CN110018145A - 一种腹泻性贝毒大田软海绵酸荧光检测试纸及其检测方法 - Google Patents

一种腹泻性贝毒大田软海绵酸荧光检测试纸及其检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于食品安全免疫学检测技术领域，具体涉及一种腹泻性贝毒大田软海绵酸荧光检测试纸及其检测方法。所述试纸包括底板，所述底板上从左到右依次固接有加样垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述硝酸纤维素膜上从左到右依次设置有检测带和参照带；所述检测带由大田软海绵酸‑蛋白质偶联复合物喷射在所述硝酸纤维素膜上干燥后形成；所述参照带由抗小鼠二抗喷射在所述硝酸纤维素膜上，干燥后形成。本发明提供的试纸及检测方法能快速、灵敏地检测出海产样品中的大田软海绵酸的含量水平，适用于大量样本毒素的安全筛查，从而为海产品食用安全提供快速检测试剂。

Description

一种腹泻性贝毒大田软海绵酸荧光检测试纸及其检测方法
技术领域
本发明属于食品安全免疫学检测技术领域，具体涉及一种腹泻性贝毒大田软海绵酸荧光检测试纸及其检测方法。
背景技术
大田软海绵酸(Okadaic acid,OA)，是海洋腹泻性贝毒(Diarrhetic ShellfishPoisoning，DSP)的主要致病因子，由有毒赤潮鳍藻属和原甲藻属的一些藻类产生，属于一类脂溶性多环醚类有毒生物活性物质，可通过食物链在贝、螺、蛤等海洋滤食性生物体内富集，使毒性放大，毒素性质非常稳定，一般蒸、煮、炒等加工处理不能将其破坏，由误食有毒海产品而引发中毒的事件时有发生，毒素对机体具有致癌、致畸、致突变等毒性作用。已证实OA是蛋白磷酸酶的强烈抑制剂，可与细胞膜上蛋白磷酸酶(PP2A)结合，具有强烈的促肿瘤和致癌作用。常见的急性中毒症状包括绞痛，寒颤，恶心，呕吐，腹泻，易与细菌性胃肠炎混淆。虽尚未见人类因OA中毒而致死的报道，但在所有海洋毒素中，腹泻性贝毒在全球沿岸海域均有分布，因其分布范围最广，发病率最高，且中毒后无特效药救治，成为世界范围内对人类健康具有最严重威胁的赤潮藻毒素之一。
近年来，中国部分海域的腹泻性贝类毒素调查显示，部分可食用的贝、螺类等已经受到了腹泻性贝毒不同程度的污染，如辽东湾、莱州湾、舟山、大连、岱山、象山、台州、北海、湛江、海口等地的海产品均检出不同污染水平的OA及其它DSP毒素，尤其是在夏秋季节，污染普遍，而且很多种类毒素含量超出国家食用标准。有关腹泻性贝毒中毒事件也时有报道，2011年上半年中国东海宁德发生过食用紫贻贝引起腹泻性贝毒中毒事件，2012年上半年辽宁辽宁省个别地区再次出现食用织纹螺中毒事件，且同年7月，温州发生21起因食用织纹螺引起的食物中毒事件死亡1例。可见腹泻性贝毒引起的食源性污染需引起卫生部门的注意。预防中毒的关键主要是保证食品安全，开展其快速检测对人们的生命安全至关重要。
目前，国家质检行业采用的方法主要为小鼠生物法、化学仪器法，小鼠生物法因周期长，个体差异大，不可重复等弊端，且因动物福利的逐步提升而逐渐受到动物保护组织的反对，限制了方法的实际应用；化学仪器方法主要是HPLC，HPLC-MS等，所需仪器设备昂贵，对操作人员要求高，不便于基层推广使用。
发明内容
本发明的目的是提供一种腹泻性贝毒大田软海绵酸荧光检测试纸及其检测方法，能快速、灵敏地检测出海产样品中的大田软海绵酸的含量水平，适用于大量样本毒素的安全筛查，从而为贝类海产品食用安全提供快速检测试剂。
本发明提供的一种腹泻性贝毒大田软海绵酸荧光检测试纸，包括底板，所述底板上从左到右依次固接有加样垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述加样垫靠近所述硝酸纤维素膜的一端叠加且固接在所述硝酸纤维素膜一端上，所述吸水垫靠近所述硝酸纤维素膜的一端叠加且固接在所述硝酸纤维素膜的另一端上，所述硝酸纤维素膜上从左到右依次设置有检测带和参照带；
所述检测带由大田软海绵酸-蛋白质偶联复合物喷射在所述硝酸纤维素膜上，干燥后形成；所述参照带由抗小鼠二抗喷射在所述硝酸纤维素膜上，干燥后形成；
所述大田软海绵酸-蛋白质偶联复合物是将大田软海绵酸与蛋白质偶联后得到的，所述蛋白质为人免疫球蛋白hIgG或牛血清白蛋白BSA。
优选地，所述的腹泻性贝毒大田软海绵酸荧光检测试纸，干燥温度为10-37℃。
优选地，所述的腹泻性贝毒大田软海绵酸荧光检测试纸，所述检测带5由大田软海绵酸-蛋白质偶联复合物喷射在所述硝酸纤维素膜3上，干燥后形成，其中大田软海绵酸-蛋白质偶联复合物浓度为0.4mg/mL，按1μL/cm的量划膜；所述参照带6由抗小鼠二抗喷射在所述硝酸纤维素膜3上，干燥后形成，其中抗小鼠二抗浓度为0.4mg/mL，按1μL/cm的量划膜。
优选地，所述的腹泻性贝毒大田软海绵酸荧光检测试纸，所述大田软海绵酸-蛋白质偶联复合物的制备方法如下：
步骤(1)，将大田软海绵酸溶于N-二甲基甲酰胺中，加入预先配置好的0.1mg/μLN-羟基琥珀酰亚胺溶液及N，N-二环已基碳二亚胺溶液，加入ddH2O，旋涡震荡混匀；大田软海绵酸、N-二甲基甲酰胺、N-羟基琥珀酰亚胺、N，N-二环已基碳二亚胺、ddH2O的比例为1mg：50μL：1.55μL：2.85μL：45.6μL；
步骤(2)，室温25-28℃震荡孵育2-2.5h；
步骤(3)，将步骤(2)孵育好的混合液逐滴加入到等体积蛋白溶液中，所述蛋白溶液为人免疫球蛋白hIgG或牛血清白蛋白BSA溶于0.1M NaHCO3溶液中制备得到的；
步骤(4)，室温25-28℃震荡孵育2-2.5h，得到偶联物；
步骤(5)，用30kDa的离心超滤管超滤离心步骤(4)得到的偶联物，收集滤液，得到含有偶联复合物的溶液；将偶联复合物溶液用0.01M pH7.4PBS溶解，得到OA-蛋白质偶联复合物；采用人免疫球蛋白hIgG制备的OA-蛋白质偶联复合物命名为OA-hIgG，采用BSA制备的OA-蛋白质偶联复合物命名为OA-BSA；
或者，将步骤(4)得到的偶联物用截留分子量为10000的透析带在0.01M pH7.4PBS缓冲液透析24-48h，收集透析袋内透析产物，离心去除不溶性杂质，所得上清液中加入0.01M pH7.4PBS，得到OA-蛋白质偶联复合物。
优选地，所述的腹泻性贝毒大田软海绵酸荧光检测试纸，步骤(5)中，含有偶联复合物的溶液或者上清液用0.01M pH7.4PBS溶解后，按加入蛋白的理论浓度计算使偶联复合物浓度为1mg/mL，最终得到OA-蛋白质偶联复合物。
本发明还提供了一种利用所述的腹泻性贝毒大田软海绵酸荧光检测试纸检测样品的方法，包括如下步骤：
C1，准备检测样品：将海产品洗净后剪碎，取1g剪碎的样品加1mL提取液匀浆，称重取五分之一份匀浆后的样品，加200μL提取液混匀，超声浸提并离心后，取上清液用0.01MpH7.4PB缓冲液4倍稀释，得到检测样品；当海产品带壳时，则将海产品洗净去壳后再剪碎；
C2，上样分析：将C1中检测样品40μL与38μL上样缓冲液和2μL OA特异性抗体标记量子点荧光探针混匀，反应10-15min，将反应液滴加到腹泻性贝毒大田软海绵酸荧光检测试纸的加样垫2上，层析20-30min后用蓝光检测仪观察分析，根据检测带5和参照带6荧光强度判断检测结果；检测带5为T线，参照带6为C线；
C3，结果判断：当C线、T线均出现两条荧光条带，且条带荧光强度接近，则检测试纸检测的样品毒素含量低于5ng/mL；当C线出现荧光条带，T线没有荧光条带，反应试纸条检测的样品毒素含量高于20ng/mL；当C线出现荧光条带，T线出现较弱的荧光条带，反应试纸条检测的样品毒素含量在5-20ng/mL之间；当C线不显荧光条带，无论T线是否有条带，其结果均无效。
优选地，所述的方法，所述海产品为带壳的贝类海产品。
优选地，所述的方法，C1中的检测样品是通过如下预处理步骤所得：
将采集的样品洗净去壳，剪碎，将剪碎的样品与提取液按照1g:1mL的比例混合并匀浆，称重取五分之一份匀浆后的样品，加提取液混匀5min，超声浸提5min，10000rpm离心10min，将上清液用pH7.4PB缓冲液稀释后备用；所述提取液为甲醇与水按照80:20的体积比例混合而成的。
优选地，所述的方法，所述上样缓冲液配方如下：溶质为0.4g/100mL PEG20 000、4.0g/100mL BSA、5.0g/100mL蔗糖、0.1g/100mL Tween-20，溶剂为0.01M pH7.4的PB。
优选地，所述的方法，C2中的OA特异性抗体标记量子点荧光探针制备方法如下：将制备的OA-hIgG作为免疫原，通过常规杂交瘤技术，制备与纯化得到OA特异性抗体，然后采用常规EDC二步法将OA特异性抗体与量子点荧光微球结合，得到OA特异性抗体标记量子点荧光探针。
与现有技术相比，本发明提供的腹泻性贝毒大田软海绵酸荧光检测试纸及其检测方法至少具有以下有益效果：
本发明运用免疫层析原理，研究开发一种基于OA特异性抗体标记的荧光量子点微球为检测探针的荧光检测试纸，利用样品中待检的靶标物质(大田软海绵酸)与T线固定的抗原偶合物竞争结合靶标特异性抗体的竞争模式，设计建立一种快速检测试剂，可快速特异地检测贝、螺、蛤等海产样品中的大田软海绵酸。根据检测卡上检测线(T线)和质控线(C线)上荧光条带的有无或荧光强度来判定样品中大田软海绵酸的含量。该方法操作简单快速、不需要复杂的仪器设备，适合样品批量快速筛检。
附图说明
图1是腹泻性贝毒大田软海绵酸荧光检测试纸的结构示意图；
图2是大田软海绵酸的结构图；
图3是实施例5不同浓度大田软海绵酸标准品的试纸测试图；
图4是实施例5腹泻性贝毒大田软海绵酸荧光检测试纸四个月内稳定性测试图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件操作，未注明的试验材料来源均为市售，由于不涉及发明点，故不对其步骤进行详细描述。
实施例1
一种腹泻性贝毒大田软海绵酸荧光检测试纸，如图1所示，包括PVC底板1，所述底板1上从左到右依次固接有加样垫2、硝酸纤维素膜3和吸水垫4，所述加样垫2靠近所述硝酸纤维素膜3的一端叠加且固接在所述硝酸纤维素膜3一端上，所述吸水垫4靠近所述硝酸纤维素膜3的一端叠加固接在所述硝酸纤维素膜3的另一端上，所述硝酸纤维素膜3上从左到右依次设置有检测带5和参照带6；需要说明的是，本发明中所述的“左、右”方位，与图1中所示“左、右”方位相同；
所述检测带5由大田软海绵酸-蛋白质偶联复合物(OA-蛋白质偶联复合物)喷射在所述硝酸纤维素膜3上，10℃、20℃或者37℃下干燥40min后形成；所述参照带6由羊抗小鼠二抗喷射在所述硝酸纤维素膜3上，10℃、20℃或者37℃下干燥40min后形成；
所述OA-蛋白质偶联复合物通过采用活泼酯法获得，操作方法如下：
步骤(1)，将1mg OA溶于50μL N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，加入预先配置好的1.55μL N-羟基琥珀酰亚胺溶液(NHS)及2.85μL N，N-二环已基碳二亚胺溶液(DCC)，ddH2O补足总体积100μL，旋涡震荡5min混匀；其中，NHS浓度为0.1mg/μL、所用体积为1.55μL；DCC浓度为0.1mg/μL、所用体积为2.85μL；
OA的结构如图2所示；
步骤(2)，室温25-28℃震荡孵育2h；
步骤(3)，取4mg蛋白溶液，将步骤(2)孵育好的混合液逐滴缓慢加入到等体积蛋白溶液中，边加边混匀。所述蛋白溶液为人免疫球蛋白hIgG或牛血清白蛋白BSA溶于0.1MNaHCO3溶液中制备得到的；
步骤(4)，室温25-28℃震荡孵育2h，得到偶联物；
步骤(5)，用30kDa的离心超滤管超滤离心步骤(4)得到的偶联物，以去除未反应的物质，收集滤液，得到含有偶联复合物的溶液；将含有偶联复合物的溶液用0.01M pH7.4PBS溶解，按加入蛋白的理论浓度计算使偶联复合物浓度为1mg/mL，得到OA-蛋白质偶联复合物，采用人免疫球蛋白hIgG制备的OA-蛋白质偶联复合物命名为OA-hIgG，采用BSA制备的OA-蛋白质偶联复合物命名为OA-BSA，-20℃保存备用。本实施例中加入的蛋白溶液为4mg，故用PBS溶解后的体积为4mL。
或者，将步骤(4)得到的偶联物用截留分子量为10000的透析带在0.01M pH7.4PBS缓冲液透析24-48h，收集透析袋内透析产物，离心去除不溶性杂质，所得上清液用0.01MpH7.4PBS调节浓度，按加入蛋白的理论浓度计算使偶联复合物浓度为1mg/mL，得到OA-蛋白质偶联复合物，分装，-20℃保存备用。
实施例2
一种利用上述腹泻性贝毒大田软海绵酸荧光检测试纸检测样品的方法，包括如下步骤：
C1，准备检测样品：将海产品洗净后，剪碎，取1g剪碎的样品加1mL提取液匀浆，称重取五分之一份匀浆后的样品，加200μL提取液混匀，超声浸提并离心后，取上清液用0.01MpH7.4PB缓冲液4倍稀释，得到检测样品；当海产品带壳时，则将海产品洗净去壳后再剪碎；
以贝类海产品为例，C1中的检测样品是通过如下预处理步骤所得：
将采集的贝类海产品样品洗净去壳，大体型取肉和内脏，小体型取多个样品混合，剪碎，取1g剪碎的样品加1mL提取液高速匀浆。称重取五分之一份匀浆后的样品，加200μL提取液漩涡震荡混匀5min，超声浸提5min，10000rpm离心10min，将上清液用0.01M pH7.4PB缓冲液4倍稀释后备用。
所述提取液为甲醇与水按照80:20的体积比例混合而成的。
C2，上样分析：将C1中检测样品40μL与38μL上样缓冲液(溶质为0.4g/100mL PEG20 000、4.0g/100mL BSA、5.0g/100mL蔗糖、0.1g/100mL Tween-20，溶剂为0.01M pH7.4的PB)和2μLOA特异性抗体标记量子点荧光探针混匀反应10min，将反应液滴加到腹泻性贝毒大田软海绵酸荧光检测试纸的加样垫2上，层析20min后用蓝光检测仪观察分析，根据检测带5(T线)和参照带6(C线)荧光强度判断检测结果；
C2中的OA特异性抗体标记量子点荧光探针是将实施例1制备的OA与人免疫球蛋白的偶联物OA-hIgG作为免疫原，通过常规杂交瘤技术，制备与纯化得到OA特异性抗体(具体参见论文Production of monoclonal antibody and application in indirectcompetitive ELISA for detecting okadaic acid and dinophytoxin-1in seafood[J].Environmental Science and Pollution Research,2012,19:2619-2626)，然后采用常规EDC二步法将OA特异性抗体与量子点荧光微球(QDNBs，上海昆道生物科技有限公司市售)结合，结合步骤按照QDNBs说明书进行，如下：
(a)取QDNBs悬浮液约1mg，分散于400μL反应缓冲液中，12000-15000rpm离心10-30min，去上清后，将QDNBs超声(超声功率10-20％，约10s)分散在500μL反应缓冲液中。
(b)加入10mM偶联剂EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)100-50μL，室温25-37℃混匀孵育0.5-1h。
(c)12000-15000rpm离心10-30min，去除过量偶联剂等，然后超声分散于500μL反应缓冲液中。
(d)加入100μg OA特异性抗体，室温25-37℃混匀孵育0.5-1h。
(e)12000-15000rpm离心3-30min，去除游离的抗体等。
(f)加封闭液500μL，超声分散，室温25-37℃混匀孵育0.5-1h。
(g)离心，去除封闭液，沉淀物分散在1mL的保存液中待用。
C3，结果判断：当C线、T线均出现两条荧光条带，且条带荧光强度接近，则检测试纸检测的样品毒素含量低于5ng/mL，也就是原始检测样品毒素含量低于4μg/Kg，样品符合国家安全标准；当C线出现荧光条带，T线没有荧光条带，反应试纸条检测的样品毒素含量高于20ng/mL，也就是原始检测样品毒素含量高于160μg/Kg，与FDA，欧盟等国家标准一致，此时表明该样品毒素含量超过国家标准，不得食用；当C线出现荧光条带，T线出现较弱的荧光条带，反应试纸条检测的样品毒素含量在5-20ng/mL之间，也就是原始检测样品毒素含量在40-160μg/Kg之间，虽低于国家的检测标准，但表明样品已被低浓度的毒素染污，慎食，少食；当C线不显荧光条带，无论T线是否有条带，其结果均无效。
需要说明的是，OA特异性抗体与量子点荧光微球结合时使用的封闭液、反应缓冲液、保存液等实际均是按照量子点荧光微球产品说明书中记载的试剂配方使用，属于常规试剂。
本实施例2中对海产样品青柳蛤、栉孔扇贝、东风螺、菲律宾蛤仔、牡蛎、血蛤、毛蚶、扁玉螺等每种约5-10个个体共68个样品，经ELISA检测出大田软海绵酸含量值后再进行试纸分析，结果显示18个样品未检测到大田软海绵酸，37个样品大田软海绵酸含量＜20ng/mL，低于国家安全标准，11个样品大田软海绵酸含量≥20ng/mL，超出国家食用安全标准，2个样品结果无效。试纸分析结果与ELISA检测结果复合率高达97.06％。
本发明的腹泻性贝毒大田软海绵酸荧光检测试纸的检测原理如下：
主要是基于竞争法，运用层析原理，将大田软海绵酸-蛋白质偶联复合物固定在硝酸纤维素膜上作为检测线T，羊抗小鼠二抗固定在硝酸纤维素膜上作为质控线C，以OA特异性抗体标记量子点荧光探针作为指示剂，当待检测的样品与靶标特异性抗体指示剂反应液共同孵育后加入上样孔向硝酸纤维素膜流动，如果样品中不含有待检靶标，特异性的抗体指示剂层析到T线时会与固定的抗原偶联物结合而被滞留在T线，使得T线在荧光或紫外照射下显示荧光带，此时检测结果为阴性，如果样品中含有待检靶标，特异性的抗体指示剂与待检物结合，层析至T线时与硝酸纤维素膜上T线固定的抗原偶联物结合的指示剂被滞留的量就少或无，进而出现弱带或无带现象，此时检测结果为阳性，不管样品中是否含有待检物质，特异性的抗体指示剂层析到C线时都会与固定的二抗结合而被滞留在C线上形成质控带。
实施例3T线、C线最佳划膜浓度选择
分别将T线的OA-蛋白质偶联复合物，C线的羊抗小鼠二抗稀释成0.2mg/mL、0.4mg/mL、0.6mg/mL、0.8mg/mL四个浓度水平；然后按1μL/cm的量喷射划膜，按照图1所示结构组装试纸条，上样后，在蓝光仪下眼观荧光条带，T线、C线划膜浓度选择0.4mg/mL时效果最好。
实施例4腹泻性贝毒大田软海绵酸荧光检测试纸最佳材料选择
选择上海捷宁公司的试纸条套装提供的poll 90，poll 170，Sartorius CN 95，sartorius140四种硝酸纤维素膜；G-2，G-4及Biotech的SB06三种加样垫；H-1、H-2、H-7、H-8四种吸水垫，分别划线喷膜，按照图1结构组装试纸，上样后，在蓝光仪下眼观结果，结果使用Sartorius CN 95硝酸纤维素膜，SB06作为样品垫，H3吸水纸组装的试纸条，且层析反应20min后，在蓝光仪下眼观效果最好。
实施例5腹泻性贝毒大田软海绵酸荧光检测试纸上样缓冲液选择
以PEG 20 000、BSA、蔗糖、Tween-20为溶质，以0.01M pH7.4的PB为溶剂配置基础上样缓冲液。先以蔗糖浓度为变量，分别配置2.5g/100mL、3.0g/100mL、4.0g/100mL、5.0g/100mL四种蔗糖浓度的上样缓冲液；然后以Tween-20为变量，分别配置0.05g/100mL、0.10g/100mL、0.20g/100mL三种Tween-20浓度的上样缓冲液。按照图1结构组装试纸，利用上样缓冲液上样后在蓝光仪下眼观结果，选择最佳上样缓冲液。结果上样缓冲液配方组成为溶质为0.4g/100mL PEG 20 000、4.0g/100mL BSA、5.0g/100mL蔗糖、0.1g/100mL Tween-20，溶剂为0.01M pH7.4的PB，试纸条层析效果最好。实施例5腹泻性贝毒大田软海绵酸荧光检测试纸性能测定：
用0.01M pH7.4PB缓冲液分别配置浓度为0ng/mL、10ng/mL、20ng/mL的大田软海绵酸标准品溶液，分别用准品溶液代替检测样品进行检测，步骤同实施例2一致，20min后观察T线和C线的荧光显色情况。最终确定检测带5的最低检测浓度为20ng/mL。选取三个浓度重复10次平行实验，试纸条重复性良好，由于10次平行试验结果一致，为方便拍照和比较，我们图3中每个浓度只拍摄了3个平行测试结果，检测指标不发生偏差。
为了测试试纸的稳定性，我们0.01M pH7.4PB缓冲液作为阴性对照(将实施例2的检测样品替换为等体积的PB缓冲液)，参照实施例2的方法，并利用4℃及25℃下保存四个月内的试纸进行测试，4℃及25℃下保存1、2、3、4个月内结果如图4所示，T线和C线明显可见，结果显示试纸性能稳定测试结果良好。
需要说明的是，本发明中涉及数值范围时，应理解为每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用，由于采用的步骤方法与实施例相同，为了防止赘述，本发明描述了优选的实施例。尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例做出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (10)

1.一种腹泻性贝毒大田软海绵酸荧光检测试纸，其特征在于，包括底板(1)，所述底板(1)上从左到右依次固接有加样垫(2)、硝酸纤维素膜(3)和吸水垫(4)，所述加样垫(2)靠近所述硝酸纤维素膜(3)的一端叠加且固接在所述硝酸纤维素膜(3)一端上，所述吸水垫(4)靠近所述硝酸纤维素膜(3)的一端叠加且固接在所述硝酸纤维素膜(3)的另一端上，所述硝酸纤维素膜(3)上从左到右依次设置有检测带(5)和参照带(6)；
所述检测带(5)由大田软海绵酸-蛋白质偶联复合物喷射在所述硝酸纤维素膜(3)上，干燥后形成；所述参照带(6)由抗小鼠二抗喷射在所述硝酸纤维素膜(3)上，干燥后形成；
所述大田软海绵酸-蛋白质偶联复合物是将大田软海绵酸与蛋白质偶联后得到的，所述蛋白质为人免疫球蛋白hIgG或牛血清白蛋白BSA。
2.根据权利要求1所述的腹泻性贝毒大田软海绵酸荧光检测试纸，其特征在于，干燥温度为10-37℃。
3.根据权利要求1所述的腹泻性贝毒大田软海绵酸荧光检测试纸，其特征在于，所述检测带(5)由大田软海绵酸-蛋白质偶联复合物喷射在所述硝酸纤维素膜(3)上，干燥后形成，其中大田软海绵酸-蛋白质偶联复合物浓度为0.4mg/mL，按1μL/cm的量划膜；所述参照带(6)由抗小鼠二抗喷射在所述硝酸纤维素膜(3)上，干燥后形成，其中抗小鼠二抗浓度为0.4mg/mL，按1μL/cm的量划膜。
4.根据权利要求1所述的腹泻性贝毒大田软海绵酸荧光检测试纸，其特征在于，所述大田软海绵酸-蛋白质偶联复合物的制备方法如下：
步骤(1)，将大田软海绵酸溶于N-二甲基甲酰胺中，加入预先配置好的0.1mg/μL N-羟基琥珀酰亚胺溶液及N，N-二环已基碳二亚胺溶液，加入ddH2O，旋涡震荡混匀；大田软海绵酸、N-二甲基甲酰胺、N-羟基琥珀酰亚胺、N，N-二环已基碳二亚胺、ddH2O的比例为1mg：50μL：1.55μL：2.85μL：45.6μL；
步骤(2)，室温25-28℃震荡孵育2-2.5h；
步骤(3)，将步骤(2)孵育好的混合液逐滴加入到等体积蛋白溶液中，所述蛋白溶液为人免疫球蛋白hIgG或牛血清白蛋白BSA溶于0.1M NaHCO3溶液中制备得到的；
步骤(4)，室温25-28℃震荡孵育2-2.5h，得到偶联物；
步骤(5)，用30kDa的离心超滤管超滤离心步骤(4)得到的偶联物，收集滤液，得到含有偶联复合物的溶液；将偶联复合物溶液用0.01M pH7.4 PBS溶解，得到OA-蛋白质偶联复合物；采用人免疫球蛋白hIgG制备的OA-蛋白质偶联复合物命名为OA-hIgG，采用BSA制备的OA-蛋白质偶联复合物命名为OA-BSA；
或者，将步骤(4)得到的偶联物用截留分子量为10000的透析带在0.01M pH7.4 PBS缓冲液透析24-48h，收集透析袋内透析产物，离心去除不溶性杂质，所得上清液中加入0.01MpH7.4 PBS，得到OA-蛋白质偶联复合物。
5.根据权利要求4所述的腹泻性贝毒大田软海绵酸荧光检测试纸，其特征在于，步骤(5)中，含有偶联复合物的溶液或者上清液用0.01M pH7.4 PBS溶解后，按加入蛋白的理论浓度计算使偶联复合物浓度为1mg/mL，最终得到OA-蛋白质偶联复合物。
6.一种利用权利要求3所述的腹泻性贝毒大田软海绵酸荧光检测试纸检测样品的方法，其特征在于，包括如下步骤：
C1，准备检测样品：将海产品洗净后剪碎，取1g剪碎的样品加1mL提取液匀浆，称重取五分之一份匀浆后的样品，加200μL提取液混匀，超声浸提并离心后，取上清液用0.01M pH7.4PB缓冲液4倍稀释，得到检测样品；当海产品带壳时，则将海产品洗净去壳后再剪碎；
C2，上样分析：将C1中检测样品40μL与38μL上样缓冲液和2μL OA特异性抗体标记量子点荧光探针混匀，反应10-15min，将反应液滴加到腹泻性贝毒大田软海绵酸荧光检测试纸的加样垫2上，层析20-30min后用蓝光检测仪观察分析，根据检测带5和参照带6荧光强度判断检测结果；检测带5为T线，参照带6为C线；
C3，结果判断：当C线、T线均出现两条荧光条带，且条带荧光强度接近，则检测试纸检测的样品毒素含量低于5ng/mL；当C线出现荧光条带，T线没有荧光条带，反应试纸条检测的样品毒素含量高于20ng/mL；当C线出现荧光条带，T线出现较弱的荧光条带，反应试纸条检测的样品毒素含量在5-20ng/mL之间；当C线不显荧光条带，无论T线是否有条带，其结果均无效。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述海产品为贝类海产品。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，C1中的检测样品是通过如下预处理步骤所得：
将采集的样品洗净去壳，剪碎，将剪碎的样品与提取液按照1g:1mL的比例混合并匀浆，称重取五分之一份匀浆后的样品，加提取液混匀5min，超声浸提5min，10000rpm离心10min，将上清液用pH7.4 PB缓冲液稀释后备用；所述提取液为甲醇与水按照80:20的体积比例混合而成的。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述上样缓冲液配方如下：溶质为0.4g/100mL PEG20 000、4.0g/100mL BSA、5.0g/100mL蔗糖、0.1g/100mL Tween-20，溶剂为0.01MpH7.4的PB。
10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，C2中的OA特异性抗体标记量子点荧光探针制备方法如下：将制备的OA-hIgG作为免疫原，通过常规杂交瘤技术，制备与纯化得到OA特异性抗体，然后采用常规EDC二步法将OA特异性抗体与量子点荧光微球结合，得到OA特异性抗体标记量子点荧光探针。
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