CN101962368A - 氰脲酸半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种氰脲酸半抗原、人工抗原、抗体及其制备方法和应用。本发明以1，3，5-三嗪-2，4，6-(1H，3H，5H)-三酮与溴代羧酸苄酯反应生成含羧基的半抗原；然后通过活泼脂法或者混合酸酐法与蛋白质偶联制备人工抗原。将人工抗原免疫动物后，获得氰脲酸特异性抗体。本发明所述抗体可用于氰脲酸免疫检测，实现氰脲酸现场快速检测，保障食品安全。

Description

氰脲酸半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于食品安全技术领域。具体涉及氰脲酸半抗原、人工抗原和抗体的制备方法及应用。

背景技术

氰脲酸又名1，3，5-三嗪-2，4，6-(1H，3H，5H)-三酮，S-三嗪-2，4，6-三醇，异氰脲酸，2，4，6-三(2-羟基-4-正丁氧基苯基)-1，3，5-三嗪，对称三羟基三氮杂苯，2，4，6-三羟基-1，3，5-三嗪，均三嗪三醇，2，4，6-三羟基-1，3，5-三嗪，CAS号：108-80-5，结构式为：

氰脲酸可以作为三聚氰胺的一种杂质出现；氰脲酸也是美国食品和药品管理局认可的可以用作反刍动物饲料添加剂的缩二脲的一种成分；它还被用作二氯异氰脲酸消毒剂的分解物，可在游泳池水中发现。消费者接触这一化学品的可能途径是：食用被非法添加三聚氰胺或者氰脲酸的食品、喝了游泳池的水、饮用由地表水处理后的饮水，以及食用体内积存此化学品的鱼类。对饮水消毒时，二氯异氰脲酸钠迅速脱氯，形成氰脲酸(有关文献命名为氰尿酸)。

氰脲酸对哺乳动物具有低急性毒性，大鼠的经口半数致死量为每公斤体重7700毫克。几项亚慢性经口毒性研究项目显示，氰脲酸造成肾组织损伤，其中包括肾小管扩张，肾小管上皮坏死或增生，嗜碱性肾小管增加，中性粒细胞浸润，以及矿化和纤维化。

对氰脲酸残留的检测目前主要采用高效液相色谱法(HPLC)。然而应用HPLC时样品前处理非常繁琐，测定方法相当复杂，需受过专门训练的人员才能操作，检测通量很小，而且监测成本昂贵。因此，目前我国相应的氰脲酸检测技术并不很完备，很有必要研制更加简单快捷方便的检测产品。

免疫检测方法，是目前食品安全快速检测的重要方法，检测成本很低，使用简单，非常适合大量样品的筛选检测，已经在食品安全监管中发挥了重要作用。

但任何半抗原物质免疫检测方法的建立，都必须首先制备出氰脲酸半抗原、抗原及抗体，然后才能利用这些试剂建立免疫检测方法。因此，半抗原合成、人工抗原及其抗体制备，是氰脲酸免疫分析方法建立的难点。半抗原物质的抗体生产涉及分析化学、有机化学、免疫学、生物学等知识背景，任何一个环节失败，皆不能成功。抗原设计的合理性确定了合成的难度，同时决定了抗体的特异性，目前尚没有成熟的理论完全预测。因此，尽管氰脲酸的快速检测有很大的需求，但由于半抗原物质抗体制备技术的复杂性合成的难度，国内外目前尚未见氰脲酸免疫分析的任何报导。

发明内容

本发明的一个目的是填补氰脲酸现有检测技术的不足，提供一种可应用于氰脲酸免疫检测方面的氰脲酸人工半抗原、人工抗原和特异性抗体。

本发明的另一个目的是提供所述氰脲酸人工半抗原、人工抗原和特异性抗体的制备方法。

本发明还有一个目的是提供所述氰脲酸人工半抗原、人工抗原和特异性抗体的应用。

本发明的目的通过以下技术方案予以实现：

提供一种氰脲酸人工半抗原、人工抗原和特异性单克隆抗体，所述氰脲酸人工半抗原具有式(I)所示分子结构：

其中，n为-CH₂基团数目，n＝1～8。

所述氰脲酸人工抗原，具有式(II)所示分子结构：

其中，n为-CH₂基团数目，n＝1～8。

本发明提供了所述氰脲酸半抗原的制备方法，是将1，3，5-三嗪-2，4，6-(1H，3H，5H)-三酮与溴代羧酸苄酯反应生成含羧基的半抗原；

氰脲酸半抗原合成路线如下：

本发明所述氰脲酸半抗原的制备包括以下步骤：

(1)将氰脲酸和溴代羧酸苄酯装入圆底烧瓶中，加入少量N，N-二甲基甲酰胺(又名二甲基甲酰胺，DMF)溶解反应物；

(2)往步骤(1)溶解好的反应物中加入与氰脲酸等物质量的催化剂，反应后减压蒸除溶剂DMF，用四氢呋喃溶解残渣A，过滤，滤液浓缩至干，得残渣B；

(3)残渣B用二氯甲烷+甲醇(95+5)为展开剂柱层析，获得中间产物，用过量氢氧化钾溶液充分水解中间产物，再用浓盐酸酸化至pH值为3～6，蒸干溶剂得白色固体，白色固体用冷水洗涤后得目标半抗原。

上述步骤(1)所述氰脲酸和溴代羧酸苄酯的投料摩尔比为6∶1～1∶1。

步骤(1)所述溴代羧酸苄酯优选n＝1～8的溴代羧酸苄酯。

步骤(2)所述催化剂为碳酸钾、三乙胺或其他碱性催化剂如DMAP(4-二甲氨基吡啶)。

步骤(2)所述反应的反应温度为40～80℃，反应时间为5～24h。

步骤(3)所述冷水洗涤次数为3～5次。

本发明所述人工抗原的制备可采用活泼脂法或者混合酸酐法，也可以根据本发明设计思想，采用本领域其他常规方法将本发明所述半抗原与蛋白质偶联制备人工抗原。

采用活泼脂法制备本发明所述抗原的具体步骤如下：

(1)将本发明半抗原溶解于适宜量的溶剂中，所述溶剂优选二氧六环或二甲基甲酰胺；

(2)往步骤(1)溶解好的体系中加入二环己基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，室温反应后离心除去沉淀，得上清液；二环己基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺加入量按照摩尔比1∶1的比例确定；

(3)将上清液滴入pH值为7.4～9.55的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液中，缓冲液中含有10mg/mL的载体蛋白，反应2～4h后，将反应液装入透析袋，用0.85％的生理盐水透析3～4天，得人工抗原。

步骤(3所述)载体蛋白可选BSA、KLH、CONA、THY或OVA。

采用混合酸酐法制备本发明所述抗原的具体步骤如下：

(1)将本发明半抗原溶解于适宜量的溶剂中，所述溶剂优选二氧六环或二甲基甲酰胺；

(2)往步骤(1)体系中加入氯甲酸异丁酯，4℃反应得甲液；

将载体蛋白溶于1mol/L pH值为9.6的碳酸氢钠缓冲液中，得乙液；载体蛋白可为BSA或KLH或CONA或THY或OVA；

(3)将甲液缓慢滴加到乙液中，4℃搅拌反应过夜，将反应液装入透析袋，用0.85％的生理盐水透析3d，得人工抗原。

本发明所述氰脲酸特异性抗体制备，其具体步骤如下：

用所得人工抗原免疫Balb/c小鼠或新西兰兔，免疫剂量为1mg/Kg，背部皮下注射，每隔15d加强免疫一次，第4次后耳缘静脉采血测定效价和特异性，待效价和特异性合格后，采集血清获得多克隆抗体；或用小鼠脾细胞进行细胞融合，获得杂交瘤细胞，细胞分泌获得单克隆抗体。

抗体用辛酸-硫酸铵法或Protein G/A亲和纯化。

本发明同时提供了所述抗体的应用，可应用于食品、水、包装材料和环境中氰脲酸残留量检测方面，尤其是现场快速免疫检测氰脲酸方面。

本发明的有益效果是：

氰脲酸免疫分析方法，目前尚未见任何研究报道，本发明设计合理合成方法和线路，制备得到特异性优良的半抗原、抗原和抗体，并首次提供了一种实现氰脲酸免疫分析的方法，使得快速检测氰脲酸得以实现，避免了实验室繁荣复杂的仪器分析步骤，操作简便，无需专业技术人员；检测成本远远低于常规使用的仪器检测方法。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步详细说明本发明。实施例中氰脲酸等药剂除非特别说明，都是常规市购实验室用试剂。

实施例1半抗原合成

本实施例以n＝1时的溴乙酸苄酯为例。

将5mmol氰脲酸和5mmol溴代酸苄酯装入圆底烧瓶中，加入8mLDMF，再加入5mmol DMAP，40～80℃反应10h，减压蒸除溶剂，用四氢呋喃溶解残渣，过滤，滤液浓缩至干，用二氯甲烷+甲醇(95+5)为展开剂，柱层析，收集Rf＝0.3的组分，蒸干溶剂，白色固体用过量氢氧化钾水解过夜，再用浓盐酸酸化至pH值为3，蒸干溶剂，出现白色固体，用冷水洗涤3～5次，得目标半抗原。

当n＝3～8时，方法基本同上，仅将溴代酸苄酯中的碳链长短更换，即采用相应的溴代酸苄酯反应，摩尔比例同溴乙酸苄酯，不再赘述。

实施例2人工抗原制备

本实施例以n＝1时的溴乙酸苄酯法所得半抗原为原料制备人工抗原为例描述如下。

活泼酯法：将0.20mmol的半抗原溶解于1.0mL的二氧六环(或二甲基甲酰胺)中，加入0.22mmol的二环己基碳二亚胺和0.22mmolN-羟基琥珀酰亚胺，室温反应3.5h，离心除去沉淀，将上清滴入5mLpH为7.4～9.55碳酸缓冲液中，缓冲液中含有10mg/mL的载体蛋白，载体蛋白为BSA；反应2～4h后，将反应液装入透析袋，用0.85％的生理盐水透析3d，得人工抗原(命名为：M-a-3-BSA)。

载体蛋白替换为KLH或CONA或THY或OVA的制备过程，本领域技术人员可参照了解，不再赘述。

实施例3人工抗原制备

混合酸酐法：将0.1mmol半抗原溶于1.5mL二氧六环中，加入0.15mmol氯甲酸异丁酯，4℃搅拌反应0.5h，此为甲液。将50mg载体蛋白溶于4mL1mol/L pH 9.6的碳酸氢钠缓冲液中，此为乙液。载体蛋白为OVA。将甲液缓慢滴加到乙液中，4℃搅拌反应过夜，将反应液装入透析袋，用0.85％的生理盐水透析3d，得人工抗原。

n＝2～8时，人工抗原制备方法同n＝1，实施时仅将仅将溴代酸苄酯中的碳链长短更换，即采用相应的溴代酸苄酯反应所得半抗原，摩尔比例同溴乙酸苄酯法所得半抗原，不再赘述。

实施例4抗体制备

采用本领域常规方法利用本发明人工抗原M-a-3-BSA免疫实验室常规实验使用的Balb/c小鼠，免疫剂量为1mg/Kg，背部皮下注射，每隔15d加强免疫一次，第4次后耳缘静脉采血测定效价和特异性，待效价和特异性合格后，进行细胞融合，获得杂交瘤细胞，细胞分泌获得单克隆抗体。

采用本领域常规方法利用本发明人工抗原M-a-3-BSA免疫兔子，免疫剂量为1mg/Kg，背部皮下注射，每隔15d加强免疫一次，第4次后直接采集血清即可得多克隆抗体。

实施例5抗体纯化

采用辛酸硫酸铵法或者Protein G/A进行。辛酸硫酸铵法是本领域常规方法，每毫升兔血清中加入75uL辛酸，每毫升小鼠腹水中加入33uL；Protein G/A按照商品说明书进行即可。

实施例8ELISA检测应用实验

样品处理方法：

取鲜奶样品2.0mL，加入400μL 0.6moL/L的三氯乙酸溶液，振荡1min，加入2mL PBS，6000r/min离心10min，取上清，加入100μL 1moL/L的NaOH溶液，调节pH为7.4左右。用正己烷脱脂3次，取下层液体，用PBST定容至10mL，用于检测。

ELISA检测：

在酶标板上，按照1ug/mL的浓度包被人工抗原，人工抗原使用时，免疫原载体蛋白和检测抗原载体蛋白不能相同；例如人工抗原M-a-3-BSA免疫动物，则检测时包被抗原载体换用OVA；包被条件采用pH值为9.6的碳酸盐缓冲液，37℃孵育3h，洗涤；然后用5％的脱脂奶粉封闭1h，洗涤；加入待检样品和合适浓度的抗体，反应1h，洗涤；然后加入合适浓度的酶标二抗，反应1h，洗涤；加入显色底物，读数，其吸光值大小与浓度成反比。同时用氰脲酸标准品作标准曲线，即可定量检测样品中的氰脲酸。

添加回收实验：

对空白牛奶中分别添加0、20、100、600μL，得到样品氰脲酸含量为0、1、5、30ng/mL，按照如上样品处理方法和检测方法，回收率在82.5～103.2％，满足一般筛选检测要求。

同时用多种结构类似物替代氰脲酸标准品，交叉反应率均小于1％，表明该方法特异性良好。本发明首次实现了氰脲酸的免疫快速检测，对于实现大量样品的快速检测，具有重要意义。

Claims (10)

1.一种氰脲酸人工半抗原，其特征在于是将1，3，5-三嗪-2，4，6-(1H，3H，5H)-三酮与溴代羧酸苄酯反应制备得到，具有式(I)所示分子结构：

其中，n为-CH₂基团数目，n＝1～8。

2.一种权利要求1所述氰脲酸人工半抗原的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)将氰脲酸和溴代羧酸苄酯装入圆底烧瓶中，加入少量N，N-二甲基甲酰胺溶解反应物；

(2)往步骤(1)溶解好的体系中加入与氰脲酸等物质量的催化剂，反应后减压蒸除N，N-二甲基甲酰胺，用四氢呋喃溶解残渣A，过滤，滤液浓缩至干，得残渣B；

(3)残渣B用二氯甲烷+甲醇(95+5)为展开剂柱层析，获得中间产物，用过量氢氧化钾溶液充分水解中间产物，再用浓盐酸酸化，蒸干溶剂得白色固体，白色固体用冷水洗涤后得目标半抗原。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤(1)所述氰脲酸和溴代羧酸苄酯的投料摩尔比为6∶1～1∶1；步骤(1)所述溴代羧酸苄酯为n＝1～8的溴代羧酸苄酯。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤(2)所述催化剂为碳酸钾、三乙胺或4-二甲氨基吡啶。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤(2)所述反应的反应温度为40～80℃，反应时间为5～24h。

6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤(3)所述浓盐酸酸化是将中间产物酸化至pH值为3～6。

7.一种氰脲酸人工抗原，其特征在于是将权利要求1所述的氰脲酸半抗原与蛋白质偶联制备得到，具有式(II)所示分子结构：

其中，n为-CH₂基团数目，n＝1～8。

8.一种权利要求7所述氰脲酸人工抗原的制备方法，其特征在于采用活泼脂法或者混合酸酐法将权利要求1所述的氰脲酸半抗原与蛋白质偶联。

9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)将所述半抗原溶解于溶剂中，所述溶剂优选二氧六环或二甲基甲酰胺；

(2)往步骤(1)溶解好的体系中加入二环己基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，室温反应后离心除去沉淀，得上清液；二环己基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺加入量优选按照摩尔比1∶1的比例确定；

(3)将上清液滴入pH值为7.4～9.55的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液中，缓冲液中含有10mg/mL的载体蛋白，反应2～4h后，将反应液装入透析袋，用0.85％的生理盐水透析3～4天，得人工抗原；

或者包括以下步骤：

(1)将权利要求2或3制备得到的半抗原溶解于溶剂中；所述溶剂优选二氧六环或二甲基甲酰胺；

(2)往步骤(1)体系中加入氯甲酸异丁酯，4℃反应得甲液；

将载体蛋白溶于1mol/L pH值为9.6的碳酸氢钠缓冲液中，得乙液；载体蛋白优选BSA或KLH或CONA或THY或OVA；

(3)将甲液缓慢滴加到乙液中，4℃搅拌反应过夜，将反应液装入透析袋，用0.85％的生理盐水透析3d，得人工抗原。

10.一种权利要求7所述抗原的应用，其特征在于应用于制备特异性抗体或氰脲酸免疫检测方面。