CN114032215B - 一种分泌红2g单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用 - Google Patents

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Abstract

一种红2G人工抗原的合成方法，属于生物化工技术领域，其单克隆抗体的杂交瘤细胞株XMTL及其应用，属于食品安全免疫检测领域。本发明所述杂交瘤细胞株XMTL分泌的单克隆抗体，对红2G具有较好的特异性和检测灵敏度(IC50值为2ng/mL)，可实现对偶氮类酸性工业染料被用做食品添加剂染色的红2G残留量的检测，为食品中红2G残留的免疫检测提供了原料，具有实际应用价值。本发明还成功合成了红2G人工抗原，合成步骤简洁，有效，完全可用于免疫分析中，为以后人们的研究提供了必需的人工抗原。

Description

一种分泌红2G单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用
技术领域
本发明属于食品安全免疫检测技术领域，尤其是指一种分泌红2G单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用。
背景技术
红2G(Red 2G)，化学名5-(乙酰基氨基)-4-羟基-3(苯基偶氮)-2,7-萘二磺酸二钠盐，又称酸性红1、食品红10，一种人工合成的偶氮类染料，这类偶氮染料色泽鲜艳，着色性好，成本低，主要用于毛织物的染色及毛、丝、锦纶织物的印花，也可用于制造色淀、墨水及化妆品、纸张、肥皂、木材等着色。研究证实偶氮类色素含有偶氮键结构、萘环或有氧杂蒽结构化合物，在体内生物转化过程中，生成胺基化合物，具有致癌性。2007年欧盟宣布禁止在食品中使用红2G，随后中国等国家也明确禁止食品中使用红2G。然而，近几年来，食品中非法添加红2G着色的现象屡有发生。因此，如何在此类食品中有效、准确地检出这类非食用色素成为当前食品安全研究的热点之一。
近年来对于人工染料的检测主要是比色和仪器分析。酶联免疫法(ELISA)是一种高效、敏感、快速的检测方法，也越来越多地应用于食品安全检测中。制备高亲和力和高特异性的单克隆抗体是免疫学检测的前提，其中人工抗原的合成是其中重要的一步。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种分泌红2G单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用。
一株红2G单克隆抗体杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株于2021年05月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号CGMCC No.22337。
在本发明的一个实施例中，所述的单克隆抗体杂交瘤细胞株的制备方法，包括以下步骤：
S1：利用红2G半抗原(R2G-PABA)制备红2G完全抗原(R2G-PABA-EDC-BSA)；
S2：将红2G完全抗原与完全弗氏佐剂制备得到免疫原1，所得红2G完全抗原和不完全弗氏佐剂乳化得到免疫原2；
S3：将S2中所得免疫原1对小鼠进行皮下免疫；
S4：将S3中免疫后的小鼠使用S2中免疫原2进行加强免疫，并使用红2G完全抗原进行冲刺免疫；
S5：取S4中冲刺免疫后的小鼠的脾细胞，与骨髓瘤细胞进行细胞融合，得到所述杂交瘤细胞株。
在本发明的一个实施例中，所述红2G半抗原结构式：
Figure BDA0003440907470000021
在本发明的一个实施例中，所述红2G半抗原通过以下方法制备得到：
(1)称取化合物
Figure BDA0003440907470000022
溶于有机溶剂，酸性条件下搅拌反应，并加入NaNO2水溶液至淀粉碘化钾试纸变蓝，搅拌反应得到A液；
(2)称取化合物
Figure BDA0003440907470000031
加入到溶剂中得到B液；所述溶剂为纯水、乙醇、Na2CO3溶液、NaHCO3溶液或NaOH溶液等。
(3)将A液加到B液中，并调节pH到8-9，在0-4℃下搅拌反应1-2h后，调节反应液pH至3-4，即得到所述红2G半抗原。
在本发明的一个实施例中，(1)中，所述有机溶剂为DMF。
在本发明的一个实施例中，(1)中，酸性条件是向反应溶液中加入2-3mL盐酸溶液，所述盐酸溶液浓度为0.5-1M。
在本发明的一个实施例中，(1)中，加入的NaNO2水溶液的浓度为10％-30％(w/v)。
在本发明的一个实施例中，(1)中，滴加NaNO2水溶液直到反应液使得碘化钾试纸变蓝。
在本发明的一个实施例中，
Figure BDA0003440907470000032
与
Figure BDA0003440907470000033
的摩尔比为(1-2)：1。
在本发明的一个实施例中，所述红2G完全抗原通过以下方法制备得到：将所述红2G半抗原与载体蛋白偶联得到所述红2G完全抗原。
在本发明的一个实施例中，S1中，所述红2G完全抗原的具体制备方法为：取R2G-PABA、N-羟基琥珀酰亚胺与1-乙基碳二亚胺盐酸盐，溶于有机溶剂中(称为A液)，室温搅拌反应4-6h，称取载体蛋白(R2G-PABA与载体蛋白摩尔比为20-40：1)，加入碳酸盐缓冲溶液(称为B液)，在室温条件，将A液逐滴加入到B液中，用NaOH溶液调混合液的pH为8-9，室温反应过夜，即得所述红2G完全抗原。
在本发明的一个实施例中，所述蛋白载体为牛血清白蛋白BSA或卵清白蛋白OVA。
在本发明的一个实施例中，S3和S4中，小鼠的具体免疫过程：首次免疫时以注射免疫80-100μg/只小鼠的量将红2G的完全抗原与等量完全弗氏佐剂混合乳化得到免疫原1，通过颈背部皮下多点注射免疫BALB/c小鼠；时隔4周后进行加强免疫，完全抗原的剂量减半(40-50μg/只)，用不完全弗氏佐剂混合乳化得到的免疫原2，之后多次的加强免疫时间间隔3周；冲刺免疫时剂量再减半(20-25μg/只)，红2G的完全抗原用生理盐水稀释，对小鼠进行腹腔注射。小鼠第三次免疫后可进行断尾采血检测，通过间接竞争酶联免疫法(ic-ELISA)检测小鼠血清的效价和IC50，选择效价高、IC50低的小鼠进行融合。
在本发明的一个实施例中，S5中，细胞融合与细胞株建立：通过聚乙二醇(PEG4000)法将小鼠脾细胞和SP2/0瘤细胞进行融合，采用选择性培养基(HAT培养基)筛选出杂交瘤细胞，并用HT培养基进行细胞培养。融合一周后利用ic-ELISA法检测阳性细胞孔及阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对抑制较好的阳性细胞孔进行亚克隆，一周后再次检测、挑孔、亚克隆。按上述方法进行四次亚克隆后获得红2G的高分泌特异抗体的单克隆杂交瘤细胞株XMTL。
本发明还提供了一种所述的所述杂交瘤细胞株在制备红2G单克隆抗体中的应用。
一种红2G单克隆抗体，所述红2G单克隆抗体是由所述的杂交瘤细胞株分泌所得。
本发明还提供了所述的红2G单克隆抗体在检测红2G中的应用。
一种组合物，所述组合物包括所述的红2G单克隆抗体。
本发明还提供了所述的组合物在检测红2G中的应用。
本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：
本发明成功合成了红2G的人工抗原，合成步骤简洁，有效，完全可用于免疫分析中，为以后人们的研究提供了方便的途径；提供的细胞株XMTL分泌的单克隆抗体，对红2G具有较好的特异性和检测灵敏度(IC50值为2ng/mL)，可实现在肉制品中检测红2G残留提供了免疫检测方法和原料，具有实际应用价值。
生物材料样品保藏：一株红2G单克隆抗体杂交瘤细胞株XMTL，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期2021年05月13日，保藏编号为CGMCC No.22337。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中
图1是本发明所述单克隆抗体对红2G的标准抑制曲线。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
实施例1半抗原R2G-PABA的合成
合成路线如下：
一种红2G人工抗原的合成方法，其由对氨基苯甲酸与8-氨基-1-萘酚-3,6-二磺酸单钠盐经过重氮法反应得到具有羧基的产物，即半抗原R2G-PABA，用碳二亚胺法将半抗原R2G-PABA与载体蛋白偶联，即得到红2G人工抗原；步骤为：
(1)半抗原R2G-PABA的合成：
合成路线如下：
Figure BDA0003440907470000061
反应A液：称取化合物1(1.73g，10.0mmol)溶于2mL的DMF后，加入3mL的HCl(1M)溶液，室温下搅拌15min，逐滴加入10％的NaNO2，直至碘化钾试纸变蓝，然后继续4℃下搅拌30min，得到A液。
反应B液：称取化合物2(3.59g，10.0mmol)加入到饱和3mLNa2CO3溶液中，冷却至4℃，得到B液。
将A液缓缓滴加到B液中，调pH为8-9，4℃搅拌2h，得到红色稠状物；最后，用盐酸调节溶液pH至3.0，继续4℃搅拌30min，减压过滤,得到红色残余物(约4.1g)，37℃烘干，得到粗产物，即为半抗原R2G-PABA。
(2)完全抗原的制备：步骤(1)制备的半抗原R2G-PABA，与牛血清白蛋白BSA偶联得到完全抗原R2G-PABA-EDC-BSA；或与卵清白蛋白OVA偶联得到完全抗原R2G-PABA-EDC-OVA。
所述红2G人工抗原的合成方法，步骤(2)所述完全抗原R2G-PABA-EDC-BSA制备方法如下：
a、称取步骤(1)称取2.1mg R2G-PABA，N-羟基琥珀酰亚胺1.6mg，1-乙基碳二亚胺盐酸盐2.6mg，用400μLN,N-二甲基甲酰胺溶解(称为A液)，室温搅拌反6h。称取BSA 10.0mg(R2G-PABA与BSA摩尔比为30:1)，加入3mL碳酸盐缓冲溶液(称为B液)，在室温条件，将A液逐滴加入到B液中，用1M NaOH溶液调混合液的pH为8-9，室温反应过夜，即得偶联物R2G-PABA-EDC-BSA；偶联R2G-PABA-EDC-OVA方法与上述方法类似。
b、透析：剪取8cm的透析袋，于沸水中煮沸3min并冷却，保存在4℃去离子水中备用；将偶联物R2G-PABA-EDC-BSA/OVA偶联液放入透析袋于0.01M的PBS中透析，每8h更换一次，透析3天，即得完全抗原R2G-PABA-EDC-BSA/OVA，取出先用紫外分光光度法进行偶联物的表征，后保存于-20℃。
实施例3小鼠的免疫
首次免疫时以注射免疫100μg/只小鼠的量将红2G的完全抗原与等量完全弗氏佐剂混合乳化，通过颈背部皮下多点注射免疫BALB/c小鼠；时隔4周后进行加强免疫，完全抗原的剂量减半(50μg/只)，用不完全弗氏佐剂混合乳化，之后多次的加强免疫时间间隔3周；冲刺免疫时剂量再减半(25μg/只)，完全抗原用生理盐水稀释，对小鼠进行腹腔注射。小鼠第三次免疫后可进行断尾采血检测，通过间接竞争酶联免疫法(ic-ELISA)检测小鼠血清的效价和IC50，选择效价高、IC50低的小鼠进行融合。
实施例4细胞融合与筛选
(1)在冲刺免疫三天后，按照常规PEG 4000(聚乙二醇)方法进行细胞融合，具体步骤如下：
a、收集SP2/0瘤细胞：融合前7-10天，将SP2/0瘤细胞用含10％FBS(胎牛血清)RPMI-1640培养基在5％CO2培养箱中培养。融合前要求SP2/0瘤细胞数量达到1-4×107，保证融合前SP2/0瘤细胞处于对数生长期。融合时，收集瘤细胞，悬浮于RPMI-1640基础培养液中，进行细胞计数；
b、脱颈法处死小鼠后，立即放入75％酒精中灭菌，浸泡5min左右，无菌操作取出小鼠的脾脏，用注射器胶头适度研磨并通过200目细胞筛网得到脾细胞悬液。收集到50mL无菌离心管后1200r/min离心8min，用RPMI-1640培养基洗涤脾细胞，挑出较打的组织杂质，重复操作三次。最后一次离心后，将脾细胞稀释到一定体积，计数，备用；
c、融合过程7min：第1min，将1mL的PEG 4000由慢到快滴加到细胞中；第2min，静置并双手紧握离心管。第3min和第4min，在1min内滴加1mL RPMI-1640培养基；第5min和第6min，每30s内滴加1mL RPMI-1640培养基；第7min，每10s滴加1mL的RPMI-1640培养基。然后37℃下温浴5min。800r/min离心10min，弃上清，轻轻敲散离心管内的细胞，并向其中加入含20％胎牛血清，2％50×HAT的RPMI-1640选择性培养基(HAT培养基)，按照200μL/孔加到96孔细胞板，置于37℃，5％CO2培养箱中培养。
(2)细胞筛选与细胞株建立：在细胞融合后的第3天用HAT培养基对融合细胞进行半换液；第5天用含20％胎牛血清，1％的100×HT的RPMI-1640过渡培养液(HT培养基)进行全换液；第7天取细胞上清进行筛选。筛选分两步：第一步先用ic-ELISA法筛选出阳性细胞孔，第二步选用红2G标准品，用ic-ELISA法对阳性细胞进行抑制效果测定。选择对红2G标准品有较好抑制的细胞孔，采用有限稀释法进行亚克隆，七天后用同样的方法进行检测。按上述方法进行四次亚克隆，最终获得红2G单克隆抗体细胞株XMTL。
实施例5单克隆抗体的制备与鉴定
取8-10周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射1mL无菌石蜡油；7天后每只小鼠腹腔注射2×106红2G杂交瘤细胞，从第七天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-饱和硫酸铵法进行抗体纯化。在偏酸条件下，正辛酸可以沉淀腹水中除IgG免疫球蛋白外的其他杂蛋白，然后离心，弃沉淀；再用等量饱和度的硫酸铵溶液沉淀IgG型的单克隆抗体，离心，弃上清，用0.01M PBS溶液(pH为7.4)溶解后，透析脱盐，最终得到纯化后的单克隆抗体置于-20℃保存。
(1)包被：将包被原R2G-PABA-EDC-OVA用0.05M(pH为9.6)碳酸盐缓冲液从0.3μg/mL开始3倍往下稀释，100μL/孔，37℃反应2h。
(2)洗涤：将板内溶液倾去，并用洗涤液洗涤3次，每次3min。
(3)封闭：拍干后，加入200μL/孔封闭液，37℃反应2h。洗涤后烘干备用。
(4)加样：将抗血清(小鼠断尾采血后，以抗体稀释液稀释相应倍数后即抗血清)从1:3000开始倍比稀释，并加入到各稀释度的包被孔中，100μL/孔，37℃反应30min；充分洗涤后，加入1:3000稀释的HRP-羊抗鼠IgG，100μL/孔，37℃反应30min。
(5)显色：将酶标板取出，充分洗涤后，每孔加入100μL的TMB显色液，37℃避光反应15min.
(6)终止和测定：每孔加入50μL终止液以终止反应，然后用酶标仪测定各孔的OD450值。
用ic-ELISA测定单克隆抗体红2G的IC50为：2ng/mL，说明对红2G有很好的灵敏度，可用于红2G免疫分析检测。
溶液的配置：
碳酸盐缓冲液(CBS)：称取Na2CO3 1.59g，NaHCO3 2.93g，分别溶于少量双蒸水后混合，加双蒸水至约800mL混匀，调pH值至9.6，加双蒸水定容至1000mL，4℃贮存备用。
磷酸盐缓冲液(PBS)：8.0g NaCl，0.2g KCl，0.2g KH2PO4，2.9g Na2HPO4·12H2O，溶于800mL纯水中，用NaOH或HCl调pH到7.2-7.4，定容至1000mL；
PBST：含0.05％吐温20的PBS；
TMB显色液：A液：Na2HPO4·12H2O 18.43g，柠檬酸9.33g，纯水定容至1000mL；B液：60mg TMB溶于100mL乙二醇中。A、B液按5：1混合即为TMB显色液，现用现混。
特异性实验
使用间接竞争ELISA法，测定单克隆抗体对红2G的IC50为2ng/mL，并验证其对酸性品红6B等化合物的IC50及交叉反应率，交叉反应值计算如下：
(红2G的IC50/其他化合物的IC50)×100％，具体如表1所示，
交叉物：酸性品红6B，酸性红37，丽春红2R，苋菜红，胭脂红，8-氨基-1-萘酚-3,6-二磺酸单钠盐。
该单克隆抗体对红2G的交叉为100％，其中对酸性品红6B的交叉率为34％，对酸性红37，丽春红2R，苋菜红，胭脂红，8-氨基-1-萘酚-3,6-二磺酸单钠盐这5种的交叉均小于10％。说明本发明所得单克隆抗体对红2G有较高灵敏度，IC50值为2ng/mL；也可以检测酸性品红6B，IC50为5.8ppb，说明该单克隆抗体具有高灵敏度和特异性。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (6)

1.一株红2G单克隆抗体杂交瘤细胞株，其特征在于，所述单克隆抗体杂交瘤细胞株于2021年05月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号CGMCC No.22337。
2.权利要求1所述的杂交瘤细胞株在制备红2G单克隆抗体中的应用。
3.一种红2G单克隆抗体，其特征在于，所述红2G单克隆抗体是由权利要求1所述的杂交瘤细胞株分泌所得。
4.如权利要求3所述的红2G单克隆抗体在检测红2G中的应用。
5.一种组合物，其特征在于，所述组合物包括权利要求3中所述的红2G单克隆抗体。
6.如权利要求5所述的组合物在检测红2G中的应用。
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