CN112028994B - 抗金黄色葡萄球菌肠毒素b的抗体、检测试纸及试剂盒 - Google Patents

抗金黄色葡萄球菌肠毒素b的抗体、检测试纸及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了特异性结合金黄色葡萄球菌肠毒素B的抗体或其活性片段、包括所述抗体的胶体金免疫层析检测试纸或试剂盒及其制备方法和应用。本发明的检测试纸或试剂盒生产方便，效果稳定，无非特异反应，包被量低，有利于大批量生产。本发明所提供的金黄色葡萄球菌肠毒素B的检测方法具有快捷、灵敏、简便、特异等优点，在食品安全检测和监控中具有广泛的应用。

Description

抗金黄色葡萄球菌肠毒素B的抗体、检测试纸及试剂盒
技术领域
本发明涉及免疫领域，具体涉及抗金黄色葡萄球菌肠毒素B的抗体，以及检测金黄色葡萄球菌肠毒素B的检测试纸及试剂盒。
背景技术
金黄色葡萄球菌肠毒素(staphylococcal enterotoxin，SE)为一类结构相关、毒力相似、抗原性不同的胞外蛋白质，是引起食物中毒和院内感染的重要病原，金葡菌可以产生多种能引发急性中毒的肠毒素，目前已发现的金黄色葡萄球菌肠毒素超过33种，包括SEA～SEE、SEI及类肠毒素G(enterotoxin-like serotypes G，selG)、selH和selJ～selU等，其中SEA～SEE被认为是引起中毒的主要毒素，尤其是SEB的毒性大且稳定性强，被认为是最强效的毒素之一。
金黄色葡萄球菌肠毒素B(staphylococcal enterotoxin B，SEB)，主要存在于肉类、乳等蛋白质含量较高的动物性食品中。研究发现，人体摄入微量的SEB会产生免疫失调、器官损伤等其他症状，临床表现为发热、呼吸疾病(咳嗽、呼吸困难及胸部疼痛)及消化道疾病，且当SEB摄入量达到20～100ng时，易感人群就会出现恶心、呕吐和腹泻等中毒症状，因此检测食品中的SEB含量是否超标显得尤为重要。但食物中的成分较为复杂，含有多种蛋白质、脂类和其他化合物，对SEB的准确检测工作造成很大的干扰，所以能够快速、准确的检测出食物中的SEB含量是亟待解决的难题。
免疫学检测方法因具有特异性强、操作简便、检测速度快、结果易于判断等优点，是目前SEs快速筛查中最常用且发展较为成熟的检测方法。现有的免疫学检测方法主要包括免疫凝集实验、琼脂糖扩散法和酶联免疫吸附方法等，但这些样品前处理和检测所用时间较长，不方便现场操作。
发明内容
本发明的第一目的在于提供特异性结合金黄色葡萄球菌肠毒素B的抗体或其活性片段。
所述抗体或活性片段包含至少一个重链可变区和至少一个轻链可变区；其中：
所述重链可变区具有SEQ ID NO:1所示的CDR1，SEQ ID NO:2所示的CDR2和/或SEQID NO:3所示的CDR3；或者，所述重链可变区具有SEQ ID NO:7所示的CDR1，SEQ ID NO:8所示的CDR2和/或SEQ ID NO:9所示的CDR3；
所述轻链可变区具有SEQ ID NO:4所示的CDR1，SEQ ID NO:5所示的CDR2和/或SEQID NO:6所示的CDR3；或者，所述轻链可变区具有SEQ ID NO:10所示的CDR1，SEQ ID NO:11所示的CDR2和/或SEQ ID NO:12所示的CDR3。
作为本发明的一种优选方案，所述抗体中，重链可变区具有SEQ ID NO:1所示的CDR1，SEQ ID NO:2所示的CDR2和/或SEQ ID NO:3所示的CDR3；所述轻链可变区具有SEQ IDNO:4所示的CDR1，SEQ ID NO:5所示的CDR2和/或SEQ ID NO:6所示的CDR3。
作为本发明的一种优选方案，所述抗体中，所述重链可变区具有SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列，或SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰获得的保守性变异体；所述轻链可变区具有SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列，或SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰获得的保守性变异体。
作为本发明的一种优选方案，所述抗体中，所述重链可变区具有SEQ ID NO:7所示的CDR1，SEQ ID NO:8所示的CDR2和/或SEQ ID NO:9所示的CDR3；所述轻链可变区具有SEQID NO:10所示的CDR1，SEQ ID NO:11所示的CDR2和/或SEQ ID NO:12所示的CDR3。
作为本发明的一种优选方案，所述抗体中，所述重链可变区具有SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列，或SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰获得的保守性变异体；所述轻链可变区具有SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列，或SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰获得的保守性变异体。
作为本发明的一种优选方案，所述抗体或活性片段为单克隆抗体和/或基因工程抗体；所述基因工程抗体选自单链抗体、单链抗体片段、嵌合单克隆抗体、嵌合单克隆抗体片段、改形单克隆抗体、改形单克隆抗体片段中的一种。
本发明的第二目的是保护编码SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:16所示氨基酸序列或所述抗体或活性片段的核苷酸序列。
在本发明中，SEQ ID NO:17所示的核苷酸序列编码SEQ ID NO:13所示氨基酸序列；SEQ ID NO:18所示的核苷酸序列编码SEQ ID NO:14所示氨基酸序列；SEQ ID NO:19所示的核苷酸序列编码SEQ ID NO:15所示氨基酸序列；SEQ ID NO:20所示的核苷酸序列编码SEQ ID NO:16所示氨基酸序列。
本发明的第三目的是保护检测金黄色葡萄球菌肠毒素B的免疫检测试纸或内部装配所述试纸的试剂盒，所述试纸上含有本发明提供的所述的抗体或活性片段。本发明优选所述试纸为胶体金免疫层析检测试纸。
作为本发明的优选方案，所述胶体金免疫层析检测试纸采用包括如下步骤的方法制备而成：
将本发明提供的抗体或活性片段与胶体金偶联后所得的溶液，喷于结合垫上；将本发明提供的抗体用包被缓冲液溶解后，包被于硝酸纤维素膜的T线上；将抗小鼠的IgG抗体用包被缓冲液溶解后，包被于硝酸纤维素膜的C线上；将所述结合垫以及硝酸纤维素膜组装于背板上，制成大版，裁成裸条，即试纸。
本发明的第四目的是保护本发明提供的抗体或活性片段，或所述试纸或试剂盒在样品中检测金黄色葡萄球菌肠毒素B的应用。优选地，所述样品为食品。
本发明的第五目的是保护利用本发明提供的抗体或活性片段，或所述试纸或试剂盒检测样品中金黄色葡萄球菌肠毒素B的方法。优选地，所述样品为食品。
作为本发明的优选方案，所述方法包括以下步骤：将待检样品的溶液滴加到胶体金免疫层析检测试纸上，或滴加到内部装配有所述试纸的试剂盒的加样孔中，静置，观察试纸上的T线和C线的显色情况。
如果T线与C线均显红色，则样品中含有浓度大于或等于10ng/ml的金黄色葡萄球菌肠毒素B；如果C线为红色，T线不显色，则样品中含有浓度小于10ng/ml的金黄色葡萄球菌肠毒素B；如果C线不显色，检测试剂失效。
附图说明
图1为用本发明提供的胶体金免疫检测层析试纸检测的结果示意图。
具体实施方式
根据本发明的技术方案，在不改变蛋白的活性或功能的情况下，可以对氨基酸序列中的某些氨基酸进行保守取代，参见下面表1：
表1
Figure GDA0003399425180000041
Figure GDA0003399425180000051
此外，因为碱基的简并性，在不改变多核苷酸序列的活性或功能的情况下，可以对多核苷酸序列的碱基进行取代，参见下面表2：
表2
Figure GDA0003399425180000052
Figure GDA0003399425180000061
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1：SEB的表达和纯化
将来自金黄色葡萄球菌菌株(ATCC登录号为BAA-1556)的基因组DNA通过PCR扩增SEB基因，连接到pGEX-6p-2载体中，转化到TOP10感受态细胞中，挑取阳性克隆，经DNA测序验证序列正确后，将其转化到BL21感受态细胞中。挑取阳性克隆，在大肠杆菌中过夜诱导表达GST-SEB蛋白。后收集菌体，利用谷胱甘肽琼脂糖4B介质富集GST-SEB蛋白，用PreScission酶4℃过夜酶切，去掉GST标签，收集SEB蛋白，低温保存备用。SEB蛋白的氨基酸序列如表1所示。
表3：原核表达SEB蛋白的氨基酸序列
Figure GDA0003399425180000062
实施例2：SEB单克隆抗体的制备
将实施例1纯化好的SEB抗原免疫6只8～12周龄Balb/c小鼠，免疫3次后，对小鼠进行眼眶采血，获取小鼠血清，用ELISA检测小鼠血清中SEB抗体滴度，抗体滴度>10000。
取抗体滴度>10000的小鼠脾细胞与骨髓瘤SP2/0细胞融合，并通过HAT选择培养基筛选融合细胞，并对融合细胞进行ELISA阳性筛选及亚克隆。筛选出的阳性单克隆，制备腹水，用Protein A/G抗体纯化柱纯化抗体，纯化后的抗体ELISA效价>1:128000，纯度>90％。
两株单克隆抗体对应的细胞株编号分别为3F2G10和5A11G6。
实施例3：SEB单克隆抗体CDR区序列的扩增以及序列测定
复苏杂交瘤细胞株3F2G10和5A11G6后培养，待细胞长至对数生长期，细胞计数约8×107个/ml时，收集细胞。按照TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit说明书提取杂交瘤细胞总RNA，依表4所示反应体系，置于65℃保温5min后，冰上迅速冷却，再按照表5所示的反应体系置于42℃60min；70℃15min；25℃1min进行1st-Strand cDNA合成反应。
表4：1st-Strand cDNA合成反应混合液
试剂 使用量
Oligo dT Primer(50μM) 1μL
dNTP Mixture(10mM each) 1μL
模板RNA <5μg
RNase Free dH<sub>2</sub>O Up to 10μL
表5：反转录反应液
试剂 使用量
上述变性后反应液(from step 2) 10μL
5xPrimeScriptⅡbuffer 4μL
RNase Inhibitor 0.5μL(20U)
PrimeScriptⅡRTase(200U/μL) 1μL(200U)
RNase Free dH<sub>2</sub>O Up to 20μL
以cDNA为模板，设计并合成轻链和重链可变区的上下游引物，引物序列如表6所示，PCR扩增轻链、重链可变区核酸序列，经胶回收得到DNA片段，检测回收核酸浓度。参照pMDTM19-T Vector Cloning Kit说明书，将DNA片段克隆至pMDTM19-T载体中，经16℃反应30min后，通过热激转化至TOP10感受态细胞中，经PCR菌落鉴定后，选取阳性菌落进行扩大培养，后按照Axygene试剂盒说明书提取连有单克隆抗体可变区序列的pMD19-T质粒，测定质粒浓度，测序。
表6：可变区引物序列
序列号 名称 引物序列(5’-3’)
SEQ ID NO:22 SEBVLF GTTAGATCTCCAGCTTGGTCCC
SEQ ID NO:23 SEBVLR GACATTCAGCTGACCCAGTCTCCA
SEQ ID NO:24 VHVR1 CTCACCATGGRATGSAGCTGKGTMATS
SEQ ID NO:25 VHCR2 AYCTCCACACACAGGRRCCAGTGGATAGAC
实施例4：单克隆细胞株3F2G10可变区序列
在GenBank中，比对测序结果与小鼠抗体核酸序列，结果显示该抗体的轻链和重链的可变区序列与提交的小鼠IgG可变区序列的同源性超过96％，确定测序得到的基因序列为小鼠抗体序列。
利用IMGT/V-QUEST与ABYSIS软件分析得到抗体轻链和重链可变区的氨基酸序列及CDR区、FR区的划分。测序结果如下：
表7：单克隆细胞株3F2G10抗体测序结果
Figure GDA0003399425180000081
Figure GDA0003399425180000091
实施例5：单克隆细胞株5A11G6的可变区序列
在GenBank中，比对测序结果与小鼠抗体核酸序列，结果显示该抗体的轻链和重链的可变区序列与提交的小鼠IgG可变区序列的同源性超过96％，确定测序得到的基因序列为小鼠抗体序列。
利用IMGT/V-QUEST与ABYSIS软件分析得到抗体轻链和重链可变区的氨基酸序列及CDR区、FR区的划分。测序结果如下：
表8：单克隆细胞株5A11G6抗体测序结果
Figure GDA0003399425180000101
Figure GDA0003399425180000111
实施例5：SEB胶体金免疫检测层析试剂检测SEB样品
将从细胞株编号为3F2G10对应腹水中纯化出的抗体，与粒径40nm的胶体金偶联，溶于复溶液中，使用金标三维划膜喷点仪喷于预处理好的结合垫上；将从细胞株编号为5A11G6对应腹水中纯化出的抗体，用包被缓冲液溶解后，使用金标三维划膜喷点仪包被于预处理好的硝酸纤维素(NC)膜的TEST线(T线)上；将外购的羊抗鼠IgG抗体，用包被缓冲液溶解后，使用金标三维划膜喷点仪包被于预处理好的硝酸纤维素膜的CONTROL线(C线)上；将喷金处理的结合垫、包被处理的NC膜、预处理的结合垫组装于背板上，制成大版。使用切条机将上一步制作的大版裁成宽度为4mm的裸条，组装于配套的卡壳中，制备成可用于检测SEB的胶体金检测试剂。
配制不同浓度的SEB样品液(溶剂为pH7.4，0.01M的磷酸盐缓冲液)，移液器分别移取不同浓度的SEB样品液80ul，平行滴加于胶体金检测试剂的加样孔，观察10min时，T线和C线的显色情况，如果T线与C线均显红色，为阳性；C线为红色，T线不显色为阴性；C线不显色，检测试剂失效。如图1所示。
经测定，该SEB胶体金检测试剂检测限为10ng/ml。
本发明采用原核表达融合GST标签的SEB蛋白，大大提高了SEB蛋白的表达量，利用谷胱甘肽琼脂糖4B介质富集SEB蛋白，获得纯度>90％的SEB蛋白，免疫小鼠制备了多株抗SEB单克隆抗体，对制备的单克隆抗体进行随机配对，将配对成功的两株单克隆抗体(细胞株编号分别为3F2G10和5A11G6)，分别用于胶体金标记和包被，建立检测SEB的胶体金试纸条检测方法。该方法操作简便、重现性好、方便现场使用，丰富了现有的SEB检测方法。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 北京三安新特生物科技有限公司
<120> 抗金黄色葡萄球菌肠毒素B的抗体、检测试纸及试剂盒
<130> RYP2010757.2
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Gly Glu Ile Asp Pro Ser Asp Asp Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
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115 120
<210> 14
<211> 109
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 3F2G10轻链氨基酸
<400> 14
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Thr Tyr Lys Ala Ser Lys Cys Val Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Asn Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ile Arg
85 90 95
Glu Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 15
<211> 120
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 5A11G6重链氨基酸
<400> 15
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ser Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Met Ile Asp Pro Ser Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Met Tyr
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Pro Ala His Pro Asn Trp Tyr Leu Asp Val Trp Gly Ala
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 16
<211> 109
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 5A11G6轻链氨基酸
<400> 16
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Tyr Arg Ala Ser Lys Ser Cys Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Asn Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Val Leu Asn Leu Glu Ser Ala Val Ala Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Ile Cys Gln His Ile Arg
85 90 95
Glu Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Asn Lys
100 105
<210> 17
<211> 464
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 3F2G10重链核苷酸
<400> 17
tctcaccatg gaatgcagct gggtcatgct cttcttggta tcaacagcta caggtgtcca 60
ctcccaggtc caactgcagc agcctgggac tgacgaactg aagcctgtga cttcagtgaa 120
gctgtcctgc aaggcttctg gctacacctt caccacctac tggatacact gggtgaatct 180
gaggcctgga caaggccttg aatggatcgg agagattgat ccttctgatg attatactaa 240
ctacaatcaa aagttcgagg gcaaggccac attgactgta gacatatcct ccagcactgc 300
ctacatgcag ctcagcagcc tgacatctga ggactctgcg gtctattact gtgcaagacc 360
ctattcctac gttagtagct acccgtttac ttactggggc caagggactc tggtcactgt 420
ctctgcagcc aaaacaacag ccccatcggt ctatccactg gcca 464
<210> 18
<211> 358
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 3F2G10轻链核苷酸
<400> 18
tgacattgtg ctgacccagt ctcctgcttc cttagctgta tctctggggc agagggccac 60
gatcacatac aaggccagca aatgtgtcag tacatctggc tatagttata tgcactggaa 120
ccaacagaaa ccaggacagc cacccagact cctcatctat cttgtatcca acctagagtc 180
tggggtccct gccaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcaccc tcaacatcca 240
tcctgtggag gaggaggatg ctgcaaccta ttactgtcag cacattaggg agcttacacg 300
ttcggagggg ggaccaagct ggaaataaaa cgggctgatg ctgcaccaac tgtatcca 358
<210> 19
<211> 473
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 5A11G6重链核苷酸
<400> 19
tctcaccatg gaatggagct gtgtaatcct cttcttggga gcaacagcta caggtgtcca 60
ctcccaggtc caactgcagc agcctggggc tgagctggtg aggcctgggg cttcagtgaa 120
gctgtcctgc aaggcttctg gctacacctt ctccaactac tcgatgaact gggtgaagca 180
gaggcctgga caaggccttg aatggattgg tatgattgat ccttcagaca gtgaaactca 240
ctacaatcaa atgtataagg acaaggccac attgactgta gacaaatcct ccagcacagc 300
ctacatgcag ctcagcagcc tgacatctga ggactctgcg gtctattact gtgcaagata 360
tcctgcccac ccgaactggt acctcgatgt ctggggcgca gggaccacgg tcaccgtctc 420
ctcagccaaa acgacacccc catctctcta tccactggcc cctgtgtgtg gag 473
<210> 20
<211> 358
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 5A11G6轻链核苷酸
<400> 20
tggatacagt tggtgcagca tcagcccgtt tattttccag cttggtcccc cctccgaacg 60
tgtaagctcc ctaatgtgct gacagatata ggttgcagca tcctcctcct ccacaggatg 120
gatgttgagg gtgaagtctg tcccagcacc actgccactg aacctggcag cgaccgcaga 180
ttctaggttg agtacaagat agatgaggag tctgggtggc tgtcctggtt tctgttggtt 240
ccagtgcata taactatagc cagatgtact gcaacttttg ctggccctgt atgagatggt 300
ggccctctgc cccagagata cagctaagga agcaggagac tgggtcatca caatgtca 358
<210> 21
<211> 239
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SEB蛋白
<400> 21
Glu Ser Gln Pro Asp Pro Lys Pro Asp Glu Leu His Lys Ser Ser Lys
1 5 10 15
Phe Thr Gly Leu Met Glu Asn Met Lys Val Leu Tyr Asp Asp Asn His
20 25 30
Val Ser Ala Ile Asn Val Lys Ser Ile Asp Gln Phe Leu Tyr Phe Asp
35 40 45
Leu Ile Tyr Ser Ile Lys Asp Thr Lys Leu Gly Asn Tyr Asp Asn Val
50 55 60
Arg Val Glu Phe Lys Asn Lys Asp Leu Ala Asp Lys Tyr Lys Asp Lys
65 70 75 80
Tyr Val Asp Val Phe Gly Ala Asn Tyr Tyr Tyr Gln Cys Tyr Phe Ser
85 90 95
Lys Lys Thr Asn Asp Ile Asn Ser His Gln Thr Asp Lys Arg Lys Thr
100 105 110
Cys Met Tyr Gly Gly Val Thr Glu His Asn Gly Asn Gln Leu Asp Lys
115 120 125
Tyr Arg Ser Ile Thr Val Arg Val Phe Glu Asp Gly Lys Asn Leu Leu
130 135 140
Ser Phe Asp Val Gln Thr Asn Lys Lys Lys Val Thr Ala Gln Glu Leu
145 150 155 160
Asp Tyr Leu Thr Arg His Tyr Leu Val Lys Asn Lys Lys Leu Tyr Glu
165 170 175
Phe Asn Asn Ser Pro Tyr Glu Thr Gly Tyr Ile Lys Phe Ile Glu Asn
180 185 190
Glu Asn Ser Phe Trp Tyr Asp Met Met Pro Ala Pro Gly Asp Lys Phe
195 200 205
Asp Gln Ser Lys Tyr Leu Met Met Tyr Asn Asp Asn Lys Met Val Asp
210 215 220
Ser Lys Asp Val Lys Ile Glu Val Tyr Leu Thr Thr Lys Lys Lys
225 230 235
<210> 22
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物SEBVLF
<400> 22
gttagatctc cagcttggtc cc 22
<210> 23
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物SEBVLR
<400> 23
gacattcagc tgacccagtc tcca 24
<210> 24
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物VHVR1
<400> 24
ctcaccatgg ratgsagctg kgtmats 27
<210> 25
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物VHCR2
<400> 25
ayctccacac acaggrrcca gtggatagac 30

Claims (13)

1.特异性结合金黄色葡萄球菌肠毒素B的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段包含如下重链可变区和轻链可变区；
所述重链可变区具有SEQ ID NO:1所示的CDR1，SEQ ID NO:2所示的CDR2和SEQ ID NO:3所示的CDR3；所述轻链可变区具有SEQ ID NO:4所示的CDR1，SEQ ID NO:5所示的CDR2和SEQ ID NO:6所示的CDR3；或
所述重链可变区具有SEQ ID NO:7所示的CDR1，SEQ ID NO:8所示的CDR2和SEQ ID NO:9所示的CDR3；所述轻链可变区具有SEQ ID NO:10所示的CDR1，SEQ ID NO:11所示的CDR2和SEQ ID NO:12所示的CDR3。
2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述重链可变区具有SEQ ID NO:1所示的CDR1，SEQ ID NO:2所示的CDR2和SEQ ID NO:3所示的CDR3；
所述轻链可变区具有SEQ ID NO:4所示的CDR1，SEQ ID NO:5所示的CDR2和SEQ ID NO:6所示的CDR3。
3.根据权利要求2所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述重链可变区具有SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列，或SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰获得的保守性变异体；
所述轻链可变区具有SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列，或SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰获得的保守性变异体。
4.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述重链可变区具有SEQ ID NO:7所示的CDR1，SEQ ID NO:8所示的CDR2和SEQ ID NO:9所示的CDR3；
所述轻链可变区具有SEQ ID NO:10所示的CDR1，SEQ ID NO:11所示的CDR2和SEQ IDNO:12所示的CDR3。
5.根据权利要求4所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述重链可变区具有SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列，或SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰获得的保守性变异体；
所述轻链可变区具有SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列，或SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰获得的保守性变异体。
6.根据权利要求1～5任意一项所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段为单克隆抗体和/或基因工程抗体；所述基因工程抗体选自单链抗体、单链抗体片段、嵌合单克隆抗体、嵌合单克隆抗体片段、改形单克隆抗体、改形单克隆抗体片段中的一种。
7.编码权利要求1～6任意一项所述抗体或抗原结合片段的核苷酸序列。
8.金黄色葡萄球菌肠毒素B的免疫检测试纸或内部装配所述试纸的试剂盒，其特征在于，所述试纸上含有权利要求1～6任意一项所述的抗体或抗原结合片段。
9.根据权利要求8所述的试纸，其特征在于，所述试纸为胶体金免疫层析检测试纸。
10.根据权利要求8所述的试纸，其特征在于，采用包括如下步骤的方法制备而成：
将权利要求2或3所述的抗体或抗原结合片段与胶体金偶联后所得的溶液，喷于结合垫上；将权利要求4或5所述的抗体或抗原结合片段用包被缓冲液溶解后，包被于硝酸纤维素膜的检测线上；将抗小鼠的IgG抗体用包被缓冲液溶解后，包被于硝酸纤维素膜的控制线上；将所述结合垫以及硝酸纤维素膜组装于背板上，将所得的大版裁成裸条，即试纸。
11.权利要求1～6任意一项的抗体或抗原结合片段，或权利要求8～10任意一项所述的试纸或试剂盒在样品中检测金黄色葡萄球菌肠毒素B的应用，所述样品为食品。
12.利用权利要求1～6任意一项的抗体或抗原结合片段，或权利要求8～10任意一项所述的试纸或试剂盒检测样品中金黄色葡萄球菌肠毒素B的方法，所述样品为食品。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：将待检样品的溶液滴加到胶体金免疫层析检测试纸上，或滴加到内部装配有所述试纸的试剂盒的加样孔中，静置，观察试纸上的T线和C线的显色情况；
如果检测线与控制线均显红色，则样品中含有浓度大于或等于10ng/ml的金黄色葡萄球菌肠毒素B；如果控制线为红色，检测线不显色，则样品中含有浓度小于10ng/ml的金黄色葡萄球菌肠毒素B；如果控制线不显色，检测试剂失效。
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Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113214368A (zh) * 2021-04-14 2021-08-06 中国人民解放军陆军军医大学 用于体外检测血清中金黄色葡萄球菌溶血素的溶血中和活性的溶血素抗原表位肽及其应用
CN113583119B (zh) * 2021-07-07 2023-05-02 西北农林科技大学 抗金黄色葡萄球菌的纳米抗体Nb56、应用及试剂盒
CN114236139A (zh) * 2021-12-30 2022-03-25 苏州和锐生物科技有限公司 一种TNF-α生物制剂的抗体检测试剂盒、制备方法
CN114957461B (zh) * 2022-05-24 2022-12-13 北京科跃中楷生物技术有限公司 包含碱性磷酸酶标记抗体的检测试剂盒

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8226958B2 (en) * 2003-03-28 2012-07-24 Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute Modified SEB and prophylactics/remedies for immunopathy containing the same
JP4571586B2 (ja) * 2003-09-05 2010-10-27 一般財団法人化学及血清療法研究所 プロテアーゼ耐性ｓｅｂ改変体およびそれを含むワクチン
ES2410886T3 (es) * 2006-10-26 2013-07-03 Janssen Biotech, Inc. Métodos para la adaptación al ser humano de anticuerpos monoclonales
CN101666802A (zh) * 2009-07-29 2010-03-10 中国检验检疫科学研究院 定量检测金黄色葡萄球菌肠毒素b的胶体金免疫层析方法以及胶体金免疫检测试纸条
JP2015213439A (ja) * 2014-05-08 2015-12-03 国立大学法人 東京大学 エンテロトキシンｂ、ｃ、ｄ又はｅ遺伝子を有する黄色ブドウ球菌又は該遺伝子の検出のためのｌａｍｐ用プライマー及びこれを用いたエンテロトキシンｂ、ｃ、ｄ又はｅ遺伝子を有する黄色ブドウ球菌又は該遺伝子の検出法
KR102124258B1 (ko) * 2018-10-19 2020-06-26 대한민국(관리부서 질병관리본부장) 신속 면역크로마토그래피법을 이용한 황색 포도알균 장독소 b 진단·탐지 키트 및 이를 위한 특이항체와 항체생산세포주
CN111333725B (zh) * 2018-12-19 2022-02-01 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 一种抗金黄色葡萄球菌肠毒素b的单克隆抗体yg11-2及其应用
CN111333724B (zh) * 2018-12-19 2022-03-15 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 一种抗金黄色葡萄球菌肠毒素b的单克隆抗体yg11-1及其应用
CN110526968B (zh) * 2019-08-19 2021-08-17 西北农林科技大学 一种金黄色葡萄球菌肠毒素b纳米抗体b7、应用及试剂盒
CN110563839A (zh) * 2019-08-19 2019-12-13 西北农林科技大学 一种金黄色葡萄球菌肠毒素b纳米抗体b1、应用及试剂盒
CN110498854B (zh) * 2019-09-28 2021-01-29 中国人民解放军陆军军医大学 一种抗金黄色葡萄球菌肠毒素b的抗体及其应用

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