JP2007228868A - Lamp法を用いたジフテリア毒素遺伝子検出方法およびこの方法に用いるプライマーセット - Google Patents
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Abstract
【解決手段】ジフテリア毒素遺伝子の少なくとも一部をLAMP法により増幅し得るプライマーセットを用意し、検体からDNAを抽出し、抽出したDNAを、前記プライマーセットを用いるLAMP法による増幅操作に供し、増幅操作後に、産物中に、増幅されたDNAが含まれるか否かを確認する、ことを含む検体中に含まれるジフテリア毒素遺伝子を検出する方法。検体中の菌体に含まれるジフテリア毒素遺伝子をLAMP法により検出するために用いられる、配列表に示された特定の塩基配列を有する4つのDNAを含むプライマーセット、または、配列表に示された他の特定の塩基配列をさらに含むプライマーセット。
【選択図】なし
Description
ジフテリアの病態には、ジフテリア菌が産生する主要な病原因子であるジフテリア毒素が極めて重要な役割を果たしており、感染症法においても、患者から分離された菌がこのジフテリア毒素を産生するかどうかが、感染症としてのジフテリアと見なされるかどうかの決め手となる。
前項に述べたように、「ジフテリア毒素産生菌」の存在を迅速に検知できることが条件である。この条件を満たすために、分子生物学的な手法を用いた試みがなされてきた。ジフテリア毒素遺伝子をターゲットとしたPCR法、リアルタイムPCR法が研究レベルではすでに開発されている(PCR法: Nakao et al. J. Clin. Microbiol. 1997, 35(7)1651-1655(非特許文献1、リアルタイムPCR法: Mothershed et al. J. Clin. Microbiol. 2002, 40(12)4713-4719(非特許文献 2)。
[1]ジフテリア毒素遺伝子の少なくとも一部をLAMP法により増幅し得るプライマーセットを用意し、
検体からDNAを抽出し、
抽出したDNAを、前記プライマーセットを用いるLAMP法による増幅操作に供し、
増幅操作後に、産物中に、増幅されたDNAが含まれるか否かを確認する、ことを含む検体中に含まれるジフテリア毒素遺伝子を検出する方法。
[2]前記プライマーセットが配列表に示された配列番号1〜4の塩基配列を有する4つのDNAを含む[1]に記載の方法。
[3]前記プライマーセットが配列表に示された配列番号5〜6の塩基配列を有する2つのDNAをさらに含む[2]に記載の方法。
[4]増幅産物中に増幅されたDNAが含まれるか否かを、増幅産物の濁度を測定することで確認するか、または蛍光色素を用いて確認する[1]〜[3]のいずれかに記載の方法。
[5]検体中の菌体に含まれるジフテリア毒素遺伝子をLAMP法により検出するために用いられる、配列表に示された配列番号1〜4の塩基配列を有する4つのDNAを含むプライマーセット。
[6]前記プライマーセットが配列表に示された配列番号5〜6の塩基配列を有する2つのDNAをさらに含む[5]に記載のプライマーセット。
[7][5]または[6]に記載のプライマーセットを含む、検体中に含まれるジフテリア毒素遺伝子をLAMP法により検出するためのキット。
(1)ジフテリア毒素遺伝子の少なくとも一部をLAMP法により増幅し得るプライマーセットを用意する。
(2)検体からDNAを抽出する。
(3)抽出したDNAを、前記プライマーセットを用いるLAMP法による増幅操作に供する。
(4)増幅操作後に、産物中に、増幅されたDNAが含まれるか否かを確認する。
本発明の方法では、ジフテリア毒素遺伝子の少なくとも一部をLAMP法により増幅し得るプライマーセットを用意する。ジフテリア菌は、Corynebacterium diphtheriae属する細菌であり、12種類のジフテリア菌(毒素原性、非毒素原性)遺伝子に特異的な配列を探索し、Aサブユニット遺伝子の内部の配列(配列番号7)を選定し、さらにこの配列に対しLAMP法プライマーの設計を行なった。設計にはLAMP法プライマー設計支援ソフト(PrimerExplorer Ver.3、栄研化学)を使用し、設計されたプライマーセットの中から本発明者らが、候補となり得ると考えた8種類のプライマーセットを選択した。そして、選択されたプライマーセットを合成し、各プライマーセットについて、その検出感度と特異性を1種類のジフテリア菌から精製したDNAを用いて検討した。その結果、本発明のプライマーセットが最も高い感度を示した。
Cd#16#B3#HPLC:CAATGAGCTACCTACTGATCG(配列番号2)
Cd#16#FIP#HPLC:TAACGCTTTCGCCTGTTCCCTGTAGTGCTCAGCCTTCC(配列番号3)
Cd#16#BIP#HPLC:GTGGAAAACGTGGCCAAGATCCTGACACGATTTCCTGC(配列番号4)
Cd#16#LF#HPLC:CGCTAGAACTCCCCTCAGC(配列番号5)
Cd#16#LB#HPLC:GCGATGTATGAGTATATGGCTCAAG(配列番号6)
本発明の方法では、検体からDNAを抽出する。具体的には、検体中の菌株から市販のDNA抽出キットを用いて直接DNAを抽出する。DNA抽出キットとしては例えば、QIAamp DNA Micro Kit (Cat. No. 56301、Qiagen社)を挙げることができる。あるいは、検体からDNAを抽出せず、菌体を煮沸(boil)するだけの簡単な調製法でも、本発明の方法において鋳型として用いるDNAは調製できる。
本発明の方法では、抽出したDNA(DNAテンプレイト)を、前記プライマーセットを用いるLAMP法による増幅操作に供する。LAMP法による増幅操作は、例えば、以下のように行うことができる。試薬(例えば、Bst DNAポリメラーゼ、反応バッファー、dNTPs、プライマーセット、蒸留水)を混合し、反応チューブに分注した後にDNAテンプレイト(抽出したDNA)を加える。次いで、例えば、65℃にてインキュベートする。インキュベート時間は、例えば、30分〜90分の範囲である。
本発明の方法では、増幅操作後に、産物中に、増幅されたDNAが含まれるか否かを確認する。検体中に含まれる菌体中にジフテリア毒素遺伝子が含まれている場合、増幅操作によりジフテリア毒素遺伝子が増幅される。逆に、検体中に含まれる菌体中にジフテリア毒素遺伝子が含まれていなければ、増幅操作によっても増幅されるDNAはない。
1.Bst DNAポリメラーゼ
2.反応バッファー
3.dNTPs
4.プライマーセット(本発明のプライマー)
5.コントロールDNA(陽性コントロール)
6.反応チューブ
7.説明書
菌株と試薬
ジフテリア菌ATCC700971(NCTC13129)は米国ATCCから購入した。その他のジフテリア菌菌株は研究室保存のものおよびATCCから購入したものを用いた。
凍結保存した菌を血液寒天培地に塗布あるいはBHI液体培地に懸濁し、37℃一晩から二晩培養して実験に用いた。これらの培養を同様の培地に植え継いだ培養も、同様に用いた。
(1) 血液寒天上コロニーからのQiagen による精製
血液寒天平板培地上で37℃一晩培養した菌体を2mlの精製水に懸濁しながらコンラージ棒で集め、遠心して洗ったのち、Qiagenキットの指定に従い総DNAを抽出した。リゾチームのみ指定と異なる量(50mg/ml)を用いた。得られた精製DNAをテンプレートとして用いた。
200mlのBHI液体培地で37℃一晩培養した菌体を遠心集菌し、生理食塩水で菌体を洗浄してから凍結融解したのち、27mg/mlのリゾチームを含むQiagen Genomic Buffer SetのB1溶液11mlに懸濁して37℃一晩インキュベート、さらにタカラバイオ社製Proteinase Kを1ml加えて37℃1時間インキュベートした。次にQiagen Genomic Buffer SetのB2溶液を4mlとQiagen RNase溶液を10μl加え50℃1時間インキュベートして菌体を溶解した。得られた菌体ライセートを、のフェノール/クロロホルム処理2回とのクロロホルム処理1回で除蛋白を行ない、エタノール沈澱で粗DNA画分を得た。粗DNA画分から、常法による塩化セシウム-臭化エチジウム密度勾配超遠心で精製DNAを得た。得られた精製DNAをテンプレートとして用いた。
血液寒天平板培地またはBHI寒天平板培地上に菌を塗布し37℃一晩培養して生じたコロニーをかきとり、精製水に懸濁してOD600を測定して適当に精製水で希釈して、OD6001= 1の懸濁液を調製した。このOD = 1の懸濁液をさらに10倍ずつ段階希釈し、OD = 0.001までの懸濁液を調製した。これらの懸濁液をアルミブロックヒーターで100℃30分加熱し、遠心した上清をDNAテンプレートとして用いた。
栄研化学(株)のwebサイト上で動作するwebアプリケーション"Primer Explorer Ver3"を用いて、NCBIから得られたジフテリア毒素遺伝子の塩基配列情報をもとにプライマーを設計した。設計したプライマーはジフテリア毒素Aサブユニットに対応する遺伝子領域上に位置し、上記配列番号1〜6に示す塩基配列である。プライマーは、全て北海道システムサイエンス社による受託合成(HPLC精製グレード)のものを用いた。
栄研化学(株)「LoopAmp DNA増幅試薬」の取扱説明書によった。増幅されたDNAの検出は、栄研化学LA-320c型リアルタイム濁度検出器によった。
LAMPプライマーセットの感度と特異性は、既存のPCR法(非特許文献1)と比較することにより実施した。遺伝子増幅の有無は、PCR産物5μLを1%アガロースゲル電気泳動で分離後、エチジウムブロマイド染色により確認した。
Loopamp DNA増幅試薬キット(栄研化学)を用いて、LAMPプライマーセットの検出感度と特異性を評価した。LAMP検出系は反応液25 μl中に、0.2 μM の各outer primer (F3, B3)、1.6 μMの各inner primer (FIP,BIP)、0.8 μMの各loop primer (LF,LB)、1 μlのBst-DNA polymerase、12.5 μlの2×反応液、1 μlのDNA溶液を含み、65℃で1時間反応させた。その後、80℃で2分間の反応停止処理を行なった。反応チューブにはLoopamp反応チューブ(栄研化学)を使用し、遺伝子増幅に伴う濁度の増加はリアルタイム測定装置(Loomamp LA-320C、栄研化学)を用いて測定した。表1にLAMP検出系の反応組成を示す。
Claims (7)
- ジフテリア毒素遺伝子の少なくとも一部をLAMP法により増幅し得るプライマーセットを用意し、
検体からDNAを抽出し、
抽出したDNAを、前記プライマーセットを用いるLAMP法による増幅操作に供し、
増幅操作後に、産物中に、増幅されたDNAが含まれるか否かを確認する、ことを含む
検体中に含まれるジフテリア毒素遺伝子を検出する方法。 - 前記プライマーセットが配列表に示された配列番号1〜4の塩基配列を有する4つのDNAを含む請求項1に記載の方法。
- 前記プライマーセットが配列表に示された配列番号5〜6の塩基配列を有する2つのDNAをさらに含む請求項2に記載の方法。
- 増幅産物中に増幅されたDNAが含まれるか否かを、増幅産物の濁度を測定することで確認するか、または蛍光色素を用いて確認する請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 検体中の菌体に含まれるジフテリア毒素遺伝子をLAMP法により検出するために用いられる、配列表に示された配列番号1〜4の塩基配列を有する4つのDNAを含むプライマーセット。
- 前記プライマーセットが配列表に示された配列番号5〜6の塩基配列を有する2つのDNAをさらに含む請求項5に記載のプライマーセット。
- 請求項5または6に記載のプライマーセットを含む、検体中に含まれるジフテリア毒素遺伝子をLAMP法により検出するためのキット。
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