中，酸性溶剂为冰醋酸。
步骤(2)中，式Ⅴ所示化合物、式Ⅵ所示化合物及有机溶剂A的摩尔比为1:1.2:8，其中，有机溶剂A为乙腈；
步骤(3)中，式Ⅶ所示化合物、对羟基苯甲醛及有机溶剂B的摩尔比为1:1.1:8，其中，有机溶剂B为N,N-二甲基甲酰胺。
步骤(4)中，与缩合剂的摩尔比为1:1.1:1.5，其中，缩合剂为DCC(中文名称为二环己基碳二亚胺)/DMAP(中文名称为4-二甲氨基吡啶)。
该荧光探针用于检测化学体系的pH值。
实施例14：
本实施例中，步骤(4)中的缩合剂为HATU(中文名称为2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯)/NMM，其余同实施例13。
实施例15：
一种比率型pH荧光探针，该荧光探针的化学结构式如式Ⅰ所示：
其中，R为亚细胞器定位受体，该亚细胞器定位受体为其制备方法具体包括以下步骤：
(1)在酸性溶剂中加入式Ⅱ所示化合物及式Ⅲ所示化合物，于110℃加热回流6h，后经蒸馏，即得到式Ⅴ所示化合物，该过程化学反应式如下所示：
(2)在有机溶剂A中加入式Ⅴ所示化合物及式Ⅵ所示化合物，于70℃加热回流13h，后经蒸馏，即得到式Ⅶ所示化合物，该过程化学反应式如下所示：
(3)在有机溶剂B中加入式Ⅶ所示化合物及对羟基苯甲醛，于75℃加热回流26h，后经蒸馏、提纯，得到
(4)将与及缩合剂一起加入到有机溶剂B中，于室温下搅拌12h，后经水洗、蒸馏，即制得R为的pH荧光探针。
需要说明的是，步骤(1)中，式Ⅱ所示化合物及式Ⅲ所示化合物反应先生成中间体式Ⅳ所示化合物，然后式Ⅳ所示化合物进一步反应生成式Ⅴ所示化合物，式Ⅳ所示化合物的化学结构式如下：
另外，步骤(3)中，提纯方法为硅胶层析法，展开剂为二氯甲烷与甲醇的混合液，该混合液中二氯甲烷与甲醇的质量比为10:1。
步骤(1)中，式Ⅱ所示化合物、式Ⅲ所示化合物及酸性溶剂的摩尔比为1:1:9，其中，酸性溶剂为冰醋酸。
步骤(2)中，式Ⅴ所示化合物、式Ⅵ所示化合物及有机溶剂A的摩尔比为1:1.2:9，其中，有机溶剂A为乙腈；
步骤(3)中，式Ⅶ所示化合物、对羟基苯甲醛及有机溶剂B的摩尔比为1:1.1:9，其中，有机溶剂B为N,N-二甲基甲酰胺。
步骤(4)中，与缩合剂的摩尔比为1:1.2:1.8。其中，缩合剂为EDC/HOBt/NMM。
该荧光探针用于检测生物活细胞内的pH值。
实施例16：
一种比率型pH荧光探针，该荧光探针的化学结构式如式Ⅰ所示：
其中，R为亚细胞器定位受体，该亚细胞器定位受体为其制备方法具体包括以下步骤：
(1)在酸性溶剂中加入式Ⅱ所示化合物及式Ⅲ所示化合物，于130℃加热回流4h，后经蒸馏，即得到式Ⅴ所示化合物，该过程化学反应式如下所示：
(2)在有机溶剂A中加入式Ⅴ所示化合物及式Ⅵ所示化合物，于90℃加热回流11h，后经蒸馏，即得到式Ⅶ所示化合物，该过程化学反应式如下所示：
(3)在有机溶剂B中加入式Ⅶ所示化合物及对羟基苯甲醛，于95℃加热回流22h，后经蒸馏、提纯，得到
(4)将与及缩合剂一起加入到有机溶剂B中，于室温下搅拌8h，后经水洗、蒸馏，即制得R为的pH荧光探针。
需要说明的是，步骤(1)中，式Ⅱ所示化合物及式Ⅲ所示化合物反应先生成中间体式Ⅳ所示化合物，然后式Ⅳ所示化合物进一步反应生成式Ⅴ所示化合物，式Ⅳ所示化合物的化学结构式如下：
另外，步骤(3)中，提纯方法为硅胶层析法，展开剂为二氯甲烷与甲醇的混合液，该混合液中二氯甲烷与甲醇的质量比为20:1。
步骤(1)中，式Ⅱ所示化合物、式Ⅲ所示化合物及酸性溶剂的摩尔比为1:1:10，其中，酸性溶剂为冰醋酸。
步骤(2)中，式Ⅴ所示化合物、式Ⅵ所示化合物及有机溶剂A的摩尔比为1:1.2:10，其中，有机溶剂A为乙腈；
步骤(3)中，式Ⅶ所示化合物、对羟基苯甲醛及有机溶剂B的摩尔比为1:1.1:10，其中，有机溶剂B为N,N-二甲基甲酰胺。
步骤(4)中，与缩合剂的摩尔比为1:1.3:1.4，其中，缩合剂为DIC/DMAP。
该荧光探针用于检测化学体系的pH值。
实施例17：
一种比率型pH荧光探针，该荧光探针的化学结构式如式Ⅰ所示：
其中，R为亚细胞器定位受体，该亚细胞器定位受体为其制备方法具体包括以下步骤：
(1)在酸性溶剂中加入式Ⅱ所示化合物及式Ⅲ所示化合物，于120℃加热回流5h，后经蒸馏，即得到式Ⅴ所示化合物，该过程化学反应式如下所示：
(2)在有机溶剂A中加入式Ⅴ所示化合物及式Ⅵ所示化合物，于80℃加热回流12h，后经蒸馏，即得到式Ⅶ所示化合物，该过程化学反应式如下所示：
(3)在有机溶剂B中加入式Ⅶ所示化合物及对羟基苯甲醛，于85℃加热回流24h，后经蒸馏、提纯，得到
(4)将与及缩合剂一起加入到有机溶剂B中，于室温下搅拌10h，后经水洗、蒸馏，即制得R为的pH荧光探针。
需要说明的是，步骤(1)中，式Ⅱ所示化合物及式Ⅲ所示化合物反应先生成中间体式Ⅳ所示化合物，然后式Ⅳ所示化合物进一步反应生成式Ⅴ所示化合物，式Ⅳ所示化合物的化学结构式如下：
另外，步骤(3)中，提纯方法为硅胶层析法，展开剂为二氯甲烷与甲醇的混合液，该混合液中二氯甲烷与甲醇的质量比为15:1。
步骤(1)中，式Ⅱ所示化合物、式Ⅲ所示化合物及酸性溶剂的摩尔比为1:1:8，其中，酸性溶剂为冰醋酸。
步骤(2)中，式Ⅴ所示化合物、式Ⅵ所示化合物及有机溶剂A的摩尔比为1:1.2:8，其中，有机溶剂A为乙腈；
步骤(3)中，式Ⅶ所示化合物、对羟基苯甲醛及有机溶剂B的摩尔比为1:1.1:8，其中，有机溶剂B为N,N-二甲基甲酰胺。
步骤(4)中，与缩合剂的摩尔比为1:1.1:1.5，其中，缩合剂为DCC/DMAP。
该荧光探针用于检测化学体系的pH值。
实施例18：
本实施例中，步骤(4)中的缩合剂为HATU/NMM，其余同实施例17。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
Claims (12)
1.一种比率型pH荧光探针，其特征在于，该荧光探针的化学结构式如式Ⅰ所示：
其中，R为亚细胞器定位受体，该亚细胞器定位受体为 中的一种；
所述的荧光探针用于检测化学体系的pH值或生物活细胞内的pH值。
2.一种如权利要求1所述的一种比率型pH荧光探针的制备方法，其特征在于，当R为时，该方法具体包括以下步骤：
(1)在酸性溶剂中加入式Ⅱ所示化合物及式Ⅲ所示化合物，于110-130℃加热回流4-6h，后经蒸馏，即得到式Ⅴ所示化合物，该过程化学反应式如下所示：
(2)在有机溶剂A中加入式Ⅴ所示化合物及式Ⅵ所示化合物，于70-90℃加热回流11-13h，后经蒸馏，即得到式Ⅶ所示化合物，该过程化学反应式如下所示：
(3)在有机溶剂B中加入式Ⅶ所示化合物及对羟基苯甲醛，于75-95℃加热回流22-26h，后经蒸馏、提纯，即得到式Ⅰ所示化合物，即：
(4)将及缩合剂一起加入到有机溶剂B中，于室温下搅拌8-12h，后经水洗、蒸馏，即制得R为的pH荧光探针。
3.根据权利要求2所述的一种比率型pH荧光探针的制备方法，其特征在于，所述的缩合剂的摩尔比为1:1.1-1.3:1.4-1.8。
4.根据权利要求2至3任一项所述的一种比率型pH荧光探针的制备方法，其特征在于，所述的缩合剂为DCC/DMAP、DIC/DMAP、EDC/HOBt/NMM或HATU/NMM中的一种。
5.根据权利要求2至3任一项所述的一种比率型pH荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述的式Ⅱ所示化合物、式Ⅲ所示化合物及酸性溶剂的摩尔比为1:1:8-10；
步骤(2)所述的式Ⅴ所示化合物、式Ⅵ所示化合物及有机溶剂A的摩尔比为1:1.2:8-10；
步骤(3)所述的式Ⅶ所示化合物、对羟基苯甲醛及有机溶剂B的摩尔比为1:1.1:8-10。
6.根据权利要求5所述的一种比率型pH荧光探针的制备方法，其特征在于，所述的酸性溶剂为冰醋酸，所述的有机溶剂A为乙腈，所述的有机溶剂B为N,N-二甲基甲酰胺。
7.一种如权利要求1所述的一种比率型pH荧光探针的制备方法，其特征在于，当R为时，该方法具体包括以下步骤：
(1)在酸性溶剂中加入式Ⅱ所示化合物及式Ⅲ所示化合物，于110-130℃加热回流4-6h，后经蒸馏，即得到式Ⅴ所示化合物，该过程化学反应式如下所示：
(2)在有机溶剂A中加入式Ⅴ所示化合物及式Ⅵ所示化合物，于70-90℃加热回流11-13h，后经蒸馏，即得到式Ⅶ所示化合物，该过程化学反应式如下所示：
(3)在有机溶剂B中加入式Ⅶ所示化合物及对羟基苯甲醛，于75-95℃加热回流22-26h，后经蒸馏、提纯，即得到式Ⅰ所示化合物，即：
(4)将及缩合剂一起加入到有机溶剂B中，于室温下搅拌8-12h，后经水洗、蒸馏，即制得R为的pH荧光探针。
8.根据权利要求7所述的一种比率型pH荧光探针的制备方法，其特征在于，所述的缩合剂的摩尔比为1:1.1-1.3:1.4-1.8。
9.根据权利要求7至8任一项所述的一种比率型pH荧光探针的制备方法，其特征在于，所述的缩合剂为DCC/DMAP、DIC/DMAP、EDC/HOBt/NMM或HATU/NMM中的一种。
10.根据权利要求7至8任一项所述的一种比率型pH荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述的式Ⅱ所示化合物、式Ⅲ所示化合物及酸性溶剂的摩尔比为1:1:8-10；
步骤(2)所述的式Ⅴ所示化合物、式Ⅵ所示化合物及有机溶剂A的摩尔比为1:1.2:8-10；
步骤(3)所述的式Ⅶ所示化合物、对羟基苯甲醛及有机溶剂B的摩尔比为1:1.1:8-10。
11.根据权利要求10所述的一种比率型pH荧光探针的制备方法，其特征在于，所述的酸性溶剂为冰醋酸，所述的有机溶剂A为乙腈，所述的有机溶剂B为N,N-二甲基甲酰胺。
12.一种如权利要求1所述的比率型pH荧光探针的应用，其特征在于，所述的荧光探针用于检测化学体系的pH值或生物活细胞内的pH值。
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