CN105348206A - 多效唑半抗原、抗原、抗体及其制备方法 - Google Patents

多效唑半抗原、抗原、抗体及其制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN105348206A
CN105348206A CN201510756126.6A CN201510756126A CN105348206A CN 105348206 A CN105348206 A CN 105348206A CN 201510756126 A CN201510756126 A CN 201510756126A CN 105348206 A CN105348206 A CN 105348206A
Authority
CN
China
Prior art keywords
paclobutrazol
antigen
antibody
solution
haptens
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201510756126.6A
Other languages
English (en)
Inventor
王秋艳
程根武
张宁
秦朝秋
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Individual
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Priority to CN201510756126.6A priority Critical patent/CN105348206A/zh
Publication of CN105348206A publication Critical patent/CN105348206A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D249/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having three nitrogen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D249/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having three nitrogen atoms as the only ring hetero atoms not condensed with other rings
    • C07D249/08—1,2,4-Triazoles; Hydrogenated 1,2,4-triazoles
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/76—Albumins
    • C07K14/765—Serum albumin, e.g. HSA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/76—Albumins
    • C07K14/77—Ovalbumin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/795—Porphyrin- or corrin-ring-containing peptides

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及半抗原、抗原、抗体及其制备方法，特别涉及一种多效唑半抗原、抗原、抗体及其制备方法。本发明多效唑人工抗原为将多效唑进行结构改造得到的化合物，在多效唑的羟基上引入活性官能团结构，既最大程度保留了多效唑的特征结构，又具有可以与载体蛋白发生偶联的活性基团。本发明多效唑人工抗原制备的抗体为将多效唑人工抗原与载体蛋白偶联得到的偶联物。将本发明多效唑人工抗原免疫动物，可获得高特异性的单克隆抗体和多克隆抗体，方法简便、易行。

Description

多效唑半抗原、抗原、抗体及其制备方法
技术领域
本发明涉及半抗原、抗原、抗体及其制备方法，特别涉及一种多效唑半抗原、抗原、抗体及其制备方法。
背景技术
植物生长调节剂(PlantGrowthRegulator)是一类具有植物激素活性的人工合成农药，可用于调节果蔬的生长和贮藏，在农业生产过程中提高农产品产量和质量发挥着重要作用。多效唑是20世纪70年代末英国化学公司研制开发的植物生长调节剂，是一种高效低毒的生长延缓剂，它能够降低赤霉素和吲哚乙酸的含量，增加乙烯的释放量，提高抗倒伏、抗旱等抗逆性，增加产量，改善作物品质。然而随着科学技术的进步，有关植物生长调节剂安全性的报道越来越引起世界各国普遍关注。研究发现，多效唑在土壤中残留半衰期较长，可能对非目标物产生危害，因此很多国家对多效唑在农产品中的残留量有严格的限量标准。
目前，欧盟、澳大利亚、日本、韩国、新加坡等国均已制定果蔬中多种植物生长调节剂的限量。其中，欧盟规定蔬菜、水果(除葡萄)、葡萄中多效唑的限量分别为0.02mg/kg、0.5mg/kg、0.05mg/kg；澳大利亚规定各类热带和亚热带水果(除鳄梨和芒果)、鳄梨、芒果、大麦和小麦中多效唑的限量分别为0.01mg/kg、0.1mg/kg、1mg/kg、0.1mg/kg；日本规定桃、苹果、香蕉中多效唑的限量分别为0.2mg/kg、0.5mg/kg、0.01mg/kg；韩国规定桃、杏、李子和樱桃中多效唑的限量为0.05mg/kg，苹果中多效唑限量为0.5mg/kg；新加坡规定鳄梨和核果中多效唑的限量为0.01mg/kg。我国食品安全国家标准GB2763-2014(食品中农药最大残留限量)对多效唑残留量的规定如下：稻谷、小麦、花生仁、菜籽油、苹果、荔枝中多效唑的限量为0.5mg/kg，油菜籽中多效唑的限量为0.2mg/kg。
传统的多效唑残留分析方法，主要是依靠液相色谱法、气相色谱法或质谱法等仪器分析方法，检测仪器昂贵，这些检测方法虽然能够满足限量检测的需要，但存在操作过程繁琐复杂、成本较高、分析速度慢等问题，不适用于大批量样品的筛选检测。免疫分析，由于在抗原抗体的定性定量方面独特的优势和操作简便快速、成本低、灵敏度较高、分析样本量大的优点弥补了理化分析的不足，在化合物残留检测中起着越来越重要的作用。
影响免疫化学分析质量的根本因素是抗体的特异性与亲和性，这些性质又决定于免疫半抗原分子的结构，因此免疫半抗原的分子设计与合成就是产生特异性抗体和建立小分子化合物残留快速检测技术最基础和最关键的步骤。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高免疫原性的多效唑人工半抗原、抗原并获得抗体。同时达到制备方法重复性好、易于标准化及可保证无限量供应的目标。
为达到上述目的，本发明提供了一种多效唑半抗原，其特征在于，所述多效唑半抗原具有如下结构式：
本发明还提供了所述多效唑半抗原的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、按1:1的摩尔比称取多效唑和4-(溴甲基)苯甲酸，0℃溶于四氢呋喃中；向所得四氢呋喃溶液中加入氢化钠，冰浴下搅拌30～60min后，室温下搅拌30～60min；加入碘化钾反应，加热回流10～18h；所述多效唑与四氢呋喃的质量体积比为1:20g/ml，所述多效唑与氢化钠的质量比为10:3，所述多效唑与碘化钾的质量比为(15～20):1；
S2、将步骤S1得到的反应液冷却至室温，加水后，加入2mol/L的盐酸调节pH至5；60～70℃旋蒸除四氢呋喃；所述水的加入量为步骤S1所述多效唑质量的10倍；
S3、用乙酸乙酯萃取步骤S2得到的有机相3～5次；将得到的萃取相通过无水硫酸钠干燥，直至溶剂完全挥干；
S4、将步骤S3得到的残留物用沸程为60～90℃的石油醚与乙酸乙酯按体积比4:1配制成的淋洗液淋洗过硅胶柱；而后，将淋洗液浓缩至多效唑加入量的0.5～0.7倍，所得浓缩液即为多效唑半抗原；所述硅胶柱规格为30g，25cm。
本发明所制得的多效唑半抗原为将多效唑进行结构改造得到的羧基化多效唑化合物，在多效唑的羟基上引入活性官能团结构，既最大程度保留了多效唑的特征结构，又具有可以与载体蛋白发生偶联的活性基团。
本发明提供了一种多效唑抗原，其特征在于，所述多效唑抗原具有如下结构式：
式中：Protein为载体蛋白。
本发明还提供了所述多效唑抗原的制备方法，其特征在于，多效唑半抗原与载体蛋白通过氨基与羧基的缩合反应偶联，即得到多效唑抗原；所述载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清白蛋白或钥孔血蓝蛋白。
优选方式下，所述多效唑抗原的制备方法包括如下步骤：
T1、称取所述多效唑半抗原，溶解于无水二氧六环试剂中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，室温下搅拌反应6个小时，得到溶液A，备用；所述多效唑半抗原、无水二氧六环试剂、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的质量体积比为5～20mg:1～2.5ml:60～120mg:40～60mg；
称取载体蛋白溶于碳酸盐缓冲液中，得到溶液B，备用；所述载体蛋白与碳酸盐缓冲液的质量体积比为20～100mg:3～15ml；
T2、将步骤T1得到的溶液A按所述多效唑半抗原与载体蛋白质量比5～20:20～100的比例加入到溶液B中，室温搅拌10～18h，装入透析袋，在PBS缓冲液中4℃透析72小时，中间置换所述缓冲液6次；8000rmp离心30min，得到的上清液即为多效唑抗原溶液；
步骤T1所述载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清白蛋白或钥孔血蓝蛋白。
本发明制得的多效唑抗原中，多效唑半抗原与载体蛋白的偶联比为8～11:1，所述偶联比为摩尔比。
本发明所述多效唑人工抗原可以作为免疫原也可以作为检测用包被原。
本发明还提供了多效唑抗原制备的抗体，其特征在于，所述抗体通过将所述多效唑抗原刺激动物机体免疫应答获得。
优选方式下，所述抗体为多效唑多克隆抗体。
优选方式下，所述抗体为多效唑单克隆抗体。
本发明的优点在于：
通过化学合成多效唑免疫抗原，对小鼠进行免疫，制备得到高度均质、纯度高、专一性强的抗多效唑单克隆抗体，制备方法具有重复性好、易于标准化及可保证无限量供应等优势。
附图说明
图1为多效唑人工抗原的SDS-PAGE图。
图2为单克隆抗体的标准曲线。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例中所用的PBS缓冲液均为pH7.4、0.01mol/L的PBS缓冲液。实施例中所用的碳酸盐缓冲液均为pH9.6、0.05mol/L的碳酸钠缓冲液。牛血清白蛋白简称BSA，卵清蛋白简称OVA，钥孔血蓝蛋白简称KLH。
多效唑，如式(1)所示，购自Sigma-Aldrich公司，分子量为293.79。
式(1)
4-(溴甲基)苯甲酸，式(2)所示，购自Sigma-Aldrich公司，分子量为214.0366。
式(2)
实验用Balb/c小鼠和新西兰白兔由大连医科大学实验动物中心提供。
实施例1、制备多效唑半抗原
称取1.0g多效唑和0.73g4-(溴甲基)苯甲酸，在0℃下，溶解于20mL四氢呋喃中，向溶液中加入0.3g氢化钠，冰浴下搅拌30min。然后室温下继续搅拌30min后，加入0.056g碘化钾后，加热回流18h。上述反应液冷却到室温并缓慢加入10mL蒸馏水，2MHCl调pH到5，旋转蒸发除去大部分四氢呋喃，用20mL乙酸乙酯萃取有机相三次，乙酸乙酯提取物经无水硫酸钠干燥后，溶剂被完全挥干。残留物用石油醚(60-90℃)-乙酸乙酯(4:1，v/v)淋洗过硅胶柱(30g，25cm)。淋洗液浓缩至0.7g，即为多效唑半抗原。
实施例2、制备多效唑人工抗原
1、多效唑免疫原的制备
取8mg实施例1制备得到的多效唑半抗原所示化合物，溶解于1.0ml无水二氧六环试剂中，分别加入90mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)，53.5mgN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，室温下搅拌反应6个小时，得到多效唑的活化液；称取载体蛋白BSA20mg溶于3mL碳酸盐缓冲液中；向BSA溶液中缓慢加入多效唑活化液，室温下磁力搅拌18h，装入透析袋，在PBS缓冲液中4℃透析72小时(中间置换缓冲液6次)，然后于8000rmp离心30min，取上清即为多效唑抗原溶液(多效唑免疫原溶液)；将得到多效唑抗原溶液分装于安培瓶中，-20℃保存。偶联BSA的多效唑免疫原简称PBZ-BSA，其溶液简称PBZ-BSA溶液。
用同样的方法可以制备多效唑的偶联物PBZ-KLH，或PBZ-OVA。
上述方法制备的多效唑偶联物同样可以作为多效唑的包被原。
将PBZ-BSA溶液用PBS缓冲液稀释后，测定280nm和260nm的分光光度值，按公式计算稀释液中的蛋白的浓度，乘以稀释倍数后即为PBZ-BSA溶液中的PBZ-BSA浓度。蛋白质浓度(mg/ml)＝1.45×OD280-0.74×OD260。
2、多效唑免疫原的表征
将PBZ-BSA溶液用PBS缓冲液稀释(使PBZ-BSA的浓度为5mg/mL)，作为溶液甲；将含5mg/mL多效唑的PBS缓冲液作为溶液乙；将含5mg/mLBSA的PBS缓冲液作为溶液丙。分别将溶液甲、溶液乙和溶液丙进行紫外(200-380nm)光谱扫描，分别采用溶液乙和溶液丙的最大吸收波长值对溶液甲进行紫外光谱扫描，并根据已经计算出的该化合物的消光系数反向计算该化合物在溶液甲中的浓度，用浓度值除以分子量得到该化合物的摩尔浓度，计算偶联比，羧基化的多效唑半抗原和BSA的偶联比为10:1，即10个多效唑半抗原所示化合物结合1个BSA。
SDS-PAGE凝胶电泳鉴定，浓缩胶浓度为5％，分离胶浓度为12％，浓缩胶电压60V，分离胶电压80V，上样量为2μg，考马斯亮蓝染色3～4h后，置脱色液中过夜脱色。根据条带分子量的大小变化判断偶联效果。
SDS-PAGE电泳结果表明，如图1所示，BSA的泳动速度大于PBZ-BSA，即PBZ-BSA的分子量大于BSA，证明PBZ已偶联上BSA。
实施例3、多效唑单克隆抗体的制备
Balb/c小鼠：购于大连医科大学实验动物中心；
SP2/0-Ag14小鼠骨髓瘤细胞，ATCCCRL-8287TM。
一、动物免疫
将实施例2制备的PBZ-KLH溶液通过足垫注射方法免疫Balb/c小鼠，每只小鼠单次免疫10μgPBZ-KLH，共免疫10周，每周两次。
二、细胞融合与克隆化
1、最后一次免疫3天后，选择血清效价和特异性最优的小鼠，分离小鼠腘窝淋巴结B细胞，按5:1(数量配比)比例与SP2/0-Ag14骨髓瘤细胞融合，选择性培养基筛选融合细胞，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔。
2、利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，得到一株可以分泌多效唑单克隆抗体的杂交瘤细胞，命名为抗多效唑单克隆抗体杂交瘤细胞5AF3(简称杂交瘤细胞5AF3)。
三、细胞冻存和复苏
用冻存液将杂交瘤细胞5AF3制成1×106个/ml的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时，取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后移入培养瓶内培养。
四、单克隆抗体的制备与纯化
1、增量培养法
细胞培养基的制备方法：向DMEM培养基中添加胎牛血清和碳酸氢钠，胎牛血清的终浓度为20％(质量百分含量)，碳酸氢钠的终浓度为0.2％(质量百分含量)。
将杂交瘤细胞5AF3置于细胞培养基中，37℃培养2天，收集培养液备用。用辛酸-饱和硫酸铵法将得到的培养液进行纯化，得到单克隆抗体(-20℃保存)。
2、腹水制备
取成年Balb/c小鼠，于接种杂交瘤细胞前一周腹腔注射降植烷致敏，每只注射0.5mL，一周以后，将准备好的杂交瘤细胞腹腔注射小鼠，每只0.5mL，细胞量为1×106个，腹水的产生需1-2周，期间密切观察小鼠，若腹部明显胀大，且腹部皮肤有紧张感，即可采集腹水。
抽取腹水：用一只手抓取并固定小鼠，绷紧腹部皮肤，另一只手将针头刺入腹腔1-2cm，针头刺入时应选择右下腹或左下腹，避开上腹部的重要脏器和腹中线的大血管。在针头刺入前，先确保针的尾部已对准10mL塑料离心管，流出的腹水可直接滴入离心管中，再3000rpm离心10min，收集上清液，分装，-20℃冻存备用。
腹水的纯化：采ProteinA柱法纯化腹水。1mL腹水加入2mL0.06mol/LpH4.8的醋酸钠缓冲液，滴加33μL的辛酸，4℃静置2-4h后6000rpm4℃离心30min，收集上清液，按上清液与等体积的2×PBS缓冲液混合，缓慢加入层析柱中，用10倍柱体积以上的PBS洗涤，至流出液无蛋白检出。用0.1MpH3.0的甘氨酸洗脱。测定抗体浓度。使用Millipore蛋白浓缩管浓缩，分装后于-20℃冻存备用。
单克隆抗体中的蛋白质浓度(mg/ml)＝1.45×OD280-0.74×OD260。
采用以上公式计算单克隆抗体中的蛋白质浓度，为18.5mg/ml。
五、单克隆抗体的检测
将步骤四得到的抗血清进行如下检测：
1、采用ELISA单克隆抗体亚型检测试剂盒(Sigma公司产品)检测单克隆抗体的亚型，结果如下表，单克隆抗体的免疫球蛋白亚类为IgG1。
IgG1 0.637
IgG2a 0.068
IgG2b 0.071
IgG3 0.063
IgGM 0.061
2、利用间接ELISA法测定抗体效价
(1)用PBZ-BSA作为包被原包被酶标板
采用实施例2制备的PBZ-BSA溶液(用碳酸盐缓冲液稀释)进行包被，100μL/孔；分别设置以下PBZ-OVA包被浓度：1μg/mL、0.5μg/mL、0.25μg/mL、0.125μg/mL。
(2)4℃孵育16小时。
(3)封闭并洗板。
(4)加一抗：每孔中先加入100μLPBS缓冲液，然后用1:500稀释的抗血清(腹水)从第一孔开始做倍比稀释，浓度依次为1:1000、1:2000、1:4000、1:8000、1:16000、1:32000(以此类推)倍比稀释，每种稀释液设置三个复孔，设空白对照孔。
(5)室温孵育2h，洗板。
(6)每孔加入100μL辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG，室温孵育2h。
(7)洗板。
(8)加入TMB显色液，避光显色10min。
(9)每孔加入100μL2mol/L硫酸中止反应；读OD450nm值。选OD450nm达到1.0-1.5时的抗血清的最大稀释倍数为抗体的效价。
采用间接ELISA测定腹水效价，结果如下表所示。当腹水稀释度为1:25000时，OD450为1.091，故腹水的效价为1:25000。
1:1000 1.944
1:5000 1.305
1:25000 1.091
1:125000 0.823
1:625000 0.862
1:3125000 0.565
空白对照 0.086
3、单克隆抗体IC50测定
采用阻断ELISA鉴定其敏感性及IC50值。步骤和效价测定相似，不同处在于第1步加OD450值为1.0的抗体50μL和不同浓度的PBZ标准品溶液50μL作为抑制剂，即测定抗体对不同浓度PBZ的抑制率。以吸光率(B/B0)(B0为PBZ标准品浓度为0时吸光值，B为PBZ标准品不同浓度的吸光值)为纵坐标，以不同浓度PBZ以10为底的对数值为横坐标，绘制标准抑制曲线，进行相关回归分析，计算单克隆抗体对PBZ的IC50。从图2可知，本例中单克隆抗体对PBZ的IC50值为17.8ng/ml。
本发明制得的单克隆抗体可进一步运用到免疫传感器、胶体金免疫层析法等技术的构建。由于免疫分析方法具有快速、廉价、简便、灵敏、特异的优点，可便携进行现场监测，克服了传统检测方法的缺点。因此该发明具有广阔的应用前景。
实施例4、多效唑多克隆抗体制备
新西兰大白兔：购于大连医科大学实验动物中心。
将4月龄新西兰大白兔以实施例2制备的PBZ-KLH溶液进行免疫(免疫方式为颈背部皮下多点注射)。初次免疫为1.0mg/只，二免、三免、四免剂量为0.5mg/只，共免疫4次。首免，用无菌PBS稀释人工抗原与等量弗氏完全佐剂(FCA)混合，25000r/min充分乳化5min；3周后加强免疫，用无菌PBS稀释人工抗原与等量弗氏不完全佐剂(FIA)混合，25000r/min充分乳化5min，免疫间隔2周。期间各在三免和四免后的第7天，耳静脉采血1mL，ELISA检测抗血清效价。4次免疫10d后，颈动脉采全血，用PBS稀释100倍，3000r/min离心15min，弃沉淀，上层清液即为多克隆抗体溶液，置于-20℃保存。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种多效唑半抗原，其特征在于，所述多效唑半抗原具有如下结构式：
2.权利要求1所述多效唑半抗原的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、按1:1的摩尔比称取多效唑和4-(溴甲基)苯甲酸，0℃溶于四氢呋喃中；向所得四氢呋喃溶液中加入氢化钠，冰浴下搅拌30～60min后，室温下搅拌30～60min；加入碘化钾反应，加热回流10～18h；所述多效唑与四氢呋喃的质量体积比为1:20g/ml，所述多效唑与氢化钠的质量比为10:3，所述多效唑与碘化钾的质量比为(15～20):1；
S2、将步骤S1得到的反应液冷却至室温，加水后，加入2mol/L的盐酸调节pH至5；60～70℃旋蒸除四氢呋喃；所述水的加入量为步骤S1所述多效唑质量的10倍；
S3、用乙酸乙酯萃取步骤S2得到的有机相3～5次；将得到的萃取相通过无水硫酸钠干燥，直至溶剂完全挥干；
S4、将步骤S3得到的残留物用沸程为60～90℃的石油醚与乙酸乙酯按体积比4:1配制成的淋洗液淋洗过硅胶柱；而后，将淋洗液浓缩至多效唑加入量的0.5～0.7倍，所得浓缩液即为多效唑半抗原；所述硅胶柱规格为30g，25cm。
3.一种多效唑抗原，其特征在于，所述多效唑抗原具有如下结构式：
式中：Protein为载体蛋白；
所述载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清白蛋白或钥孔血蓝蛋白。
4.根据权利要求3所述多效唑抗原，其特征在于，所述多效唑抗原为免疫原或检测用包被原。
5.权利要求3所述多效唑抗原的制备方法，其特征在于，多效唑半抗原与载体蛋白通过氨基与羧基的缩合反应偶联，即得到多效唑抗原；所述载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清白蛋白或钥孔血蓝蛋白；。
6.根据权利要求5所述多效唑抗原的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
T1、称取所述多效唑半抗原，溶解于无水二氧六环试剂中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，室温下搅拌反应6个小时，得到溶液A，备用；所述多效唑半抗原、无水二氧六环试剂、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的质量体积比为5～20mg:1～2.5ml:60～120mg:40～60mg；
称取载体蛋白溶于碳酸盐缓冲液中，得到溶液B，备用；所述载体蛋白与碳酸盐缓冲液的质量体积比为20～100mg:3～15ml；
T2、将步骤T1得到的溶液A按所述多效唑半抗原与载体蛋白质量比5～20:30～100的比例加入到溶液B中，室温搅拌10～18h，装入透析袋，在PBS缓冲液中4℃透析72小时，中间置换所述缓冲液6次；8000rmp离心30min，得到的上清液即为多效唑抗原溶液；
步骤T1所述载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清白蛋白或钥孔血蓝蛋白。
7.一种权利要求3所述多效唑抗原制备的抗体，其特征在于，所述抗体通过将所述多效唑抗原刺激动物机体免疫应答获得。
8.根据权利要求7所述多效唑抗原制备的抗体，其特征在于，所述抗体为多效唑单克隆抗体。
9.根据权利要求7所述多效唑抗原制备的抗体，其特征在于，所述抗体为多效唑多克隆抗体。
CN201510756126.6A 2015-11-09 2015-11-09 多效唑半抗原、抗原、抗体及其制备方法 Pending CN105348206A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510756126.6A CN105348206A (zh) 2015-11-09 2015-11-09 多效唑半抗原、抗原、抗体及其制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510756126.6A CN105348206A (zh) 2015-11-09 2015-11-09 多效唑半抗原、抗原、抗体及其制备方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN105348206A true CN105348206A (zh) 2016-02-24

Family

ID=55324291

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510756126.6A Pending CN105348206A (zh) 2015-11-09 2015-11-09 多效唑半抗原、抗原、抗体及其制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105348206A (zh)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106632663A (zh) * 2016-12-28 2017-05-10 江南大学 一种多效唑人工抗原的合成方法
CN106966996A (zh) * 2017-03-17 2017-07-21 海南大学 一种多效唑半抗原及其制备方法和应用
CN110627726A (zh) * 2019-09-23 2019-12-31 北京勤邦生物技术有限公司 咪鲜胺半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法和应用
CN110845429A (zh) * 2019-10-31 2020-02-28 北京勤邦生物技术有限公司 戊唑醇半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法和应用
CN112028786A (zh) * 2020-08-12 2020-12-04 华南农业大学 一种酪胺半抗原、抗原和抗体及其制备方法与应用
CN114133357A (zh) * 2021-11-01 2022-03-04 河南科技大学 一种多效唑人工半抗原的设计方法和应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104327183A (zh) * 2014-10-31 2015-02-04 南昌大学 一种多效唑人工抗原和多克隆抗体的制备方法与应用
CN104356237A (zh) * 2014-10-31 2015-02-18 南昌大学 一种多效唑单克隆抗体的制备方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104327183A (zh) * 2014-10-31 2015-02-04 南昌大学 一种多效唑人工抗原和多克隆抗体的制备方法与应用
CN104356237A (zh) * 2014-10-31 2015-02-18 南昌大学 一种多效唑单克隆抗体的制备方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ZHEN CAO等: "Development of a Sensitive Monoclonal Antibody-Based Enzyme-Linked Immunosorbent Assay for the Analysis of Paclobutrazol Residue in Wheat Kernel", 《JOURNAL OF AGRICULTURAL AND FOOD CHEMISTRY》 *

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106632663A (zh) * 2016-12-28 2017-05-10 江南大学 一种多效唑人工抗原的合成方法
CN106966996A (zh) * 2017-03-17 2017-07-21 海南大学 一种多效唑半抗原及其制备方法和应用
CN110627726A (zh) * 2019-09-23 2019-12-31 北京勤邦生物技术有限公司 咪鲜胺半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法和应用
CN110627726B (zh) * 2019-09-23 2022-07-08 北京勤邦生物技术有限公司 咪鲜胺半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法和应用
CN110845429A (zh) * 2019-10-31 2020-02-28 北京勤邦生物技术有限公司 戊唑醇半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法和应用
CN112028786A (zh) * 2020-08-12 2020-12-04 华南农业大学 一种酪胺半抗原、抗原和抗体及其制备方法与应用
CN112028786B (zh) * 2020-08-12 2022-02-11 华南农业大学 一种酪胺半抗原、抗原和抗体及其制备方法与应用
CN114133357A (zh) * 2021-11-01 2022-03-04 河南科技大学 一种多效唑人工半抗原的设计方法和应用
CN114133357B (zh) * 2021-11-01 2023-07-25 河南科技大学 一种多效唑人工半抗原的设计方法和应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105348206A (zh) 多效唑半抗原、抗原、抗体及其制备方法
CN104017070B (zh) 一种高灵敏度的多菌灵完全抗原的合成方法
WO2020034547A1 (zh) 一种分泌噻虫嗪单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用
CN104356237A (zh) 一种多效唑单克隆抗体的制备方法
CN112877296A (zh) 一种抗非那西丁单克隆抗体杂交瘤细胞株ad及其制备方法与应用
CN113637081A (zh) 一株分泌抗二甲戊灵单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用
CN110627726B (zh) 咪鲜胺半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法和应用
CN114107219B (zh) 一株分泌杀虫脒单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用
CN105838681A (zh) 一株抗地塞米松特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株c3及其应用
CN112574957B (zh) 一株分泌异噁草酮单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用
CN101921730B (zh) 一种莱克多巴胺的单克隆抗体、其制备方法及应用
CN110950962B (zh) 一株分泌双咪苯脲单克隆抗体的杂交瘤细胞株a11s及其应用
CN110343669B (zh) 一株分泌抗三氯苯达唑单克隆抗体的杂交瘤细胞株dnc及其应用
CN111763658A (zh) 一株分泌抗二硝托胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用
CN114836387B (zh) 一株11-α羟孕酮单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用
CN114181911B (zh) 一种分泌螺内酯及其代谢物单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用
CN113774030B (zh) 一株分泌抗氨氯吡啶酸单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用
CN114032215B (zh) 一种分泌红2g单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用
CN114752568A (zh) 呋塞米单克隆抗体、杂交瘤细胞株及应用
CN110616193B (zh) 一株分泌抗甜蜜素单克隆抗体的杂交瘤细胞株bcb及其应用
CN110616194A (zh) 一株乌头碱单克隆抗体细胞株sj及其应用
CN114774368B (zh) 一株分泌抗丙炔氟草胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用
CN115322969B (zh) 抗敌菌灵单克隆抗体、单克隆细胞株及应用
CN114480295B (zh) 一株分泌抗仲丁灵单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用
CN114277000B (zh) 一株分泌稻瘟灵单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20160224

RJ01 Rejection of invention patent application after publication