CN106198981A - 一种基于量子点的ca199免疫层析试纸条的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于量子点的CA199免疫层析试纸条的制备方法；通过EDC(1‑乙基‑(3‑二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐)活化作用，量子点的羧基和CA199标记抗体的氨基生成牢固的化学键，探针、CA199抗原和包埋在试纸条的另一种CA199包被抗体通过抗体抗原之间的作用，形成一种类似夹心的结构，定性定量的检测肿瘤标志物CA199。本发明的特点在于：整个制备过程简单，适合于产业化生产；根据量子点的荧光特性，可定性定量检测CA199抗原，且特异性良好；整个检测过程，成本低廉且操作非常简便，适合高危人群的社区肿瘤筛选，建立了一种肿瘤检测的新方法。
Description
技术领域
本发明涉及检测探针制备技术领域，更具体的是涉及一种基于量子点的CA199免疫层析试纸条的制备方法。
背景技术
免疫层析法(immunochromatography)是近几年来国外兴起的一种快速诊断技术，其原理是将特异的抗体先固定于硝酸纤维素膜的某一区带，当该干燥的硝酸纤维素一端浸入样品(尿液或血清)后，由于毛细管作用，样品将沿着该膜向前移动，当移动至固定有抗体的区域时，样品中相应的抗原即与该抗体发生特异性结合，若用免疫胶体金或免疫酶染色可使该区域显示一定的颜色，从而实现特异性的免疫诊断。
免疫胶体金技术(Immune colloidal gold technique)是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术。胶体金是由氯金酸(HAuCl4)在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用下，聚合成为特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，称为胶体金。胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合，由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生物特性。胶体金除了与蛋白质结合以外，还可以与许多其它生物大分子结合，如SPA、PHA、ConA等。根据胶体金的一些物理性状，如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应，加上结合物的免疫和生物学特性，因而使胶体金广泛地应用于免疫学、组织学、病理学和细胞生物学等领域。但胶体金免疫层析技术存在不能严格定量这一致命缺陷，所有目前大多数学者将层析技术的目光转移到荧光检测上。作为一种新颖的半导体纳米材料，量子点具有许多独特的纳米性质，因此在免疫层析领域也独树一帜。
CA199是胰腺癌和结、直肠癌的标志物。血清CA199阳性的临界值为37kU/L。胰腺癌患者85％-95％为阳性。肿瘤切除后CA199浓度会下降，再上升，则可表示复发。结直肠癌、胆囊癌、胆管癌、肝癌和胃癌的阳性率也很高，若同时检测CEA和AFP可进一步提高阳性检测率。良性疾患时如胰腺炎和黄疸，CA199浓度也可增高，但往往呈“一过性”，而且其浓度多低于120kU/L，必须加以鉴别。肿瘤标志物可以对高危人群进行筛查，通过检测肿瘤患者治疗前后肿瘤标志物的浓度变化可以判断对肿瘤的治疗是否有效。对生物体内的肿瘤标志物实现高灵敏度的检测是生命科学领域研究的一项重要课题，发展一种新的灵敏度高的检测方法也成为研究者们努力的目标。目前量子点因具有优异的光学性质已经被广泛应用于示踪、成像以及标记等方面,而免疫层析试纸条检测则因为它的简单迅速、价格低廉、可以随时随地等优点在检测领域处于特殊重要的地位。所以本文拟研制CA199量子点免疫荧光试纸条，对CA199肿瘤标志物进行检测，建立CA199肿瘤标志物检测的新方法。
发明内容
鉴于肿瘤标志物在肿瘤检测中的重要地位、量子点这种纳米粒子独特的光学性质以及层析技术简便和价格方面的优势。我们将结合量子点和免疫层析试纸条两种技术，利用量子点羧基和肿瘤标志物相应抗体的氨基反应，制得量子点荧光探针。探针、肿瘤标志物和包埋在试纸条的另一种肿瘤标志物抗体通过抗体抗原之间的作用，形成一种类似夹心的结构。对肿瘤标志物CA199进行定性定量的检测，建立肿瘤标志物检测的新方法，致力于简单迅速、价格低廉、定性定量、操作简便的消化系统肿瘤早期诊断方法。
本发明的技术方案如下：
一种基于量子点的癌胚抗原免疫层析试纸条的制备方法；其步骤如下：
1)将量子点QDs、EDC和PBS缓冲液加入反应器，在旋转混合架上活化量子点的羧基，离心得到免疫量子点；
2)将CA199抗体和步骤1)得到的免疫量子点混合，加入PBS缓冲液，在旋转混合架上偶联抗体，离心得到QDs-CA199标记抗体荧光探针，然后用牛血清白蛋白封闭QDs-CA199标记抗体荧光探针上未反应的羧基，同时用处理液处理样品垫和结合垫并烘干，然后用上述荧光探针处理结合垫并烘干；
3)试纸条制备：将吸水垫、硝酸纤维素膜、样品垫以及结合垫组装在一起，得到CA199量子点免疫层析试纸条。
所述QDs：EDC摩尔质量分数配比为1:4000～10000。
所述QDs和CA199抗体摩尔质量份数比＝1:10～50。
所述PBS缓冲液用以充当反应溶剂和保持CA199抗体的活性。
所述偶联抗体时间优选2～3h。
所述处理液是蔗糖Sugar、牛血清白蛋白BSA、聚乙二醇PEG、聚氧乙烯山梨醇单月桂酸酯Tween-20的混合溶液。
通过EDC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐)的活化作用，量子点的羧基和CA199标记抗体Ab1(分子量150000～200000)的氨基生成牢固的化学键，离心纯化后分散在含牛血清白蛋白的PBS缓冲液中，得到QDs-Ab1的荧光探针。如图4所示，将CA199包被抗体Ab2均匀喷在硝酸纤维素膜上作为检测线T，而将羊抗鼠抗体Ab3硝酸纤维素膜上作为质控线C。将试纸条的四个部分样品垫、结合垫、吸水垫以及硝酸纤维素膜组装的一起，最后得到CA199量子点免疫层析试纸条。滴加检测样品到样品垫上，检测样品会在吸水垫的层析作用下向前移动：如果检测样品有Ag(CA199抗原)存在，探针QDs-Ab1、CA199和包埋在硝酸纤维素膜上的CA199包被抗体Ab2通过抗体抗原之间的作用，在T线上形成一种类似夹心的结构QDs-Ab1-Ag-Ab2，而在C线上形成QDs-Ab1-Ab3的结构，此时T线和C线同时亮；如果检测样品没有Ag存在，则探针QDs-Ab1仅仅和包埋在硝酸纤维素膜上的羊抗鼠抗体，形成QDs-Ab1-Ab3的结构，此时C线亮而T线不亮。
如图1量子点改性前后电镜照片显示，量子点分散均一，适合偶联抗体完成免疫实验；如图2所示通过自主研发的量子点免疫荧光检测仪，分别检测各个试纸条检测线和质控线上量子点的荧光强度，选择二者的比值作为参数进行比较，发现CA199组T/C可以达到1.1，而其余几组T/C均低于0.2，可以看出量子点免疫荧光试纸条的非特异性吸附很低，可以忽略，这也表明这种试纸条可以用于检测。以CA199的浓度作为横坐标，以对应的每个浓度下检测到的T/C的值作为为纵坐标时，可以拟合出一条呈多项式的标准曲线，如图3所示，R2＝0.9914y＝0.04188+0.0168x-1.721*10-4x2+6.82*10-7x3。
本发明制备的新型基于量子点的免疫层析试纸条优势在于：
1.采用量子点这种具有优异的光学性质，已经被广泛应用于示踪、成像以及标记等方面的纳米材料作为探针荧光来源，将纳米技术应用到肿瘤检测领域。
2.采用免疫层析技术作为检测用的基材，免疫层析技术因为它的简单迅速、价格低廉、可以随时随地等优点在检测领域处于特殊重要的地位。
3.采用量子点的羧基和抗体的氨基之间的反应形成的牢固的化学键，而非传统的静电吸附作用，提高了试纸条抵抗非特异性吸附的能力，量子点荧光强度和CA199抗原浓度之间的线性关系可同时实现定性定量检测。
附图说明
图1本发明制备的基于量子点的CA199试纸条的量子点透射电镜照片，(a)为改性前量子点透射电镜照片；(b)为改性后量子点透射电镜照片。
图2本发明制备的基于量子点的CA199试纸条的特异性实验结果，(a)为CA199试纸条特异性实验图谱；(b)为CA199试纸条特异性实验紫外灯照片。
图3本发明制备的基于量子点的CA199试纸条的灵敏度测试，(a)为CA199试纸条标准曲线；(b)为CA199试纸条标准曲线紫外灯照片。
图4本发明制备的基于量子点的CA199试纸条的检测示意图。
具体实施方式
下面的实施案例中将对本发明作进一步的阐述，但本发明不限于此。
实施案例1：
1)将质量分数配比为1：4000的量子点QDs和EDC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐)加入反应器，加入PBS缓冲液，在旋转混合架上活化量子点的羧基，离心得到免疫量子点；
2)将CA199标记抗体和上述免疫量子点混合(量子点和CA199标记抗体质量分数配比为1：10)，加入PBS缓冲液，在旋转混合架上偶联抗体2h，离心得到QDs-CA199标记抗体荧光探针，然后用牛血清白蛋白(BSA)封闭量QDs-CA199标记抗体荧光探针上未反应的羧基，同时用处理液(0.05g/mL Sugar、0.03g/mL BSA、0.01g/mL PEG和20uL/mL Tween-20的PBS缓冲液)处理样品垫和结合垫并烘干，然后用上述荧光探针处理结合垫并烘干；
3)试纸条制备：将吸水垫、硝酸纤维素膜、样品垫以及结合垫组装在一起，得到CA199量子点免疫层析试纸条。在10个试纸条的样品垫分别滴加浓度为1.56kU/L、3.125kU/L、6.25kU/L、12.5kU/L、20kU/L、25kU/L、50kU/L、75kU/L、100kU/L和150kU/L的CA199抗原。
以CA199的浓度作为横坐标，以对应的每个浓度下检测到的T/C的值作为为纵坐标时，可以拟合出一条呈多项式的标准曲线，如图3所示，R2＝0.9914y＝0.04188+0.0168x-1.721*10-4x2+6.82*10-7x3。
实施案例2：
1)将质量分数配比为1：4000的量子点QDs和EDC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐)加入反应器，加入PBS缓冲液，在旋转混合架上活化量子点的羧基，离心得到免疫量子点；
2)将CA199标记抗体和上述免疫量子点混合(量子点和CA199标记抗体质量分数配比为1：30)，加入PBS缓冲液，在旋转混合架上偶联抗体2h，离心得到QDs-CA199标记抗体荧光探针，然后用牛血清白蛋白(BSA)封闭量QDs-CA199标记抗体荧光探针上未反应的羧基，同时用处理液(0.05g/mL Sugar、0.03g/mL BSA、0.01g/mL PEG和20uL/mL Tween-20的PBS缓冲液)处理样品垫和结合垫并烘干，然后用上述荧光探针处理结合垫并烘干；
3)试纸条制备：将吸水垫、硝酸纤维素膜、样品垫以及结合垫组装在一起，得到CA199量子点免疫层析试纸条。在8个试纸条的样品垫分别滴加浓度为150kU/L的PSA、CEA、BSA、CA125、CA153、HCG、AFP和CA199抗原。
通过自主研发的量子点免疫荧光检测仪，分别检测各个试纸条检测线和质控线上量子点的荧光强度，选择二者的比值作为参数进行比较，如图2所示，发现CA199组T/C可以达到1.1，而其余几组T/C均低于0.2，可以看出量子点免疫荧光试纸条的非特异性吸附很低，可以忽略，这也表明这种CA199量子点试纸条可以用于检测。
实施案例3：
1)将质量分数配比为1：4000的量子点QDs和EDC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐)加入反应器，加入PBS缓冲液，在旋转混合架上活化量子点的羧基，离心得到免疫量子点；
2)将CA199标记抗体和上述免疫量子点混合(量子点和CA199标记抗体质量分数配比为1：50)，加入PBS缓冲液，在旋转混合架上偶联抗体2h，离心得到QDs-CA199标记抗体荧光探针，然后用牛血清白蛋白(BSA)封闭量QDs-CA199标记抗体荧光探针上未反应的羧基，同时用处理液(0.05g/mL Sugar、0.03g/mL BSA、0.01g/mL PEG和20uL/mL Tween-20的PBS缓冲液)处理样品垫和结合垫并烘干，然后用上述荧光探针处理结合垫并烘干；
3)试纸条制备：将吸水垫、硝酸纤维素膜、样品垫以及结合垫组装在一起，得到CA199量子点免疫层析试纸条。
实施案例4：
1)将质量分数配比为1：6000的量子点QDs和EDC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐)加入反应器，加入PBS缓冲液，在旋转混合架上活化量子点的羧基，离心得到免疫量子点；
2)将CA199标记抗体和上述免疫量子点混合(量子点和CA199标记抗体质量分数配比为1：10)，加入PBS缓冲液，在旋转混合架上偶联抗体2h，离心得到QDs-CA199标记抗体荧光探针，然后用牛血清白蛋白(BSA)封闭量QDs-CA199标记抗体荧光探针上未反应的羧基，同时用处理液(0.05g/mL Sugar、0.03g/mL BSA、0.01g/mL PEG和20uL/mL Tween-20的PBS缓冲液)处理样品垫和结合垫并烘干，然后用上述荧光探针处理结合垫并烘干；
3)试纸条制备：将吸水垫、硝酸纤维素膜、样品垫以及结合垫组装在一起，得到CA199量子点免疫层析试纸条。
实施案例5：
1)将质量分数配比为1：8000的量子点QDs和EDC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐)加入反应器，加入PBS缓冲液，在旋转混合架上活化量子点的羧基，离心得到免疫量子点；
2)将CA199标记抗体和上述免疫量子点混合(量子点和CA199标记抗体质量分数配比为1：10)，加入PBS缓冲液，在旋转混合架上偶联抗体2h，离心得到QDs-CA199标记抗体荧光探针，然后用牛血清白蛋白(BSA)封闭量QDs-CA199标记抗体荧光探针上未反应的羧基，同时用处理液(0.05g/mL Sugar、0.03g/mL BSA、0.01g/mL PEG和20uL/mL Tween-20的PBS缓冲液)处理样品垫和结合垫并烘干，然后用上述荧光探针处理结合垫并烘干；
3)试纸条制备：将吸水垫、硝酸纤维素膜、样品垫以及结合垫组装在一起，得到CA199量子点免疫层析试纸条。
实施案例6：
1)将质量分数配比为1：10000的量子点QDs和EDC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐)加入反应器，加入PBS缓冲液，在旋转混合架上活化量子点的羧基，离心得到免疫量子点；
2)将CA199标记抗体和上述免疫量子点混合(量子点和CA199标记抗体质量分数配比为1：10)，加入PBS缓冲液，在旋转混合架上偶联抗体2h，离心得到QDs-CA199标记抗体荧光探针，然后用牛血清白蛋白(BSA)封闭量QDs-CA199标记抗体荧光探针上未反应的羧基，同时用处理液(0.05g/mL Sugar、0.03g/mL BSA、0.01g/mL PEG和20uL/mL Tween-20的PBS缓冲液)处理样品垫和结合垫并烘干，然后用上述荧光探针处理结合垫并烘干；
3)试纸条制备：将吸水垫、硝酸纤维素膜、样品垫以及结合垫组装在一起，得到CA199量子点免疫层析试纸条。
实施案例7：
1)将质量分数配比为1：4000的量子点QDs和EDC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐)加入反应器，加入PBS缓冲液，在旋转混合架上活化量子点的羧基，离心得到免疫量子点；
2)将CA199标记抗体和上述免疫量子点混合(量子点和CA199标记抗体质量分数配比为1：10)，加入PBS缓冲液，在旋转混合架上偶联抗体2.5h，离心得到QDs-CA199标记抗体荧光探针，然后用牛血清白蛋白(BSA)封闭量QDs-CA199标记抗体荧光探针上未反应的羧基，同时用处理液(0.05g/mL Sugar、0.03g/mL BSA、0.01g/mL PEG和20uL/mL Tween-20的PBS缓冲液)处理样品垫和结合垫并烘干，然后用上述荧光探针处理结合垫并烘干；
3)试纸条制备：将吸水垫、硝酸纤维素膜、样品垫以及结合垫组装在一起，得到CA199量子点免疫层析试纸条。
实施案例8：
1)将质量分数配比为1：4000的量子点QDs和EDC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐)加入反应器，加入PBS缓冲液，在旋转混合架上活化量子点的羧基，离心得到免疫量子点；
2)将CA199标记抗体和上述免疫量子点混合(量子点和CA199标记抗体质量分数配比为1：10)，加入PBS缓冲液，在旋转混合架上偶联抗体3h，离心得到QDs-CA199标记抗体荧光探针，然后用牛血清白蛋白(BSA)封闭量QDs-CA199标记抗体荧光探针上未反应的羧基，同时用处理液(0.05g/mL Sugar、0.03g/mL BSA、0.01g/mL PEG和20uL/mL Tween-20的PBS缓冲液)处理样品垫和结合垫并烘干，然后用上述荧光探针处理结合垫并烘干；
3)试纸条制备：将吸水垫、硝酸纤维素膜、样品垫以及结合垫组装在一起，得到CA199量子点免疫层析试纸条。
Claims (5)
1.一种基于量子点的CA199免疫层析试纸条的制备方法；其特征是步骤如下：
1)将量子点QDs、EDC和PBS缓冲液加入反应器，在旋转混合架上活化量子点的羧基，离心得到免疫量子点；
2)将CA199抗体和步骤1)得到的免疫量子点混合，加入PBS缓冲液，在旋转混合架上偶联抗体，离心得到QDs-CA199标记抗体荧光探针，然后用牛血清白蛋白封闭QDs-CA199标记抗体荧光探针上未反应的羧基，同时用处理液处理样品垫和结合垫并烘干，然后用上述荧光探针处理结合垫并烘干；
3)试纸条制备：将吸水垫、硝酸纤维素膜、样品垫以及结合垫组装在一起，得到CA199量子点免疫层析试纸条。
2.如权利要求1所述的方法，其特征是QDs：EDC摩尔质量份数配比为1:4000～10000。
3.如权利要求1所述的方法，其特征是QDs：CA199抗体摩尔质量分数比＝1:10～50。
4.如权利要求1所述的方法，其特征是所述处理液是蔗糖、牛血清白蛋白、聚乙二醇和聚氧乙烯山梨醇单月桂酸酯的混合溶液。
5.如权利要求1所述的方法，其特征是偶联抗体2～3h。
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