CN113717947A - 一株分泌莫达非尼单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株分泌莫达非尼单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用，属于食品安全免疫检测领域。本发明提供了两个莫达非尼半抗原，制备了莫达非尼完全抗原，并将它与等量弗氏佐剂混合乳化完全，进行小鼠免疫实验，取高效价、低IC₅₀小鼠脾细胞，通过PEG方法与骨髓瘤细胞融合，经过间接竞争酶联免疫法的筛选和三次亚克隆，得到杂交瘤细胞株。此细胞株分泌的单克隆抗体，对莫达非尼具有较好的特异性和检测灵敏度(IC₅₀为0.54ng/mL)。本发明成果可用于建立人血浆中莫达非尼含量的免疫检测方法，具有实际应用价值。

Description

一株分泌莫达非尼单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用

技术领域

本发明属于人血浆中免疫检测技术领域，尤其是指一株分泌莫达非尼单 克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用。

背景技术

莫达非尼(modafinil)为觉醒促进药，用于治疗发作性嗜睡症和自发性 嗜睡症以及阻塞性睡眠呼吸暂停综合征和倒班工作所致的睡眠紊乱等症的 过量睡眠以及提高其头脑清醒度。滥用莫达非尼药物可能导致认知功能受 损，尤其在注意力、工作记忆和反应抑制力等方面。因此，有必要建立快速、 高效的人血浆中莫达非尼的检测方法。

莫达非尼含量分析方法有高效液相色谱法(HPLC)、HPLC-UV法等仪器 方法，这些检测方法具有耗时、步骤繁琐、无法进行现场快速检测、成本高 等缺点，因此建立快速简便的莫达非尼检测方法具有重要意义。酶联免疫法 (ELISA)是一种极为高效、敏感、快速的检测方法，适用于大量样本的现 场快速检测，为莫达非尼检测提供了一种新的检测途径。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一株分泌莫达非尼单克隆抗体的杂 交瘤细胞株及其应用。

本发明提供了一株分泌莫达非尼单克隆抗体的杂交瘤细胞株，所述杂交 瘤细胞株保藏于2021年05月13日提交至中国微生物菌种保藏管理委员会 普通微生物中心，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为 CGMCC No.22323，所述杂交瘤细胞株WZC为单克隆细胞株。

本发明提供了一株杂交瘤细胞株的制备方法，包括以下步骤：

S1：将莫达非尼半抗原、1-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺混 合溶解于有机溶剂搅拌反应得到A1液，将牛血清白蛋白溶解于硼酸盐缓冲 溶液，得到B1液，将所得A1液加入B1液中，搅拌反应得到偶联物莫达非 尼-BSA，将所得偶联物莫达非尼-BSA与完全弗氏佐剂混合乳化得到免疫原 1，将所得偶联物莫达非尼-BSA与不完全弗氏佐剂混合乳化得到免疫原2；

S2：将S1中所得免疫原1对小鼠进行皮下免疫；

S3：将S2中免疫后的小鼠使用S1中免疫原2再进行加强免疫，并使 用S1中所述偶联物莫达非尼-BSA进行冲刺免疫；

S4：取S3中冲刺免疫后的小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞，进行细胞融合， 得到所述杂交瘤细胞株。

所述莫达非尼半抗原的结构式如式(1)或式(2)所示：

本发明提供了一种杂交瘤细胞株在制备莫达非尼单克隆抗体中的应用。

本发明提供了一种莫达非尼单克隆抗体，是由所述的杂交瘤细胞株分泌 所得。

所述的莫达非尼单克隆抗体在检测莫达非尼中的应用。

一种检测莫达非尼的方法，所述方法是利用所述的莫达非尼单克隆抗 体。

本发明提供了一种组合物，所述组合物包括所述的莫达非尼单克隆抗 体。

所述的组合物在检测莫达非尼中的应用。

本发明提供了一种试剂盒，包括所述的莫达非尼单克隆抗体。

所述的试剂盒在检测莫达非尼中的应用。

本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：

本发明公开的莫达非尼单克隆抗体杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体，对 莫达非尼具有较好的特异性和检测灵敏度(IC₅₀值为0.54ng/mL)，为检测 人血浆中莫达非尼含量提供了免疫学方法。本发明提供的莫达非尼单克隆抗 体杂交瘤细胞株及其分泌的单克隆抗体可制成用于检测莫达非尼的试剂盒， 具有实际应用价值。

附图说明

为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施 例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中

图1是本发明4F5单克隆抗体对莫达非尼的抑制标准曲线。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术 人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的 限定。

本发明所用材料：

碳酸盐缓冲液(CBS)：称取Na₂CO₃1.59 g，NaHCO₃2.93 g，分别溶于 少量双蒸水后混合，加双蒸水至约800mL混匀，调pH值至9.6，加双蒸水定 容至1000mL，4℃贮存备用。

磷酸盐缓冲液(PBS)：8.0g NaCl，0.2g KCl，0.2g KH₂PO₄，2.9g Na₂HPO₄·12H₂O，溶于800mL纯水中，用NaOH或HCl调pH到7.2～7.4， 定容至1000mL；

洗涤液(PBST)：1000mL的0.01mol/LpH7.4的PBS溶液中加入0.5mL 的Tween-20；

PBST：含0.05％Tween-20的PBS；

抗体稀释液：含有0.1％明胶的洗涤缓冲液；

TMB显色液：A液：Na₂HPO₄.12H₂O 18.43g，柠檬酸9.33g，纯水定容 至1000mL；B液：60mg TMB溶于100mL乙二醇中。A、B液按体积比1:5 混合即为TMB；显色液，现用现混。

本发明通过将莫达非尼完全抗原免疫小鼠，通过细胞融合，HAT选择 性培养基培养，通过ic-ELISA筛选细胞上清，最终得到了对莫达非尼有较 好特异性和灵敏度的单克隆抗体杂交瘤细胞株。

实施例1 杂交瘤细胞株4F5的制备

(1)免疫原的制备：

称取3.64mg莫达非尼半抗原，1-乙基碳二亚胺盐酸盐7.58mg，N-羟基 琥珀酰亚胺4.57mg，用800μL无水N,N-二甲基甲酰胺溶解，得到A1液， 室温搅拌反应6h。取牛血清蛋白BSA 10mg，用2mL 0.1M硼酸盐缓冲溶液 溶解，得到B1液，在室温条件，逐滴将A1液加入到B1液中，室温反应8h， 即得偶联物莫达非尼-BSA混合液，通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子 半抗原，得到偶联物莫达非尼-BSA。

所述莫达非尼半抗原的结构式为：

(2)包被原莫达非尼-OVA的制备：

称取1.82mg莫达非尼半抗原，1-乙基碳二亚胺盐酸盐3.84mg，N-羟基 琥珀酰亚胺2.30mg，用800μL无水N,N-二甲基甲酰胺溶解，得到A2液， 室温搅拌反应6h。称取10mg鸡卵清白蛋白OVA，溶解于2mL 0.1M硼酸 盐缓冲溶液中，得到B2溶液，在室温条件下，逐滴将A2液加入到B2液中， 室温反应8h，即得偶联物莫达非尼-OVA混合液，通过透析分离包被原和未 偶联的小分子半抗原。包被原用于单克隆抗体制备过程中小鼠血清效价和抑 制的检测，并不直接用于小鼠，是制备单抗必需的。

所述莫达非尼半抗原的结构式为：

(3)动物免疫：选择健康的6～8周龄的BALB/c小鼠进行免疫。取三种 不同摩尔比的莫达非尼完全抗原与等量弗氏佐剂混合乳化后，通过背部皮下 注射分别免疫BALB/c小鼠。第一次免疫用完全弗氏佐剂(100μg/只)，之后 都用不完全弗氏佐剂。首次免疫与第二次加强免疫(50μg/只)之间间隔28 天，多次加强免疫之间间隔21天。第三次免疫后7天采血(小鼠断尾采血5uL +995uL抗体稀释液＝抗血清)，使用ic-ELISA测定小鼠血清效价和抑制，选 择效价高抑制好的小鼠，在第五次免疫后21天冲刺免疫(25μg/只)，腹腔注 射，要求冲免剂量减半且不含任何佐剂。

(4)细胞融合：在冲刺免疫三天后，按照常规PEG(聚乙二醇，分子量 为4000)方法进行细胞融合，具体步骤如下：

a、摘眼球取血，颈椎脱臼法处死小鼠后，立即放入75％酒精中消毒，浸 泡5min左右，无菌操作取出小鼠的脾脏，用注射器的胶头适度研磨并通过 200目细胞筛网得到脾细胞悬液，收集，并离心(1200rpm，8min)，用 RPMI-1640培养基洗涤脾细胞三次，最后一次离心后，将脾细胞稀释到一定 体积，计数，备用；

b、收集SP2/0细胞：融合前7-10天，将SP2/0瘤细胞用含10％FBS(胎 牛血清)RPMI-1640培养基在5％CO₂培养箱中。融合前要求SP2/0瘤细胞数 量达到1～4×10⁷，保证融合前SP2/0瘤细胞处于对数生长期。融合时，收集瘤 细胞，悬浮于RPMI-1640基础培养液中，进行细胞计数；

c、融合过程7min。第1min，将1mL的PEG 1500由慢到快滴加到细胞 中；第2min，静置。第3min和第4min，在1min内滴加1mL RPMI-1640 培养基；第5min和第6min，在1min内滴加2mL RPMI-1640培养基；第7 min，每10s滴加1mL的RPMI-1640培养基。然后37℃温浴5min。离心 (800rpm，8min)，弃上清，重悬入含20％胎牛血清，2％的50×HAT的RPMI-1640筛选培养液中，按照200μL/孔加到96孔细胞板，置于37℃，5％ CO₂培养箱中培养。

(5)细胞筛选与细胞株建立：在细胞融合的第3天对融合细胞进行 RPMI-1640筛选培养液半换液，第5天进行用含20％胎牛血清，1％的100×HT 的RPMI-1640过渡培养液进行全换液，在第7天取细胞上清进行筛选。筛选 分两步：第一步先用ic-ELISA筛选出阳性细胞孔，第二步选用莫达非尼为标 准品，用ic-ELISA对阳性细胞进行抑制效果测定。选择对莫达非尼标准品均 有较好抑制的细胞孔，采用有限稀释法进行亚克隆，用同样的方法进行检测。 重复三次，获得细胞株。

(6)单克隆抗体的制备与鉴定：取8-10周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹 腔注射无菌石蜡油1mL；7天后每只小鼠腹腔注射1×10⁶杂交瘤细胞，从第 七天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-硫酸铵法纯化。在偏酸条件下，正辛酸 可以沉淀腹水中除IgG免疫球蛋白外的其他杂蛋白，然后离心，弃沉淀；再 用等量饱和度的硫酸铵溶液沉淀IgG型的单克隆抗体，离心，弃上清，用0.01M PBS溶液(pH 7.4)溶解后，透析脱盐，最终得到纯化后的单克隆抗体置于-20℃ 保存。

实施例2 莫达非尼单克隆抗体的IC₅₀的测定

测定步骤为：

(1)包被：将包被原莫达非尼-OVA用0.05M pH 9.6碳酸盐缓冲液从1 μg/mL开始倍比稀释，100μL/孔，37℃反应2h。

(2)洗涤：将板内溶液倾去，并用洗涤液洗涤3次，每次3min.

(3)封闭：拍干后，加入200μL/孔封闭液，37℃反应2h。洗涤后烘干 备用。

(4)加样：将抗血清(小鼠断尾采血后，以抗体稀释液稀释相应倍数后 即抗血清)从1:1000开始倍比稀释，并加入到各稀释度的包被孔中，100μL/ 孔，37℃反应30min；充分洗涤后，加入1:3000稀释的HRP-羊抗鼠IgG，100 μL/孔，37℃反应30min。

(5)显色：将酶标板取出，充分洗涤后，每孔加入100μL的TMB显色 液，37℃避光反应15min。

(6)终止和测定：每孔加入50μL终止液以终止反应，然后用酶标仪测 定各孔的OD₄₅₀值。

用ic-ELISA测定单克隆抗体莫达非尼的IC₅₀为0.54ng/mL，说明对莫达 非尼有很好的灵敏度，可用于莫达非尼免疫分析检测。

实施例3：特异性实验-交叉反应

采用ELISA检测方法测试了几种与莫达非尼作用相似的药物的交叉反应 性，交叉反应值计算如下：

(莫达非尼的IC₅₀/化合物的IC₅₀)×100；

交叉物：[(S)-(二苯基甲基)亚磺酰基]乙酸、利他林、苯丙胺。

实验结果见表1：

表1

由表1实验结果可知，本发明所得莫达非尼单克隆抗体只对莫达非尼有 抑制，IC₅₀值为0.54ng/mL，对类似物的交叉都小于1％，说明该单克隆抗体 具有很高的灵敏度和特异性。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的 限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出 其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而 由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.一株分泌莫达非尼单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于，所述杂交瘤细胞株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.22323。

2.如权利要求1中所述的杂交瘤细胞株的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：将莫达非尼半抗原、1-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺混合溶解于有机溶剂搅拌反应得到A1液，将牛血清白蛋白溶解于硼酸盐缓冲溶液，得到B1液，将所得A1液加入B1液中，搅拌反应得到偶联物莫达非尼-BSA，将所得偶联物莫达非尼-BSA与完全弗氏佐剂混合乳化得到免疫原1，将所得偶联物莫达非尼-BSA与不完全弗氏佐剂混合乳化得到免疫原2；

S2：将S1中所得免疫原1对小鼠进行皮下免疫；

S3：将S2中免疫后的小鼠使用S1中免疫原2再进行加强免疫，并使用S1中所述偶联物莫达非尼-BSA进行冲刺免疫；

S4：取S3中冲刺免疫后的小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞，进行细胞融合，得到所述杂交瘤细胞株。

3.根据权利要求2中所述的制备方法，其特征在于，所述莫达非尼半抗原的结构式如式(1)或式(2)所示：

4.权利要求1中所述杂交瘤细胞株在制备莫达非尼单克隆抗体中的应用。

5.一种莫达非尼单克隆抗体，其特征在于，所述莫达非尼单克隆抗体是由权利要求1中所述的杂交瘤细胞株分泌所得。

6.如权利要求5中所述的莫达非尼单克隆抗体在检测莫达非尼中的应用。

7.一种组合物，其特征在于，所述组合物包括权利要求5中所述的莫达非尼单克隆抗体。

8.如权利要求7中所述的组合物在检测莫达非尼中的应用。

9.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求5中所述的莫达非尼单克隆抗体。

10.如权利要求9中所述的试剂盒在检测莫达非尼中的应用。

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