CN110746286B - 一种丁香酚半抗原、人工抗原及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种丁香酚半抗原、人工抗原及其制备方法与应用。本发明所提供的丁香酚人工抗原为将式I所示的丁香酚半抗原与载体蛋白偶联所得的抗原。本发明所提供丁香酚人工抗原合成方法简单，纯度高和产率高，对于丁香酚抗体的制备，以及丁香酚药物残留检测具有重大价值。

Description

一种丁香酚半抗原、人工抗原及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于药物残留快速检测领域，涉及一种丁香酚人工抗原及其制备方法与应用。
背景技术
丁香酚为芳香油中提取得到的一种难溶于水的带有芳香气味的淡黄色液体，因其麻醉效果好和成本低且休药期短而作为鱼用麻醉剂被广泛运用到鲜活水产品的运输和保鲜上，但其残留具有肝脏毒性，可引起肠胃炎和厌食症，并具有潜在的致癌性等，威胁到动物生产，通过食物链进入人体后危害人们身体健康。丁香酚在水产品收贮运环节的广泛应用，使得建立一种高效灵敏的丁香酚药物残留分析方法成为日益迫切的需要。
目前对于丁香酚的检测方法，主要有液相色谱法、气相色谱法、气相色谱－质谱联用法和液相色谱－质谱联用法，虽然这些方法特异性强、灵敏度高，但是操作繁琐、仪器昂贵，不适用于大批量样品的筛选检测。免疫化学分析法在抗原抗体的定性定量方面具有独特的优势，其操作简便快速、成本低、灵敏度较高、分析样本量大，弥补了理化分析的不足。
影响免疫化学分析质量的根本因素是抗体的特异性与亲和性，这些性质又决定于免疫半抗原分子的结构，因此免疫半抗原的分子设计与合成是产生特异性抗体和建立小分子兽药残留快速检测技术的最基础、最关键的步骤。
发明内容
本发明的目的是提供一种丁香酚人工抗原及其制备方法与应用。
本发明所提供的丁香酚人工抗原是在丁香酚半抗原的基础上构建所得的抗原。
所述丁香酚半抗原属于本发明的保护范围，其结构如式I所示。
式I
本发明所提供的制备所述丁香酚半抗原的方法，具体可包括如下步骤：
1、丁香酚溶解于甲苯中，再加入Ph3P=CHCOOEt的甲苯溶液反应，获得反应液。所述丁香酚、甲苯、Ph3P=CHCOOEt的配比为500mg：5ml：1045mg，所述加入反应时间为5个小时，所述反应温度为80℃。
2、反应液降温旋干，残余物经复溶、洗涤、干燥获得中间体1，中间体1加入甲醇复溶残余物，再加入氢氧化钠反应，反应液经去甲醇、调pH、萃取、干燥、旋干获得丁香酚半抗原460mg。所述复溶液为5ml甲苯，所述洗涤液为碳酸钠溶液，所述干燥剂为2g无水硫酸钠，所述甲醇复溶残余物、氢氧化钠的配比为5ml：2ml，所述调pH为稀盐酸调pH=2-3，所述萃取液为15ml乙酸乙酯。
在丁香酚半抗原的基础上构建所得的丁香酚抗原也属于本发明的保护范围。
所述丁香酚抗原，为将所述丁香酚半抗原（式I）与载体蛋白偶联所得的抗原。在本发明的一个实施例中，所述载体蛋白具体为牛血清白蛋白（BSA）或卵清蛋白（OVA）。
所述丁香酚抗原的制备方法也属于本发明的保护范围。
所述丁香酚抗原的制备方法，具体可包括如下步骤：将所述丁香酚半抗原（式I）与载体蛋白通过酰胺键偶联，获得所述丁香酚抗原。
在本发明中，所述丁香酚抗原具体是按照包括如下步骤的方法制备获得的：
（1）将所述丁香酚半抗原（式I）溶解于二甲基甲酰胺（DMF）中，然后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），20-25℃磁力搅拌反应2-3h，得到溶液I；
其中，所述丁香酚半抗原（式I）、所述二甲基甲酰胺（DMF）、所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）、所述N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）的配比为7.8mg：1.5ml：21.5mg：13mg。
（2）将所述载体蛋白置于0.1M碳酸氢钠缓冲液中，200rpm搅拌10min，充分溶解，得到溶液II；所述载体蛋白与所述0.1M碳酸氢钠缓冲液的配比为33.6-50mg：3.5ml；
其中，若所述载体蛋白为牛血清白蛋白（BSA），则所述牛血清白蛋白（BSA）与所述0.1M碳酸氢钠缓冲液的配比为50mg：3.5ml；若所述载体蛋白为卵清蛋白（OVA），则所述卵清蛋白（OVA）与所述0.1M碳酸缓冲液的配比为33.6mg：3.5ml；
（3）将所述溶液I和所述溶液II混合，具体为在0-4℃条件下，1000rpm搅拌下，将溶液I逐滴加入到所述溶液II中，500rpm搅拌反应24h，得到溶液III；
（4）用磷酸盐缓冲液（0.01M PBS，pH7.2），于4℃对所述溶液III搅拌透析3天，得到所述丁香酚抗原。
所述丁香酚半抗原（式I）或所述丁香酚抗原在定性或定量检测丁香酚中的应用也属于本发明的保护范围。
利用所述丁香酚抗原制备的抗体也属于本发明的保护范围。所述抗体可为多克隆抗体、单克隆抗体或抗血清。
本发明所提供的丁香酚半抗原，以及所述丁香酚抗原，合成方法简单、纯度高、产率高，对于丁香酚抗体的制备，以及丁香酚药物残留检测具有重大价值。
附图说明
图1为丁香酚的标准曲线。
图2为ELISA法检测两种组织样本（鱼肉、虾肉）与HPLC检测结果一致性。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、丁香酚半抗原的制备
50ml圆底烧瓶中加入5ml甲苯，加入丁香酚500mg（3.0mmol），室温搅拌使体系搅拌均匀，N2保护下，向体系中滴加Ph3P=CHCOOEt的甲苯溶液（1045mg溶解于5ml甲苯中），滴加完毕，升温到80℃反应5h，TLC监测丁香酚反应完全，将反应液降至室温后，将反应液旋干，残余物加入5ml甲苯复溶，0.1M碳酸钠溶液洗涤，分出有机相1g无水硫酸钠干燥，旋干中间体1，加入5ml甲醇复溶残余物，并加入2M氢氧化钠溶液2ml，室温反应过夜，TLC中间体1反应完全，减压除去甲醇，体系稀盐酸调PH=2-3，15ml乙酸乙酯萃取，有机相2g无水硫酸钠干燥，旋干得半抗原（式I）460mg。
反应方程式如下：
式I
实施例2、丁香酚人工抗原的制备
1、免疫原的合成
（1）将7.8mg丁香酚半抗原用1.5ml DMF溶解，200rpm搅拌10min，加入EDC 21.5mg溶解后再加入NHS 13mg，室温搅拌（500rpm）活化2-3h。
（2）称取BSA 50mg溶于3.5ml 0.1M碳酸氢钠溶液中，200rpm搅拌10min，使其充分溶解，冰浴降温0-4℃，1000rpm搅拌下，将步骤1反应液逐滴加入（1ml/min），500rpm搅拌反应24h。
（3）将反应产物装入蒸馏水冲洗干净透析袋（10cm），1L 0.01M PBS（1×，pH7.2）4℃搅拌（100rpm）透析3d，每天换液3次（早中晚各一次），共计换液9次，将透析产物5000rpm离心6min，1.5ml/管分装，将抗原编号，-20℃保存备用。
2、包被原的合成
（1）将7.8mg丁香酚半抗原用1.5mL DMF溶解，200rpm搅拌10min，加入EDC 21.5mg溶解后再加入NHS 13mg，室温搅拌（500rpm）活化2-3h。
（2）称取OVA 33.6mg溶于3.5ml 0.1M碳酸氢钠溶液中，200rpm搅拌10min，使其充分溶解，冰浴降温0-4℃，1000rpm搅拌下，将步骤1反应液逐滴加入（1ml/min），500rpm搅拌反应24h。
（3）将反应产物装入蒸馏水冲洗干净透析袋（10cm），1L 0.01M PBS（1×，pH7.2）4℃搅拌（100rpm）透析3d，每天换液3次（早中晚各一次），共计换液9次，将透析产物5000rpm离心6min，1.5ml/管分装，将抗原编号，-20℃保存备用。
实施例3、丁香酚人工抗原免疫动物制备单克隆抗体
一、动物免疫
用实施例2制备出的免疫原（丁香酚-BSA）按100μg/只，以生理盐水溶解免疫原与弗氏完全佐剂等体积混匀，颈背部皮下注射免疫6~8周龄Balb/c雌鼠，初次免疫后第7、14、28天以免疫原与弗氏不完全佐剂等体积混匀，各追加免疫一次，融合前3天以免疫复合物100μg/只，不加弗氏佐剂再追加免疫一次。
二、细胞融合与克隆
按常规方法进行，取免疫小鼠的脾细胞与处于对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞（SP2/0）混合，然后在45s内缓慢加入预热的融合剂（PEG4000）进行融合，用HAT培养基悬浮均匀，再加入适量的饲养细胞，培养于96孔培养板，于37℃，5％CO2培养箱中培养，5天后用HT培养基半换液，9天时候进行全换液。
3、细胞融合后，待细胞长到培养孔面积的1/4时，采用分步筛选法筛选杂交瘤细胞。初选采用间接ELISA方法，以包被抗原(预先用方阵法常规滴定其最佳包被浓度和阳性血清稀释度)包被酶标板，加入被测孔培养上清，孵育，清洗后加入羊抗鼠IgG-HRP和IgM-HRP，OPD进行显色反应。筛选出的阳性孔再用间接竞争ELISA方法筛选，先将细胞上清与100μg/mL的丁香酚等体积混合，37℃水浴作用30min，再加入到包被好的酶标板中。同时用PBS取代丁香酚作对照，其余步骤同上。若经丁香酚阻断后的OD450nm值下降到对照孔的50％以下，则判为阳性，经2~3次检测都为阳性的孔，立即用有限稀释法进行亚克隆化。
三、单克隆抗体的制备及纯化
将2~3次亚克隆建株后的杂交瘤细胞扩大培养，收集上清液用间接ELISA测定效价，冻存；并取8~10周龄Balb/c小鼠腹腔注射液体石蜡0.5ml/只，7~10日后腹腔注射杂交瘤细胞1~2×105/只，7~10日后抽取小鼠腹水。收集细胞上清或腹水，采用间接ELISA法测定其效价（测定效价时以P/N>2.1的细胞上清或腹水最大稀释倍数表示），结果表明细胞上清的效价为1：10000，腹水的效价为1：50000。接着，用辛酸-饱和硫酸铵法对其进行纯化，纯化后放入-20℃环境保存。
经检测，丁香酚单克隆抗体的轻链的可变区的氨基酸序列如序列表的序列1所示，丁香酚单克隆抗体的重链的可变区的氨基酸序列如序列表的序列2所示。
实施例4、丁香酚酶联免疫试剂盒检测丁香酚
一、丁香酚酶联免疫试剂盒的组装
1、丁香酚酶联免疫试剂盒的组成包括如下：
（1）丁香酚标准品工作液：6瓶，1.5ml/瓶，浓度为0ng/ml、0.05ng/ml、0.15ng/ml、0.45ng/ml、1.35ng/ml、4.05ng/ml；
（2）丁香酚酶标板：1块（8孔×12条），为包被了实施例2制备得到的“丁香酚-OVA”的酶标板。
（3）丁香酚抗体工作液：1瓶（7ml），为抗体稀释液将抗体进行1:80000稀释，抗体稀释液为含6%（体积分数）山羊血清的0.2MPBS，所述丁香酚抗体为实施例3制备得到的抗血清纯化所得的抗体。
（4）酶标记物工作液：经辣根过氧化酶标记的羊抗鼠的抗体。
（5）样品稀释液：0.01M pH7.4的PBS。
（6）洗涤液：0.01M pH7.4的PBST溶液。
（7）底物A液、底物B液各1瓶（7ml）。其中，底物A为2%过氧化脲水溶液。底物B为1%四甲基联苯胺水溶液。
（8）终止液：1瓶（7ml），为2 MH2SO4溶液。
（9）盖板膜；
（10）自封袋。
2、需要而未提供的设备和材料
（1）设备
酶标仪（检测波长450nm，参考波长630nm）、天平（精度：0.01g）、漩涡振荡器、离心机（4000g）、摇床（300rpm）、氮吹仪、微量移液器、计时器。
（2）试剂
乙腈、正己烷。
3、贮存
该试剂盒贮存于2-8℃，切勿冷冻，有效期1年。
未使用完的酶标板条应密封，2-8℃保存。
4、试剂盒检测原理
样品中的丁香酚与酶标板上固定的抗原特异性竞争抗体，加入酶标记物，催化底物显色，根据显色的深浅来判断样品中丁香酚的含量。显色深，含量少，显色浅，含量多。
二、丁香酚酶联免疫试剂盒的使用方法
1、样品前处理
鱼肉、虾肉等组织（稀释系数：5）
a)准确称取1±0.01g均质后的样品于50ml离心管中；b)加入0.5ml样品稀释液，充分涡动30s，再加入4.5ml乙腈，立即涡动至组织完全分散；c)摇床300rpm振摇20min；d)4000g以上，离心10min；e)取1ml上清于新的离心管中；f)50-60℃水浴中，氮气吹干；g)加入2ml正己烷，充分涡动20s，再加入1ml样品稀释液，低速涡动30s；h)4000g以上，离心5min，完全弃去上层正己烷及中间杂质；i)取50μl进行检测。
2、检测步骤
（1）将板条插入酶标板架上，并记录下各标准品和样品的位置，建议均做双孔平行，未使用的板条用自封袋密封后，立即保存于2-8℃环境中；
（2）将50μl各浓度的丁香酚标准品工作液（或待测样品溶液）分别加入对应的标准品（或待测样品孔）中；
（3）在每孔中加入50μl抗体工作液；
（4）盖好盖板膜，轻轻振荡酶标板10s，充分混匀，室温下（25±2℃），避光反应30min；
（5）揭开盖板膜；
（6）倒掉板孔中液体，在每孔加入260μl洗涤工作液，充分洗涤4次，每次浸泡15-30s；
（7）倒掉板孔中液体，将酶标板倒置于吸水纸上，拍干；
（8）立即在每孔中加入100μl酶标记物工作液；
（9）盖好盖板膜，轻轻振荡酶标板10s，充分混匀，室温下（25±2℃），避光反应30min；
（10）揭开盖板膜；
（11）倒掉板孔中液体，在每孔加入260μl洗涤工作液，充分洗涤4次，每次浸泡15-30s；
（12）倒掉板孔中液体，将酶标板倒置于吸水纸上，拍干；
（13）立即在每孔中加入100μl A、B混合液；
（14）盖好盖板膜，轻轻振荡酶标板10s，充分混匀，室温下（25±2℃），避光反应15-20min；
（15）揭开盖板膜，在每孔中加入50μl终止液，轻轻振荡酶标板10s，充分混匀；
（16）终止后5min内用酶标仪在双波长450nm、630nm下读取酶标板吸光度值。
3、结果计算或判定
（1）各标准品（或待测样品）的平均吸光度值，除以零标（浓度为0ng/ml的标准品）吸光度值，乘以100，可以得到各标准品对应的吸光度的百分比，即百分吸光度值。
（2）以各标准品的百分吸光度值为纵坐标，以对应的丁香酚浓度为横坐标绘制标准曲线。
（3）将待测样品的百分吸光度值代入标准曲线方程，可得出待测样品对应的浓度，再乘以相应样品的稀释倍数，方得待测原样品中丁香酚的实际含量。
三、丁香酚酶联免疫试剂盒检测丁香酚
按照本实施例二试剂盒使用方法，测定本发明开发的试剂盒的灵敏度（IC50）、检测限、
1、试剂盒灵敏度（IC50）测定
检测浓度分别为0.00、0.05、0.15、0.45、1.35、4.05、12.15 µg/mL的丁香酚标准品。以标准品浓度的对数值为横坐标、吸光率B/B0为纵坐标(B为各个标准品浓度的OD值，B0为0 µg/mL的OD值）绘制标准曲线。
丁香酚标准曲线见图1。
丁香酚标准曲线方程为：y=1.0942+1.1002/(1+(x/0.1280)^0.9279)
相关系数(R2)为0.9998，IC50为0.1280μg/mL，丁香酚酶联免疫试剂盒的灵敏度为0.13 μg/kg。
2、最低检测限测定
取20份空白样品进行检测，根据标准曲线求出测定值，计算出其平均值，再加上3倍标准差，即为最低检测限，结果如表2所示，测得的最低检测限可达0.5μg/kg。
表2 空白样品测定结果统计表（µg/kg）
3、方法准确度和精密度的测定
分别测定了20个空白样品，按照本发明提供方法进行前处理，根据标准曲线求出测定值，计算出其平均值，再加上3倍标准差，即为最低检测限。结果见表3-表4，结果表明尿液样品各添加浓度的回收率在88.24～103.52%之间；批内、批间变异系数小于10%。
表3试剂盒准确度和精密度（鱼肉）
表4试剂盒准确度和精密度（虾肉）
4、特异性检测
丁香酚酶联免疫试剂盒的特异性是通过与相应的物质进行交叉反应试验来确定的。交叉反应越小，特异性越好。
将丁香酚及其它类似物甲基丁香酚（甲基丁香酚、异丁香酚、甲基异丁香酚、乙酰基异丁香酚）分别做系列稀释，分别按照如上步骤二2进行操作，以丁香酚及其它类似物的系列稀释液替代其中的“丁香酚标准品工作液”，制作标准曲线，并在曲线上找出各自50%抑制浓度（IC50），具体方法如下：得到纵坐标数值等于50%对应的丁香酚浓度（ng/ml），即IC50值。用下式计算试剂盒对丁香酚和各类似物的交叉反应率。
交叉反应率（%）＝（引起50%抑制的丁香酚浓度/引起50%抑制的丁香酚类似物浓度）×100％
结果如表5所示，从表5中可以看出，丁香酚酶联免疫试剂盒对各种类似物的交叉反应率均小于0.1%。这说明丁香酚酶联免疫试剂盒对丁香酚具有极高的特异性，可有效的排除其它类似物的干扰，可专门用于丁香酚的检测。
表5 丁香酚酶联免疫试剂盒的特异性
药物名称 交叉反应率（%）
丁香酚 100
甲基丁香酚 ＜0.1
异丁香酚 ＜0.1
甲基异丁香酚 ＜0.1
乙酰基异丁香酚 ＜0.1
5、丁香酚酶联免疫试剂盒检测丁香酚的回收率测定
测定采用丁香酚酶联免疫试剂盒检测丁香酚的回收率。具体方法如步骤二。
结果显示，采用丁香酚酶联免疫试剂盒检测丁香酚的回收率范围为80%~120%。
6、丁香酚酶联免疫试剂盒与仪器方法检测结果比对
用ELISA法检测两种组织样本（鱼肉、虾肉，共60份），分别与HPLC的检测结果进行确证比较。其中有48份样本，两种方法的结果均为阴性。剩余12份阳性样本的检测准确如图2所示，ELISA的结果显示与HPLC显著相关，均准确可靠。线性拟合的R2为0.98697，斜率（slop）为0.97294。ELISA法与HPLC的检测结果一致性好。
ELISA法检测两种组织样本（鱼肉、虾肉）与HPLC检测结果一致性见图2。
实施例5、丁香酚胶体金试纸条检测丁香酚
一、丁香酚胶体金试纸条的组成
丁香酚胶体金试纸条由样品吸收垫、胶体金垫、反应膜和吸水垫组成；
沿试纸条的轴向，样品吸收垫、胶体金垫、反应膜和吸水垫依次按顺序连接，样品吸收垫的末端与胶体金垫的始端相连，胶体金垫的末端与反应膜的始端相连，反应膜的末端与吸水垫的始端相连；
所述胶体金垫上包被有胶体金标记的实施例3得到的丁香酚单克隆抗体；
所述反应膜上有检测区和质控区，检测区（T线）和质控区（C线）均为与试纸条轴向垂直的条带状；检测区位于靠近胶体金垫末端的一侧；质控区位于远离胶体金垫末端的一侧；检测区包被实施例2制备的丁香酚-OVA，质控区包被羊抗鼠二抗。
样品孔位于样本吸收垫上远离胶体金垫末端的一端。
二、试纸条的制备
1、胶体金标记抗体
（1）胶体金溶液的制备
取0.01％氯金酸水溶液100ml用恒温电磁搅拌器加热至沸腾，持续搅拌的情况下加入1％柠檬酸三钠水溶液2.5ml，继续搅拌加热20min，溶液呈透亮的红色。室温冷却，用去离子水恢复到原体积，2-8℃保存。
（2）金标抗体溶液的制备
用0.1mol/l K2CO3水溶液调节胶体金溶液的pH至8.2，然后取10ml加入50ml烧杯中，电磁搅拌器250r/min搅拌，逐滴加入单克隆抗体溶液，逐滴加入3ml 5g/100 ml BSA水溶液，持续搅拌10min。
（3）将金标抗体溶液20-24℃低速（1500r/min）离心20min，弃去由凝聚的金颗粒形成的沉淀，取红色上清溶液。
（4）将步骤（3）的溶液4℃、11000r/min 离心40min，溶液分为三层( 透明上清、管底可流动的暗红色沉淀及管底壁上黑色致密的金颗粒层)，将可流动的暗红色沉淀转移到另外一个离心管中，用含1g/100ml BSA的0.01mol/l磷酸盐缓冲液混悬至原金标抗体溶液的体积，过夜，4℃、11000r/min离心40min，收集沉淀。
（5）用含1g/100ml BSA和0.02g/100ml NaN3的0.01mol/l磷酸盐缓冲液将步骤（4）的沉淀混悬至原金标抗体溶液的体积的1/40，2-8℃保存。
2、喷金：将步骤（1）得到的混悬液喷到玻璃纤维膜上，制成胶体金垫。
3、喷膜：在反应膜上的T线位置喷上实施例2制备的丁香酚-OVA、C线位置喷上羊抗鼠抗体。
4、组装：将样品吸收垫（纤维素滤膜）、胶体金垫、硝酸纤维素膜、吸水垫按常规方法进行组装，然后切条，即可检测。也可以将试纸条装入塑料制卡中，形成试纸卡用于检测。
三、用试纸卡进行检测
1、样品前处理及检测
样品前处理方法如实施例五的步骤二1。
取出试纸卡，开封后平放于桌面，吸取待测样本溶液逐滴加入3~5滴于样品孔中；5-10min判断结果，15min后的判断结果无效。
结果判断标准：
阴性：C线显色，T线肉眼可见，无论颜色深浅均判为阴性；
阳性：C线显色，T线不显色，判为阳性；
无效：C线不显色，无论T线是否显色，该试纸卡均判为无效。
序列表
<110> 北京维德维康生物技术有限公司
<120> 一种丁香酚半抗原、人工抗原及其制备方法与应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 93
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Ala Ile Ala Asn Leu Arg
            20                  25                  30
Asn Leu Asp Ser Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
        35                  40                  45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Cys Trp Arg Pro Ala Val Trp Gly Pro
    50                  55                  60
Arg Gln Val Gln Trp Gln Trp Ile Arg Asp Arg Xaa His Thr Gln Asp
65                  70                  75                  80
Gln Gln Ser Gly Gly Thr Gly Ser Gly Ser Leu Leu Leu
                85                  90
<210> 2
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln
1               5                   10                  15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Gly Ser Ile Ser Pro Met Ser Gly Pro
            20                  25                  30
Leu Ser Thr Leu Gly Ser Pro Val Ser Arg Lys Gly Ser Gly Val Ala
        35                  40                  45
Gly Ser Leu Thr Thr Arg Asn Val Arg Arg Ile Ser Cys Ser Phe His
    50                  55                  60
Ile Gln Thr Glu His Gln Gln Gly Gln Leu Gln Glu Pro Ser Phe Leu
65                  70                  75                  80
Ser Asn Glu Gln Ser Ala Ser Ser Cys His Ser His Val Leu Leu Cys
                85                  90                  95
Ser Ser Asp Ser Thr Gln Trp Leu Gln Tyr Ser Gly Val Arg Ser Ile
            100                 105                 110
Arg Asp Val Gly Ser Arg Asn Phe Ser His Arg
        115                 120

Claims (4)

1.丁香酚抗原，为将式I所述化合物与载体蛋白偶联所得的抗原，其中所述载体蛋白是牛血清白蛋白、卵清蛋白、人血清白蛋白、血蓝蛋白、鼠血清蛋白、甲状腺蛋白或兔血清蛋白；其中所述丁香酚抗原的制备方法，为将式I所述化合物与载体蛋白通过酰胺键偶联，获得所述丁香酚抗原，包括如下步骤：
(1)将所述丁香酚半抗原(式I)溶解于二甲基甲酰胺(DMF)中，然后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，20-25℃磁力搅拌反应2-3h，得到溶液I；其中，所述丁香酚半抗原(式I)、所述二甲基甲酰胺(DMF)、所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、所述N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的配比为7.8mg：1.5ml：21.5mg：13mg；
(2)将所述载体蛋白置于0.1M碳酸氢钠缓冲液中，200rpm搅拌10min，充分溶解，得到溶液II；所述载体蛋白与所述0.1M碳酸氢钠缓冲液的配比为33.6-50mg：3.5ml；
(3)将所述溶液I和所述溶液II混合，具体为在0-4℃条件下，1000rpm搅拌下，将溶液I逐滴加入到所述溶液II中，500rpm搅拌反应24h，得到溶液III；
(4)用磷酸盐缓冲液(0.01M PBS，pH7.2)，于4℃对所述溶液III搅拌透析3天，得到所述丁香酚抗原；
2.权利要求1所述丁香酚抗原的应用，其特征在于定性或定量检测丁香酚；制备丁香酚抗体。
3.根据权利要求2所述的丁香酚抗原的应用，其特征在于制备酶联免疫试剂盒和胶体金检测卡。
4.根据权利要求2或3所述的丁香酚抗原的应用，其特征在于检测样本为水产及组织，所述检测上述样本中丁香酚的检测限为0.5μg/kg，灵敏度为0.51μg/kg。
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