CN103601662A - 一种褪黑素半抗原、褪黑素完全抗原及其制备方法和应用 - Google Patents

一种褪黑素半抗原、褪黑素完全抗原及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种褪黑素半抗原，以及由该半抗原制备的褪黑素完全抗原，该褪黑素完全抗原的结构式如P2所示：
Figure DDA0000419572510000011
式中，k为1～5的自然数，R为载体蛋白，n为10～20的自然数；该褪黑素完全抗原中，其褪黑素分子的抗原决定簇能充分暴露，且具有较完整的空间构象，因此，本发明提供的褪黑素完全抗原具有较好的免疫原性。本发明还提供了一种褪黑素半抗原及褪黑素完全抗原的制备方法和应用。

Description

一种褪黑素半抗原、褪黑素完全抗原及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物医药材料领域，具体涉及一种褪黑素半抗原、褪黑素完全抗原及其制备方法和应用。
背景技术
免疫分析是以抗原与抗体之间特异性识别和可逆性结合反应为基础的痕量分析方法，其不仅适用于大分子化合物（如蛋白质、核酸、细菌）的检测，也适用于小分子化合物（如激素、药物）的测定。建立小分子化合物的免疫分析方法的关键是能够制备出对小分子化合物具有高亲和力和高选择性的抗体。由于大多数小分子化合物的分子量小于1000，不具有免疫原性，即缺乏T细胞表位而无法直接诱导动物机体等产生特异性抗体。然而，小分子化合物可以通过适当的化学修饰方法，与大分子载体结合，生成小分子化合物-大分子载体的偶联物，此偶联物即为完全抗原，它可以借助T细胞表位来间接诱导B细胞的增殖及分化，产生特异性抗体。
褪黑素（Melatonin,MLT）是一种小分子物质，化学名为N-乙酰-5-甲氧基色胺，分子量仅为232.28D，不具有免疫原性，用于免疫，必须先与蛋白质大分子载体结合，形成褪黑素-蛋白质载体偶联的完全抗原后才具免疫原性。然而，制备褪黑素-蛋白质载体偶联的完全抗原不能影响褪黑素的空间构象，而且需要保持褪黑素抗原决定簇（如5-甲氧基、N-烷基侧链）的有效性，才能获得效价高、特异性强的褪黑素抗体。因此，如何制备具有良好免疫原性的完全抗原是建立测定褪黑素的免疫分析方法的难点。
发明内容
为解决上述问题，本发明第一方面，本发明提供了一种褪黑素半抗原；
第二方面提供了一种褪黑素完全抗原，该褪黑素完全抗原能充分暴露褪黑素的抗原决定簇，并保持褪黑素的空间构象，以该褪黑素完全抗原为免疫原制备的单克隆抗体和多克隆抗体对褪黑素具有较高的特异性和灵敏性；
本发明第三方面还提供了一种褪黑素半抗原的制备方法，该制备方法将褪黑素进行硝化、还原、衍生化并水解后，制得了含连接臂的褪黑素半抗原，
本发明第四方面还提供了一种褪黑素完全抗原的制备方法，该方法将该褪黑素半抗原再与载体蛋白进行偶联，即得到褪黑素完全抗原；
本发明第五方面还提供了一种褪黑素完全抗原的应用。
第一方面，本发明提供了一种褪黑素半抗原，结构式如P1所示：
Figure BDA0000419572490000021
第二方面，本发明提供了一种褪黑素完全抗原，结构式如P2所示：
Figure BDA0000419572490000022
式中，k为1～5的自然数，R为载体蛋白，n为10～20的自然数。
优选地，所述载体蛋白为球蛋白、牛血清白蛋白、鸡卵清蛋白、钥孔血蓝蛋白、兔血清白蛋白、人血清白蛋白、甲状腺球蛋白、纤维蛋白原、兔丙种球蛋白或鸡的丙种球蛋白。
本发明提供的褪黑素完全抗原分子包括褪黑素分子和载体蛋白，所述褪黑素分子和载体蛋白通过连接臂进行连接，所述连接臂优选为含羧基的直链烷基，其含有的活性基团羧基能保证褪黑素分子和载体蛋白上的自由氨基进行反应并偶联，此外，该连接臂的修饰位点位于苯环上，离褪黑素分子的抗原决定簇N-烷基侧链比较远，当褪黑素与载体蛋白偶联后有利于褪黑素N-烷基侧链的暴露，其次，该连接臂的碳链含碳原子比较适中，且具有和褪黑素N-烷基侧链类似的原子构成和结构，不易诱导机体产生臂抗体。以该褪黑素完全抗原为免疫原制备的单克隆抗体和多克隆抗体对褪黑素具有较高的特异性和灵敏性。
所述褪黑素分子和载体蛋白的偶联比n的取值范围为10～20，即每个载体蛋白分子上连接的褪黑素分子的平均数目为10～20，在该偶联比下得到的完全抗原既不影响褪黑素分子的空间结构，使其具有良好的免疫原性，从而有利于将本发明制备的完全抗原应用于各种免疫层析检测试剂盒中。
第二方面，本发明还提供了一种褪黑素半抗原的制备方法，包括如下步骤：
S10、提供褪黑素，其结构式如A所示：
Figure BDA0000419572490000031
将所述褪黑素和硝酸盐按1:1.05～1:1.1的摩尔比溶于85%～98%浓硫酸中，得到反应液，所述反应液在0～5℃下进行硝化反应2～3小时后，经调节pH值至碱性，随后进行分离纯化，得到化合物B，其结构式如B所示：
Figure BDA0000419572490000032
S20、酸性条件下，将所述化合物B和还原性金属按1:10～1:20的摩尔比溶于第一有机溶剂中得到反应液，所述反应液在70～80℃下进行还原反应2～4小时后，经调节pH值至碱性，随后进行抽滤得到滤液，所得滤液经萃取、过柱，得到化合物C，其结构式如C所示：
Figure BDA0000419572490000041
S30、在缚酸剂存在的条件下，将所述化合物C和溴乙酸乙酯按1:1.05～1:1.1的摩尔比溶于第二有机溶剂中，得到反应液，所述反应液在70℃～80℃下反应4～6小时后，分离纯化，得到化合物D，其结构式如D所示：
Figure BDA0000419572490000042
S40、将所述化合物D和碱按1:2～1:3的摩尔比溶于第三有机溶剂中中，得到反应液，所述反应液在常温下反应8～12小时后，调节pH至酸性至出现白色沉淀后进行离心，得到褪黑素半抗原，其结构式如E所示，其中，所述碱为一水合氢氧化锂、氢氧化钾或氢氧化钾：
Figure BDA0000419572490000043
优选地，所述步骤S10中，所述硝酸盐为硝酸钠或硝酸钾。
优选地，所述步骤S10中，所述调节pH值至碱性为在冰浴条件下进行。
优选地，所述步骤S10中，所述分离纯化的方式为萃取、过柱。
优选地，所述步骤S20中，所述酸性条件的pH值为1～3。
优选地，所述步骤S20中，所述还原性金属为锌或铁。
优选地，所述步骤S20中，所述反应液的pH为1～3。
优选地，所述步骤S20中，所述第一有机溶剂为乙醇或甲醇。
优选地，所述步骤S20中，所述萃取过程中，采用的萃取剂为乙酸乙酯。
优选地，所述步骤S30中，所述缚酸剂为碳酸钠或碳酸钾。
优选地，所述步骤S30中，所述缚酸剂的用量为所述化合物C摩尔浓度的2.5～3.5倍。
优选地，所述步骤S30中，所述第二有机溶剂为N,N-二甲基甲酰胺或二甲基亚砜。
优选地，所述步骤S30中，所述分离纯化的方式为萃取、过柱。
优选地，所述步骤S40中，所述第三有机溶剂为甲醇与水的混合液或乙醇与水的混合液。
进一步优选地，所述步骤S40中，所述甲醇与水的混合液中，甲醇和水的体积比为1:1～1:2。
进一步优选地，所述步骤S40中，所述乙醇与水的混合液中，乙醇和水的体积比为1:1～1:2。
更进一步优选地，所述步骤S40中，所述第三有机溶剂为体积比为1:1的甲醇与水的混合液。
第四方面，本发明提供了一种褪黑素完全抗原的制备方法，包括以下步骤：
（1）将如第三方面所制备的褪黑素半抗原溶解在N,N-二甲基甲酰胺溶液中，然后加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺，得到第一反应液，在15～20℃下搅拌反应2～3小时后，得到第二反应液，其中，在所述第一反应液中，所述1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺的摩尔浓度分别为所述褪黑素半抗原摩尔浓度的1.0～1.1、1.0～1.2倍；
（2）、将载体蛋白加入磷酸盐缓冲液得到载体蛋白溶液，其中，所述步骤（1）制备的第一反应液中褪黑素半抗原的摩尔浓度为所得载体蛋白溶液中载体蛋白摩尔浓度的10～20倍；
（3）、将步骤（1）所得的第二反应液逐滴加入到步骤（2）配置的所述载体蛋白的磷酸盐缓冲液中，在15～20℃下搅拌反应6～8小时后，得到含褪黑素完全抗原的混合溶液，将所述含褪黑素完全抗原的混合溶液进行透析后离心，得到含褪黑素完全抗原的上清溶液，所述褪黑素完全抗原的结构式如P2所示：
Figure BDA0000419572490000061
式中，k为1～5的自然数，R为载体蛋白，n为10～20的自然数。
优选地，所述第三方面制备的褪黑素半抗原步骤包括：
S10、提供褪黑素，其结构式如A所示：
将所述褪黑素和硝酸盐按1:1.05～1:1.1的摩尔比溶于85%～98%浓硫酸中，得到反应液，所述反应液在0～5℃下进行硝化反应2～3小时后，在冰浴条件下经调节pH值至碱性，随后经萃取、过柱，得到化合物B，其结构式如B所示：
Figure BDA0000419572490000063
S20、酸性条件下，将所述化合物B和还原性金属按1:10～1:20的摩尔比溶于第一有机溶剂中得到反应液，所述反应液在70～80℃下进行还原反应2～4小时后，经调节pH值至碱性，随后进行抽滤得到滤液，所得滤液经萃取、过柱，得到化合物C，其结构式如C所示：
Figure BDA0000419572490000064
S30、在缚酸剂存在的条件下，将所述化合物C和溴乙酸乙酯按1:1.05～1:1.1的摩尔比溶于第二有机溶剂中，得到反应液，所述反应液在70℃～80℃下反应4～6小时后，加水稀释，随后经萃取、过柱，得到化合物D，其结构式如D所示：
S40、将所述化合物D和碱按1:2～1:3的摩尔比溶于第三有机溶剂中中，得到反应液，所述反应液在常温下反应8～12小时后，调节pH至酸性至出现白色沉淀后进行离心，得到褪黑素半抗原，其结构式如E所示，其中，所述碱为一水合氢氧化锂、氢氧化钾或氢氧化钾：
Figure BDA0000419572490000072
优选地，所述步骤S10中，所述硝酸盐为硝酸钠或硝酸钾。
优选地，所述步骤S20中，所述酸性条件的pH值为1～3。
优选地，所述步骤S20中，所述还原性金属为锌或铁。
优选地，所述步骤S20中，所述反应液的pH为1～3。
优选地，所述步骤S20中，所述第一有机溶剂为乙醇或甲醇。
优选地，所述步骤S20中，所述萃取过程中，采用的萃取剂为乙酸乙酯。
优选地，所述步骤S30中，所述缚酸剂为碳酸钠或碳酸钾。
优选地，所述步骤S30中，所述缚酸剂的用量为所述化合物C摩尔浓度的2.5～3.5倍。
优选地，所述步骤S30中，所述第二有机溶剂为N,N-二甲基甲酰胺或二甲基亚砜。
优选地，所述步骤S40中，所述第三有机溶剂为甲醇与水的混合液或乙醇与水的混合液。
进一步优选地，所述步骤S40中，所述甲醇与水的混合液中，甲醇和水的体积比为1:1～1:2。
进一步优选地，所述步骤S40中，所述乙醇与水的混合液中，乙醇和水的体积比为1:1～1:2。
更进一步优选地，所述步骤S40中，所述第三有机溶剂为体积比为1:1的甲醇与水的混合液。
优选地，所述步骤（1）中，在所述第一反应液中，所述褪黑素半抗原的浓度为0.0226～0.0452mol/L。
优选地，所述步骤（2）中，所述磷酸盐的摩尔浓度为0.01mol/L。
优选地，所述步骤（2）中，所述载体蛋白为球蛋白、牛血清白蛋白、鸡卵清蛋白、钥孔血蓝蛋白、兔血清白蛋白、人血清白蛋白、甲状腺球蛋白、纤维蛋白原、兔丙种球蛋白或鸡的丙种球蛋白。
本发明提供的褪黑素完全抗原的制备方法，该制备方法先将褪黑素进行硝化、还原、衍生化、然后进行水解后，在褪黑素分子的苯环上引入了末端带有活性基团羧基的连接臂，制得了含连接臂的褪黑素半抗原，再将该褪黑素半抗原再与载体蛋白进行偶联，即得到褪黑素完全抗原。
第四方面，本发明提供了一种如第二方面所述的褪黑素完全抗原或第三方面所述的褪黑素完全抗原的制备方法在制备检测褪黑素的药物或试剂盒中的应用。
优选地，所述试剂盒为胶体金免疫层析试剂盒。
本发明提供了的褪黑素半抗原、褪黑素完全抗原及其制备方法和应用具有如下有益效果：
1)本发明提供的褪黑素完全抗原包括褪黑素分子和载体蛋白，所述褪黑素分子和载体蛋白通过连接臂进行连接，在所述褪黑素完全抗原中，其褪黑素分子的抗原决定簇能充分暴露，且具有较完整的空间构象，因此，本发明提供的褪黑素完全抗原具有较好的免疫原性；
2)本发明提供的褪黑素完全抗原免疫小鼠制备的褪黑素单克隆抗体的效价较高，纯化后的单克隆抗体对褪黑素表现出较高的特异性和灵敏性；
3)本发明提供的褪黑素半抗原及褪黑素完全抗原的制备方法简单易行，可以进行大规模生产，且生产成本低。
附图说明
图1为本发明实施例4提供的样品的紫外扫描图。
具体实施方式
以下所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
实施例1
一种褪黑素半抗原的制备方法，包括以下步骤：
（a）、提供褪黑素，其结构式如A所示：
Figure BDA0000419572490000091
将所述褪黑素和硝酸钠按1:1.05的摩尔比溶于98%的浓硫酸中，得到反应液，所述反应液在0℃下进行硝化反应2小时后，冰浴条件下经调节pH值至碱性，随后经萃取、过柱，得到化合物B，其结构式如B所示：
（b）、采用盐酸将乙醇调pH值至1，然后将所述化合物B和锌粉按1:10的摩尔比溶于该pH值为1的乙醇中，得到反应液，所述反应液在70℃下进行还原反应4小时，反应过程监测控制使反应液的pH值保持稳定，反应完毕后调节反应液pH值至碱性，随后进行抽滤得到滤液，所得滤液经乙酸乙酯萃取、过柱，得到化合物C，其结构式C所示；
Figure BDA0000419572490000101
（c）、将所述化合物C和溴乙酸乙酯按1:1.05的摩尔比溶于N,N-二甲基甲酰胺中，随后加入用量为化合物C摩尔量2.5倍的碳酸钾，得到反应液，所述反应液在70℃下进行反应4小时后，加水稀释，随后经萃取、过柱，得到化合物D，其结构式如D所示：
（d）、将所述化合物D和一水合氢氧化锂按1:2的摩尔比溶于甲醇和水的混合液（体积比为1:1）中，得到反应液，所述反应液在常温下进行反应12小时后，加适量盐酸调节pH为酸性（pH约为4），至出现白色沉淀后进行离心，离心所得沉淀即褪黑素半抗原，得到褪黑素半抗原，其结构式如E所示：
Figure BDA0000419572490000103
实施例2
一种褪黑素半抗原的制备方法，包括以下步骤：
（a）、提供褪黑素，其结构式如A所示；
将所述褪黑素和硝酸钾按1:1.1的摩尔比溶于85%的浓硫酸中，得到反应液，所述反应液在5℃下进行硝化反应3小时后，冰浴条件下经调节pH值至碱性，随后经萃取、过柱，得到化合物B，其结构式如实施例1步骤（b）化合物B所示提供褪黑素，其结构式如实施例1步骤（a）化合物A所示；
（b）、采用盐酸将甲醇调pH值至2，然后将所述化合物B和铁粉按1:20的摩尔比溶于该pH值为2的甲醇中，得到反应液，所述反应液在80℃下进行还原反应2小时，反应过程监测控制使反应液的pH值保持稳定，反应完毕后调节反应液pH值至碱性，随后进行抽滤得到滤液，所得滤液经乙酸乙酯萃取、过柱，得到化合物C，其结构式如实施例1步骤（b）化合物C所示；
（c）、将所述化合物C和溴乙酸乙酯按1:1.1的摩尔比溶于二甲基亚砜中，随后加入用量为化合物C摩尔量3倍的碳酸钠，得到反应液，所述反应液在75℃下进行反应5小时后，加水稀释，随后经萃取、过柱，得到化合物D，其结构式如实施例1步骤（c）化合物D所示;
（d）、将所述化合物D和一水合氢氧化锂按1:2.5的摩尔比溶于甲醇和水的混合液（体积比为1:1.5）中，得到反应液，所述反应液在常温下进行反应10小时后，加适量盐酸调节pH为酸性（pH约为5），至出现白色沉淀后进行离心，离心所得沉淀即褪黑素半抗原E，其结构式如实施例1步骤（d）化合物E所示。
实施例3
一种褪黑素半抗原的制备方法，包括以下步骤：
（a）、提供褪黑素，其结构式如实施例1步骤（a）化合物A所示；
将所述褪黑素和硝酸钠按1:1.1的摩尔比溶于90%的浓硫酸中，得到反应液，所述反应液在3℃下进行硝化反应2.5小时后，冰浴条件下经调节pH值至碱性，随后经萃取、过柱，得到化合物B，其结构式如实施例1步骤（a）化合物B所示；
（b）、采用盐酸将乙醇调pH值至3，然后将所述化合物B和锌粉按1:15的摩尔比溶于该pH值为1的乙醇中，得到反应液，所述反应液在75℃下进行还原反应3小时，反应过程监测控制使反应液的pH值保持稳定，反应完毕后调节反应液pH值至碱性，随后进行抽滤得到滤液，所得滤液经乙酸乙酯萃取、过柱，得到化合物C，其结构式如实施例1步骤（b）化合物C所示；
（c）、将所述化合物C和溴乙酸乙酯按1:1.1的摩尔比溶于N,N-二甲基甲酰胺中，随后加入用量为化合物C摩尔量3.5倍的碳酸钾，得到反应液，所述反应液在80℃下进行反应6小时后，加水稀释，随后经萃取、过柱，得到化合物D，其结构式如实施例1步骤（c）化合物D所示;
（d）、将所述化合物D和一水合氢氧化锂按1:3的摩尔比溶于甲醇和水（体积比为1:2）中，得到反应液，所述反应液在常温下进行反应8小时后，加适量盐酸调节pH为酸性（pH约为4），至出现白色沉淀后进行离心，离心所得沉淀即褪黑素半抗原E，其结构式如实施例1步骤（d）化合物E所示。
实施例4
一种褪黑素完全抗原的制备方法，包括以下步骤：
（a）、将实施例1所制备的褪黑素半抗原溶解在DMF中，然后加入EDC.HCl和NHS，得到第一反应液，在15℃下搅拌活化反应2小时后，得到第二反应液，其中，在所述第一反应液中，所述褪黑素半抗原的浓度为0.0339mol/L，所述EDC.HCl和NHS的摩尔浓度均为所述褪黑素半抗原摩尔浓度的1.0倍；
（b）、将BSA蛋白溶解在0.01mol/L的PBS溶液中，配置BSA蛋白的PBS缓冲液，其中，所述BSA蛋白的摩尔浓度为0.1505mol/L，即步骤（a）褪黑素半抗原的摩尔浓度为所述BSA蛋白的摩尔浓度的17倍；
（c）、将步骤（a）所得的第二反应液逐滴加入到步骤（b）配置的所述BSA蛋白的PBS缓冲液中，在15℃下搅拌反应6小时后，得到含褪黑素完全抗原的混合溶液，将所述含褪黑素完全抗原的混合溶液进行透析3小时后离心，得到含褪黑素完全抗原的上清溶液。
采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)对本发明制备的褪黑素完全抗原进行偶联比的测定（采用的飞行时间质谱的型号为MALDI-TOF/TOF4700，Applied Biosystems，USA)，经检测得偶联物分子量约为71625.83Da，计算得1分子BSA约与17分子褪黑素半抗原偶联，即褪黑素半抗原与BSA的偶联比为17：1。
本实施例制备的所述褪黑素完全抗原（MLT-BSA偶联物，MLT代表褪黑素）的结构式如P2所示：
Figure BDA0000419572490000131
式中，k为1的自然数，R为BSA蛋白，n为17的自然数。
为充分说明本发明的有益效果，本实施例还采用MAPADA UV-1800对相同蛋白浓度的BSA和本实施例制备的MLT-BSA偶联物的紫外吸收特征进行测定。结果如图1所示，图1为BSA和MLT-BSA完全抗原的紫外扫描图，图中有两条曲线，曲线BSA为BSA的紫外扫描曲线，曲线MLT-BSA-MQ为褪黑素偶联抗原的紫外扫描曲线。由图1可知，在蛋白浓度相同或接近的条件下，没有偶联MLT的BSA，和偶联了MLT的BSA在230nm-300nm范围内吸收峰相差很大，且在300nm-600nm范围内BSA几乎没有特征吸收峰，而偶联了MLT的BSA有明显的吸收峰，说明半抗原MLT成功偶联到BSA上。
实施例5
一种褪黑素完全抗原的制备方法，包括以下步骤：
（a）、将步骤（1）所得的褪黑素半抗原溶解在DMF中，然后加入EDC.HCl和NHS，得到第一反应液，在18℃下搅拌活化反应2.5小时后，得到第二反应液，其中，在所述第一反应液中，所述褪黑素半抗原的浓度为0.0452mol/L，所述EDC.HCl和NHS的摩尔浓度分别为所述褪黑素半抗原摩尔浓度的1.1、1.2倍；
（b）、将OVA蛋白溶解在0.01mol/L的PBS溶液中，配置OVA蛋白的PBS缓冲液，其中，所述OVA蛋白的摩尔浓度为0.1550mmol/L，即步骤（a）褪黑素半抗原的摩尔浓度为所述OVA蛋白的摩尔浓度的20倍；
（c）、将步骤（a）所得的第二反应液逐滴加入到步骤（b）配置的所述OVA蛋白的PBS缓冲液中，在18℃下搅拌反应7小时后，得到含褪黑素完全抗原的混合溶液，将所述含褪黑素完全抗原的混合溶液进行透析6小时后离心，得到含褪黑素完全抗原的上清溶液；
采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)对本发明制备的褪黑素完全抗原进行偶联比的测定（采用的飞行时间质谱的型号为MALDI-TOF/TOF4700，Applied Biosystems，USA)，经检测得偶联物分子量约为48192.25Da，计算得1分子OVA约与17分子褪黑素半抗原偶联，即褪黑素半抗原与OVA的偶联比为20：1。
本实施例制备的所述褪黑素完全抗原（MLT-BSA偶联物）的结构式如实施例4中P2所示，式中，k为3的自然数，R为OVA蛋白，n为20的自然数。
实施例6
一种褪黑素完全抗原的制备方法，包括以下步骤：
（a）、将步骤（1）所得的褪黑素半抗原溶解在DMF中，然后加入EDC.HCl和NHS，得到第一反应液，在20℃下搅拌活化反应3小时后，得到第二反应液，其中，在所述第一反应液中，所述褪黑素半抗原的浓度为0.0266mol/L，所述EDC.HCl和NHS的摩尔浓度分别为所述褪黑素半抗原摩尔浓度的1.1、1.2倍；
（b）、将BSA蛋白溶解在0.01mol/L的PBS溶液中，配置BSA蛋白的PBS缓冲液，其中，所述BSA蛋白的摩尔浓度为0.1505mmol/L，即步骤（a）褪黑素半抗原的摩尔浓度为所述BSA蛋白的摩尔浓度的10倍；
（c）、将步骤（a）所得的第二反应液逐滴加入到步骤（b）配置的所述BSA蛋白的PBS缓冲液中，在20℃下搅拌反应8小时后，得到含褪黑素完全抗原的混合溶液，将所述含褪黑素完全抗原的混合溶液进行透析8小时后离心，得到含褪黑素完全抗原的上清溶液；
采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)对本发明制备的褪黑素完全抗原进行偶联比的测定，（采用的飞行时间质谱的型号为MALDI-TOF/TOF4700，Applied Biosystems，USA)，经检测得偶联物分子量约为69487.51Da，计算得1分子BSA约与10分子褪黑素半抗原偶联，即褪黑素半抗原与BSA的偶联比为10：1。
本实施例制备的所述褪黑素完全抗原（MLT-BSA偶联物）的结构式如实施例4中P2所示，式中，k为3的自然数，R为BSA蛋白，n为10的自然数。
实施例7
一种褪黑素单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：
（1）动物免疫
以本发明实施例一提供的偶联物MLT-BSA为免疫抗原免疫Balb/c小鼠，100μg/kg体重。首免时将免疫原与等量的弗氏完全佐剂混合制成乳化剂，颈背部皮下多点注射，间隔2周取相同剂量免疫原加等量弗氏不完全佐剂混合乳化，继续三免、方法剂量同二免，三免一周后尾部采血检测血清效价及抑制，待检测符合要求时腹腔冲击免疫一次，3天后取脾细胞。
（2）细胞融合和克隆化
取免疫Balb/c小鼠脾细胞，按5：1比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
（3）细胞冻存和复苏
取处于对数生长期的杂交瘤细胞用冻存液制成5×106个/ml的细胞悬液，分装于冻存管，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。
（4）单克隆抗体的制备与纯化
采用体内诱生法，将8周龄的Balb/c小鼠腹腔注入弗氏不完全佐剂0.5ml/只，7天后腹腔注射杂交瘤细胞5×106个/只，7天后采集腹水。用亲和层析柱进行腹水纯化，紫外分光光度计测定蛋白浓度，-20℃保存备用。采用ELISA法测定纯化抗体的效价为1:10000，结果表明，纯化的抗体对褪黑素表现出较高的特异性和灵敏性。

Claims (10)

1.一种褪黑素半抗原，其特征在于，结构式如P1所示：
Figure FDA0000419572480000011
2.一种褪黑素完全抗原，其特征在于，结构式如P2所示：
Figure FDA0000419572480000012
式中，k为1～5的自然数，R为载体蛋白，n为10～20的自然数。
3.如权利要求2所述的一种褪黑素完全抗原，其特征在于，所述载体蛋白为球蛋白、牛血清白蛋白、鸡卵清蛋白、钥孔血蓝蛋白、兔血清白蛋白、人血清白蛋白、甲状腺球蛋白、纤维蛋白原、兔丙种球蛋白或鸡的丙种球蛋白。
4.一种褪黑素半抗原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S10、提供褪黑素，其结构式如A所示：
Figure FDA0000419572480000013
将所述褪黑素和硝酸盐按1:1.05～1:1.1的摩尔比溶于85%～98%浓硫酸中，得到反应液，所述反应液在0～5℃下进行硝化反应2～3小时后，经调节pH值至碱性，随后进行分离纯化，得到化合物B，其结构式如B所示：
S20、酸性条件下，将所述化合物B和还原性金属按1:10～1:20的摩尔比溶于第一有机溶剂中得到反应液，所述反应液在70～80℃下进行还原反应2～4小时后，经调节pH值至碱性，随后进行抽滤得到滤液，所得滤液经萃取、过柱，得到化合物C，其结构式如C所示：
Figure FDA0000419572480000022
S30、在缚酸剂存在的条件下，将所述化合物C和溴乙酸乙酯按1:1.05～1:1.1的摩尔比溶于第二有机溶剂中，得到反应液，所述反应液在70℃～80℃下反应4～6小时后，分离纯化，得到化合物D，其结构式如D所示：
S40、将所述化合物D和碱按1:2～1:3的摩尔比溶于第三有机溶剂中中，得到反应液，所述反应液在常温下反应8～12小时后，调节pH至酸性，出现白色沉淀后进行离心，得到褪黑素半抗原，其结构式如E所示，其中，所述碱为一水合氢氧化锂、氢氧化钾或氢氧化钾：
5.如权利要求4所述的褪黑素半抗原的制备方法，其特征在于，所述步骤S10中，所述硝酸盐为硝酸钠或硝酸钾。
6.如权利要求4所述的褪黑素半抗原的制备方法，其特征在于，所述步骤S20中，所述还原性金属为锌或铁；所述反应液的pH为1～3；所述第一有机溶剂为乙醇或甲醇。
7.如权利要求4所述的褪黑素半抗原的制备方法，其特征在于，所述步骤S30中，所述缚酸剂为碳酸钠或碳酸钾；所述缚酸剂的用量为所述化合物C摩尔浓度的2.5～3.5倍；所述第二有机溶剂为N,N-二甲基甲酰胺或二甲基亚砜；所述步骤S40中，所述第三有机溶剂为甲醇与水的混合液或乙醇与水的混合液。
8.一种褪黑素完全抗原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）、将如权利要求4所制备的褪黑素半抗原溶解在N,N-二甲基甲酰胺溶液中，然后加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺，得到第一反应液，在15～20℃下搅拌反应2～3小时后，得到第二反应液，其中，在所述第一反应液中，所述1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺的摩尔浓度分别为所述褪黑素半抗原摩尔浓度的1.0～1.1、1.0～1.2倍；
（2）、将载体蛋白加入磷酸盐缓冲液得到载体蛋白溶液，其中，所述步骤（1）制备的第一反应液中褪黑素半抗原的摩尔浓度为所得载体蛋白溶液中载体蛋白摩尔浓度的10～20倍；
（3）、将步骤（1）所得的第二反应液逐滴加入到步骤（2）配置的所述载体蛋白的磷酸盐缓冲液中，在15～20℃下搅拌反应6～8小时后，得到含褪黑素完全抗原的混合溶液，将所述含褪黑素完全抗原的混合溶液进行透析后离心，得到含褪黑素完全抗原的上清溶液，所述褪黑素完全抗原的结构式如P2所示：
Figure FDA0000419572480000041
式中，k为1～5的自然数，R为载体蛋白，n为10～20的自然数。
9.如权利要求8所述的一种褪黑素完全抗原的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中，所述载体蛋白为球蛋白、牛血清白蛋白、鸡卵清蛋白、钥孔血蓝蛋白、兔血清白蛋白、人血清白蛋白、甲状腺球蛋白、纤维蛋白原、兔丙种球蛋白或鸡的丙种球蛋白。
10.如权利要求2所述的褪黑素完全抗原在制备检测褪黑素的药物或试剂盒中的应用。
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