KR102509304B1 - 환경 ｄｎａ 조사방법을 이용한 도시 생물종 검출방법 및 이를 수행하는 시스템 - Google Patents

환경 ｄｎａ 조사방법을 이용한 도시 생물종 검출방법 및 이를 수행하는 시스템 Download PDF

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Abstract

본 발명은 도시 생태계의 구조 및 기능관리를 위한 생물종의 검출방법에 대한 것으로, 도시 생태계에 존재하는 생물종의 탐지를 위해, 환경 DNA를 조사 및 검출 분석을 수행하여 단일종 또는 다종의 생물종을 효율적이고 신뢰성있게 탐지할 수 있도록 하는 방법 및 시스템 기술을 제공할 수 있도록 한다.

Description

환경 ＤＮＡ 조사방법을 이용한 도시 생물종 검출방법 및 이를 수행하는 시스템{System and method for detecting Species in Urban Ecosystem Using Water Samples}
본 발명은 도시 생태계의 구조 및 기능관리를 위한 생물종의 검출방법에 대한 것이다.
도시의 생태 환경에 존재하는 생물종이나 이들의 서식지의 정보의 조사는, 일반적으로 도시 생태계의 구조 및 기능 관리를 위한 야생동물 모니터링을 위한 위치정보센서를 활용하여 특정 종에 대한 조사 분석이 이루어지고 있는 것이 일반적이다. 특히 생태학 분야에서는 개별 종에 대한 서식 환경을 분석하기 위한 방법으로 무선추적기법의 발달로 다양한 방법이 제시되고 있으며, 무선추적조사는 야생동물의 몸체 발신기를 장착해 송수신 정보로 부터 동물의 위치를 파악하는 특정 종에 대한 생태 정보를 조사하는 방식으로 진행되고 있다.
이러한 전통적인 생태 환경에서의 생물종의 조사와 모니터링 기술은 개체수가 적거나 추적 조사가 어려운 동물의 경우(이를테면, 수생태 생물 등)에는 어려움이 많으며, 최근에는 어류 분류에 대한 시퀀서기술을 적용하여 어류에 대한 정량 및 정성적 분석이 이루어졌으나, 이러한 기술을 일반적인 생물종조사에 적용하는 것은 한계가 있다.
최근 생태 조사를 위해 물, 토양, 공기 등 환경시료로 부터 추출된 DNA(이하, '환경 DNA'라 한다.)의 단편들에 존재하는 생물종이나 개체에 대한 정보가 포함되어 있음을 전제로, 어류, 포유류, 조류 등 생물개체에서 유래한 배설물, 점액, 정자, 알 등 다양한 정보를 분석하여 생물에 대한 정보를 분석하는 기술이 나타나고 있으며, 이러한 기술을 적용하여 생물종에 대한 조사와 분석을 효율화하며, 도시 생태계의 생물종 조사에 적용할 필요성이 커지고 있다.
한국등록특허 제10-2018798호
본 발명은 상술한 과제를 해결하기 위하여 안출된 것으로, 본 발명의 목적은 도시 생태계에 존재하는 생물종의 탐지를 위해, 환경 DNA를 조사 및 검출 분석을 수행하여 단일종 또는 다종의 생물종을 효율적이고 신뢰성있게 탐지할 수 있도록 하는 분석 기술 및 시스템을 제공하는 데 있다.
특히, 본 발명에서는 도시생태계의 건강성 향상 및 취약성 완화를 위해 생물 모니터링에 관한 관심이 높아지고 있는 시점에서 도시 내 저수지, 하천 등의 물 샘플을 이용해 도시생태계의 종 탐지기술을 개발하여 제공하는 데 구체적인 목적이 있다.
상술한 과제를 해결하기 위한 수단으로서, 본 발명의 실시예에서는, 도 1 및 도 2에 도시된 것과 같이, 대상지역에 존재하는 생물종의 검출을 위해, 상기 대상지역 내의 물시료를 채수하는 1단계; 상기 채수된 물시료 내의 환경 DNA를 필터모듈을 통해 필터링하여 수집하는 2단계; 상기 필터모듈의 필터를 원심분리하여 상기 필터내에 존재하는 환경 DNA만을 추출하는 3단계; 상기 추출된 환경 DNA에 대한 생물종의 탐지를 위해 realtime PCR 또는 차세대 시퀀싱(Next Generation Sequencing)을 수행하는 4단계; 상기 4단계의 결과를 유전자데이터베이스 내에 데이터와 비교하여 생물종에 대한 검출결과를 도출하는 5단계;를 포함하는, 환경 DNA 조사 방법을 이용한 도시 생물종 검출 방법을 제공할 수 있도록 한다.
특히, 상기 1단계는, 육상생태계 서식종인 포유류, 조류, 파충류 군에 해당하는 환경 DNA 샘플링을 위한 대상지역의 채수과정이거나, 수생태계 종에 해당하는 어류, 물새류, 양서류 군에 해당하는 환경 DNA 샘플링을 위한 대상지역의 채수과정인,환경 DNA 조사 방법을 이용한 도시 생물종 검출 방법으로 구현할 수 있다.
나아가, 상기 2단계는, 상기 필터모듈은 카트리지형 필터 또는 유리섬유형 필터를 적용하여, 필터내에 채수된 시료내 포함된 환경 DNA의 일부를 추출하는 단계인,환경 DNA 조사 방법을 이용한 도시 생물종 검출 방법을 제공할 수 있다.
또한, 상기 4단계 및 5단계는, 추출된 환경 DNA 중 특정 목표종 탐지를 위한 단일종을 검출하기 위하여 특정종에 대한 프라이머를 구축하고 realtime PCR을 수행하여 단일종에 대한 검출을 수행하는 A단계이거나, 추출된 환경 DNA 중 특정 분류군의 여러 종을 동시에 검출하기 위하여 차세대 시퀀싱(Next Generation Sequencing) 과정을 통해 다종을 동시 검출을 수행하는 B단계를 선택적으로 수행하거나, A단계 및 B단계를 동시에 수행하도록 C단계로 구성되는,환경 DNA 조사 방법을 이용한 도시 생물종 검출 방법을 제공할 수 있다.
나아가, 본 발명의 다른 실시예에서는, 환경 DNA 조사 방법을 이용한 도시 생물종 검출을 수행하는 시스템에 있어서, 생물종 검출을 수행하는 대상지역에서 물(water) 시료를 취수하여 저장하며, 필터링을 통해 상기 물시료 내의 환경DNA를 추출하여 제공하는 샘필시료 검출모듈(100); 상기 샘플시료 검출모듈(100)에서 제공되는 환경 DNA를 로딩하여, 단일종 또는 다수종의 검출목표에 따라 realtime PCR 또는 차세대 시퀀싱(Next Generation Sequencing) 중 어느 하나의 샘플의 증폭분석 방식을 선택하고, 표준 유전자 정보와 대비하여, 대상지역의 생물종의 검출결과를 도출하는 환경 DNA검출모듈(200);육상 또는 수상 생물의 표준 유전자정보를 상기 환경 DNA 검출모듈(200)에 제공하는 표준유전자정보제공모듈(300)을 포함하는, 시세템을 구현하여 제공할 수 있다.
이 경우, 상기 샘플시료 검출모듈(100)은, 상기 대상지역의 물(water) 시료를 취수하여 저장하여 분류하는 수시료취득부(110);와 상기 수시료취득부(110)에서 제공되는 시료의 일부를 채취하여 필터모듈을 통해 시료내 포함된 환경 DNA를 필터로 필터링하는 수시료 필터링부(120); 상기 필터내에 잔류하는 환경 DNA만을 추출하여 분리하는 환경 DNA 추출부(130); 상기 환경 DNA 추출부(130)에서 추출된 환경 DNA를 환경 DNA검출모듈(200)로 제공하는 환경 DNA제공부(140);을 포함하는, 환경 DNA 조사방법을 이용한 도시 생물종 검출시스템으로 구현할 수도 있다.
나아가, 상기 환경 DNA 검출모듈(200)은, 상기 환경 DNA제공부(240)에서 제공되는 환경 DNA를 분류하여 저장하는 환경 DNA로딩부(210); 로딩된 환경 DNA에 대하여 분석을 수행할 생물종을 선택하고, 이에 따른 분석방법을 결정하는 검출방식선정부(220); 상기 검출방식선정부(220)에서 선정된 분석방법에 따라 단일종의 경우에는 추출된 환경 DNA 중 특정 목표종 탐지를 위한 단일종을 검출하기 위하여 특정종에 대한 프라이머를 구축하고 realtime PCR을 수행하여 단일종에 대한 검출을 수행하는 PCR수행부(230); 상기 검출방식선정부(220)에서 선정된 분석방법에 따라 다수 종의 검출의 경우에는, 추출된 환경 DNA 중 특정 분류군의 여러 종을 동시에 검출하기 위하여 차세대 시퀀싱(Next Generation Sequencing) 과정을 수행하는 차세대 시쿼싱 수행부(240); 상기 PCR수행부(230) 또는 상기 차세대 시쿼싱 수행부(240)의 분석결과와 상기 표준유전자정보제공모듈(300)에서 제공되는 정보를 비교하여 생물종의 검출결과를 도출하는 검출결과 비교분석부(250);를 포함하는, 환경 DNA 조사방법을 이용한 도시 생물종 검출시스템으로 구현할 수 있다.
본 발명의 실시예에 따르면, 도시 생태계에 존재하는 생물종의 탐지를 위해, 환경 DNA를 조사 및 검출 분석을 수행하여 단일종 또는 다종의 생물종을 효율적이고 신뢰성있게 탐지할 수 있도록 하는 효과가 있다.
또한, 본 발명에 따른 환경 DNA 조사 방법을 이용한 도시 생물종 검출 방법을 적용하면, 환경 DNA를 바탕으로 지속적인 종 모니터링이 가능하며, 고정밀 위치센서 등 자연환경조사와 ICT 기술 융합을 통한 도시 생태계 모니터링 기술의 고도화를 구현할 수 있다.
도 1은 본 발명의 실시예에 따른 환경 DNA 조사 방법을 이용한 도시 생물종 검출 방법의 진행 순서도를 도시한 것이다.
도 2는 도 1에 따른 환경 DNA 조사 방법을 이용한 도시 생물종 검출 방법을 수행하는 시스템 블록도를 도시한 것이다.
도 3 내지 도 6은 본 발명의 실시예에 따른 일 실험예를 실시한 결과표이다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시예를 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 여기서 설명되는 실시예들에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 실시예들은 개시된 내용이 철저하고 완전해질 수 있도록 그리고 당업자에게 본 발명의 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 제공되는 것이다.
본 출원에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 출원에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미가 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥상 가지는 의미와 일치하는 의미가 있는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
도 1은 본 발명의 실시예에 따른 환경 DNA 조사 방법을 이용한 도시 생물종 검출 방법(이하, '본 발명'이라 한다.)의 진행 순서도를 도시한 것이다. 또한, 도 2는 도 1에 따른 환경 DNA 조사 방법을 이용한 도시 생물종 검출 방법을 수행하는 시스템(이사, '본 시스템'이라 한다.) 블록도를 도시한 것이다.
도 1 및 도 2를 참조하면, 본 발명은, 대상지역에 존재하는 생물종의 검출을 위해, 상기 대상지역 내의 물시료를 채수하는 1단계와, 상기 채수된 물시료 내의 환경 DNA를 필터모듈을 통해 필터링하여 수집하는 2단계, 상기 필터모듈의 필터를 원심분리하여 상기 필터내에 존재하는 환경 DNA만을 추출하는 3단계, 상기 추출된 환경 DNA에 대한 생물종의 탐지를 위해 realtime PCR 또는 차세대 시퀀싱(Next Generation Sequencing)을 수행하는 4단계, 상기 4단계의 결과를 유전자데이터베이스 내에 데이터와 비교하여 생물종에 대한 검출결과를 도출하는 5단계를 포함하여 구성될 수 있다.
상기 1단계는, 도시 생태종의 조사에 필요한 환경 DNA를 채취하기 위한 샘플시료를 확보하는 단계로, 도시 생태종의 경우, 육상생태종, 수생태종으로 구분될 수 있으며, 해당 생태종의 환경 DNA가 포함되어 있는 물(water)시료를 대상지역에서 채취할 수 있도록 한다.
환경 DNA는 물, 토양, 공기 등 환경시료로 부터 채취되는 다양한 생물의 유전 정보 단편을 포괄하는 개념으로, 어류, 포유류, 조류 등 생물개체에서 유래하는 유전 정보를 보유하고 있다. 따라서, 본 발명에서의 상기 1단계는, 육상생태계 서식종인 포유류, 조류, 파충류 군에 해당하는 환경 DNA 샘플링을 위한 대상지역의 채수과정이거나, 수생태계 종에 해당하는 어류, 물새류, 양서류 군에 해당하는 환경 DNA 샘플링을 위한 대상지역의 채수과정으로 구성될 수 있다.
상기 2단계는, 생물종 검출분석이 필요한 대상지역에서 채수된 물 시료의 환경 DNA를 필터모듈을 통해 필터링하여 수집할 수 있도록 한다. 상기 필터모듈은 카트리지형 필터 또는 유리섬유형 필터를 적용하여, 필터내에 채수된 시료내 포함된 환경 DNA의 일부를 추출할 수 있는 장비를 적용하며, 특정 제품에 국한되는 것은 아니다. 일예로, 주사기(syringe)와 모터를 이용하여 0.45um의 포어 사이즈를 가지는 필터를 이용하여 시료에 대한 필터링을 진행할 수 있다. 이와 같은 경우, 필터에는 환경 DNA의 잔류물이 필터링되어 잔류하게 된다.
다음으로, 상기 3단계는, 원심분리기를 이용하여 환경 DNA의 잔류물이 필터링되어 잔류하는 필터에 대한 원심분리를 수행하여, 환경 DNA만을 추출할 수 있도록 한다. 일예로, 환경 DNA가 수집된 필터를 Proteinase K(10mg/ml)와 Buffer AL, PBS buffer를 활용하여 원심분리기를 통해 필터에 존재하는 환경 DNA만을 추출하는 방식으로 구현될 수 있다.
이후, 상기 4단계에서는, 추출된 환경 DNA에 대한 생물종의 탐지를 위해 realtime PCR 또는 차세대 시퀀싱(Next Generation Sequencing)을 수행할 수 있도록 한다.
이 과정의 경우, 특히 추출된 환경 DNA 중 특정 목표종 탐지를 위한 단일종을 검출하기 위하여 특정종에 대한 프라이머를 구축하고 realtime PCR을 수행하여 단일종에 대한 검출을 수행하는 A단계이거나, 추출된 환경 DNA 중 특정 분류군의 여러 종을 동시에 검출하기 위하여 차세대 시퀀싱(Next Generation Sequencing) 과정을 통해 다종을 동시 검출을 수행하는 B단계로 구분하여 수행될 수 있다. 후술하겠으나, 이러한 본 발명의 검출기술을 시스템화하여 구현하는 경우, 이 두가지 검출방식 A단계 및 B단계를 동시에 구현하는 것도 가능하다.
realtime PCR 또는 차세대 시퀀싱(Next Generation Sequencing)의 기술은 다양한 유전분석에서 널리 알려진 기술에 해당하는바, 상세한 설명은 생략하기로 한다.
이와 같이 수행된 분석결과는, 유전자데이터베이스 내에 데이터와 비교하여 생물종에 대한 검출결과를 도출할 수 있게 된다. 이러한 유전자데이터베이스의 일예로는, 국립생물자원관은 국내 주요 생물 종에 대해 유전자원정보관리센터(염기서열, 계통수, 유전체 등)를 데이터베이스화하여 운영하고 있으며, 이러한 서버를 데이터베이스를 활용할 수 있다.
{실험예}
본 발명을 적용하는 분석방법을 수행한 결과로, 황구지천(경기도 소재)의 중류 지점을 대상지역으로 하여 수샘플을 채수하여 분석한것이다.
구체적으로, 대상지 내 접근이 가능한 지점에서 멸균봉투를 이용하여 표층수를 채수하였다. 채수한 물시료인 240ml의 하천 수를 30ml 주사기를 이용해 채취하여, 필터모듈(Sterivex filter unit- 0.45um pore size; Millipore)을 이용하여 필터링을 수행하였다.
필터링을 마친 필터는 지점마다 개별적으로 지퍼백에 담아 아이스박스에 보관하여 실험실로 옮겼으며 이후 -20℃에 DNA 추출 전까지 냉동 보관을 수행하였다.
이후, 환경 DNS(eDNA)의 추출은 QIAGEN Blood and Tissue Kit를 이용하여 진행하였다.
우선, 두 단계로 PCR을 실시하였다.
1차 PCR과정은, 범용적인 프라이머로 미토콘드리아 12S 영역을 증폭시키는 Mi-fish primer set (Miya et al. 2015)를 이용하고, KAPA HiFi ready mix 6ul 포함 최종 부피 12ul로 진행하였다.
구체적인, 1차 PCR 열 조건은 변성(denaturation) 98℃ 20초, 어닐링(annealing) 65℃ 15초, 연장(extension) 72℃ 15초로 35 사이클로 설정하였으며, 동일한 온도로 5분 반응시켜 연장 과정을 마쳤다.
PCR 결과는 1% 아가로스 젤에 전기영동을 통해 증폭을 확인했으며, 확인 후 PCR 산물은 1/10으로 희석하여 2차 PCR 템플릿으로 이용하였다.
2차 PCR은 분석 시료 표지를 위해 unique dual index identifier(UDI) P5, P7 index를 포함하여 총 부피 12ul로 진행하며 열 조건은 1차 PCR과 동일한 조건으로 12 사이클로 설정했다. 증폭된 산물은 풀링(popling) 과정을 통해 동일한 비율로 정제하여 Miseq 시퀀싱을 진행하였다. 도 3 내지 도 5은 이러한 과정을 통해 환경 DNA 메타바코팅의 분석결과를 도시한 것이다.
본 발명을 통해 적용한 황구지천의 상류, 중류, 하류에 걸친 4개의 지점에서는, 출현종을 분석한 결과, 1지점(도 3)에서는 4목 6과12종, 2지점(도 4)에서는, 3목 4과 11종, 3지점(도 5)에서는 4목 4과 12종, 4지점에서는 5목 6과 13종이 검출되는 것을 확인할 수 있다.
이상의 실험예를 도시의 생태하천의 환경 DNA로 수생태종의 검출이 주를 이루게 되나, 이는 육상생태종의 검출에 적용하는 것도 가능함은 물론이다.
상술한 본 발명, 즉 환경 DNA 조사 방법을 이용한 도시 생물종 검출 방법을 구현하는 기술은 모듈화된 장비를 연계하여 자동화된 시스템으로 구축할 수 있다.
도 2를 참조하면, 상술한 도 1에서의 본 발명인 환경 DNA 조사 방법을 이용한 도시 생물종 검출 방법을 구현하는 시스템 구성은 생물종 검출을 수행하는 대상지역에서 물(water) 시료를 취수하여 저장하며, 필터링을 통해 상기 물시료 내의 환경DNA를 추출하여 제공하는 샘필시료 검출모듈(100), 상기 샘플시료 검출모듈(100)에서 제공되는 환경 DNA를 로딩하여, 단일종 또는 다수종의 검출목표에 따라 realtime PCR 또는 차세대 시퀀싱(Next Generation Sequencing) 중 어느 하나의 샘플의 증폭분석 방식을 선택하고, 표준 유전자 정보와 대비하여, 대상지역의 생물종의 검출결과를 도출하는 환경 DNA검출모듈(200), 육상 또는 수상 생물의 표준 유전자정보를 상기 환경 DNA 검출모듈(200)에 제공하는 표준유전자정보제공모듈(300)을 포함하여 구성될 수 있다.
구체적으로, 상기 샘플시료 검출모듈(100)은, 상기 대상지역의 물(water) 시료를 취수하여 저장하여 분류하는 수시료취득부(110)와 상기 수시료취득부(110)에서 제공되는 시료의 일부를 채취하여 필터모듈을 통해 시료내 포함된 환경 DNA를 필터로 필터링하는 수시료 필터링부(120), 상기 필터내에 잔류하는 환경 DNA만을 추출하여 분리하는 환경 DNA 추출부(130), 상기 환경 DNA 추출부(130)에서 추출된 환경 DNA를 환경 DNA검출모듈(200)로 제공하는 환경 DNA제공부(140)을 포함하여 구성될 수 있다.
즉, 수시료취득부(110)은 외부에서 채취된 수샘플을 저장하는 저장모듈로 구성될 수 있으며, 필터모듈을 내장하고, 모터와 주사기를 통해 주입된 샘플시료를 필터로 필터링하는 구성으로 구현되는 수시료 필터링부(120)의 구성을 구비할 수 있다. 상기 환경 DNA 추출부(130)는 원심분리기를 포함하는 구성으로, 필터를 원심분리하여 환경 DNA만을 추출하도록 구성할 수 있으며, 자동회된 로딩유닛이나 이송유닛을 포함하는 환경 DNA제공부(140)를 통하여, 상기 환경 DNA 추출부(130)에서 추출된 환경 DNA를 환경 DNA검출모듈(200)로 제공할 수 있도록 구성할 수 있다.
또한, 상기 환경 DNA 검출모듈(200)은, 샘플시료 검출모듈(100)에서 제공되는 환경 DNA를 로딩하여, 단일종 또는 다수종의 검출목표에 따라 realtime PCR 또는 차세대 시퀀싱(Next Generation Sequencing) 중 어느 하나의 샘플의 증폭분석 방식을 선택하고, 표준 유전자 정보와 대비하여, 대상지역의 생물종의 검출결과를 도출하는 기능을 구현할 수 있다.
이를 위해, 상기 환경 DNA 검출모듈(200)은 상기 환경 DNA제공부(240)에서 제공되는 환경 DNA를 분류하여 저장하는 환경 DNA로딩부(210), 로딩된 환경 DNA에 대하여 분석을 수행할 생물종을 선택하고, 이에 따른 분석방법을 결정하는 검출방식선정부(220), 상기 검출방식선정부(220)에서 선정된 분석방법에 따라 단일종의 경우에는 추출된 환경 DNA 중 특정 목표종 탐지를 위한 단일종을 검출하기 위하여 특정종에 대한 프라이머를 구축하고 realtime PCR을 수행하여 단일종에 대한 검출을 수행하는 PCR수행부(230), 상기 검출방식선정부(220)에서 선정된 분석방법에 따라 다수 종의 검출의 경우에는, 추출된 환경 DNA 중 특정 분류군의 여러 종을 동시에 검출하기 위하여 차세대 시퀀싱(Next Generation Sequencing) 과정을 수행하는 차세대 시쿼싱 수행부(240)를 포함하여 구성될 수 있다. 즉, 본 시스템에서 모든 종에서 존재하는 특정한 서열을 증폭한 뒤 그 서열들을 NGS(차세대 시퀀싱)을 이용해 시퀀싱하고 그 다수의 종들의 염기서열 조각들을 BLAST를 활용해 종을 동정하여 그 환경에 존재하는 생물상을 규명하도록 하는 메타바코딩은, 포유류의 경우 Mi-mammal, 어류의 경우 Mi-fish 등 범용적인 프라이머를 이용하여 NGS를 통해 염기서열 및 종 분별을 수행할 수 있도록 한다.
나아가, 특정 종은, 종 특이적 프라이머를 이용하며 종 간 DNA 검출율을 비교하기 위해서는 rtPCR을 이용할 수 있도록 한다.
추가적으로, 본 시스템은 상기 PCR수행부(230) 또는 상기 차세대 시쿼싱 수행부(240)의 분석결과와 상기 표준유전자정보제공모듈(300)에서 제공되는 정보를 비교하여 생물종의 검출결과를 도출하는 검출결과 비교분석부(250)를 포함하여 구성될 수 있다.
나아가, 상기 검출결과 비교분석부(250)의 결과는 검출결과 표시부(260)을 통해 디스플레이될 수 있도록 하며, 해당 결과를 외부로 전송하는 통신부를 더 부가하여 구성될 수 있다.
또한, 검출결과분석부(270)를 더 포함하여 구성될 수 있으며, 상기 검출결과분석부(270)에서는 분석된 검출결과를 기존 결과와 대비하여, 신규 출현 생태종의 비율과 종류를 구분하고, 이에 대한 별도의 유전분석을 수행하도록 하거나, 외부 분석자료와 대비하여 업데이트화할 수 있도록 하는 기능을 구현할 수 있도록 한다.
또한, 육상 또는 수상 생물의 표준 유전자정보를 상기 환경 DNA 검출모듈(200)에 제공하는 표준유전자정보제공모듈(300)에서 제공하는 유전정보와의 비교과정으로, 염기서열 분석 및 종 목록 확인은, FASTA 프로그램을 이용 기존 생물종 유전자 정보 DB와의 비교하는 방식으로 구현할 수 있도록 한다.
상술한 본 시스템에 적용되는 기능 구성 및 수행동작은 기능적인 블록 구성들 및 다양한 처리 단계들로 나타내어질 수 있다. 이러한 기능 블록들은 특정 기능들을 실행하는 다양한 개수의 하드웨어 또는/및 소프트웨어 구성들로 구현될 수 있다. 예를 들어, 본 발명은 하나 이상의 마이크로프로세서들의 제어 또는 다른 제어 장치들에 의해서 다양한 기능들을 실행할 수 있는, 메모리, 프로세싱, 로직(logic), 룩업 테이블(look-up table) 등과 같은 직접 회로 구성들을 채용할 수 있다.
이상에서와 같이 본 발명의 기술적 사상은 바람직한 실시예에서 구체적으로 기술되었으나, 상기한 바람직한 실시예는 그 설명을 위한 것이며, 그 제한을 위한 것이 아니다. 이처럼 이 기술 분야의 통상의 전문가라면 본 발명의 기술 사상의 범위 내에서 본 발명의 실시예의 결합을 통해 다양한 실시예들이 가능함을 이해할 수 있을 것이다.
100: 샘플시료 검출모듈
200: 환경 DNA 검출모듈
300: 표준 유전자 정보 제공모듈
400: 유전자 데이터베이스

Claims (7)

  1. 생물종 검출을 수행하는 대상지역에서 물(water) 시료를 취수하여 저장하며, 필터링을 통해 상기 물시료 내의 환경DNA를 추출하여 제공하는 샘플시료 검출모듈(100); 상기 샘플시료 검출모듈(100)에서 제공되는 환경 DNA를 로딩하여, 단일종 또는 다수종의 검출목표에 따라 realtime PCR 또는 차세대 시퀀싱(Next Generation Sequencing) 중 어느 하나의 샘플의 증폭분석 방식을 선택하고,
    표준 유전자 정보와 대비하여, 대상지역의 생물종의 검출결과를 도출하는 환경 DNA검출모듈(200); 육상 또는 수상 생물의 표준 유전자정보를 상기 환경 DNA 검출모듈(200)에 제공하는 표준유전자정보제공모듈(300);을 포함하며,
    상기 환경 DNA 검출모듈(200)은,
    환경 DNA제공부(140)에서 제공되는 환경 DNA를 분류하여 저장하는 환경 DNA로딩부(210); 로딩된 환경 DNA에 대하여 분석을 수행할 생물종을 선택하고, 이에 따른 분석방법을 결정하는 검출방식선정부(220); 상기 검출방식선정부(220)에서 선정된 분석방법에 따라 단일종의 경우에는 추출된 환경 DNA 중 특정 목표종 탐지를 위한 단일종을 검출하기 위하여 특정종에 대한 프라이머를 구축하고 realtime PCR을 수행하여 단일종에 대한 검출을 수행하는 PCR수행부(230); 상기 검출방식선정부(220)에서 선정된 분석방법에 따라 다수 종의 검출의 경우에는, 추출된 환경 DNA 중 특정 분류군의 여러 종을 동시에 검출하기 위하여 차세대 시퀀싱(Next Generation Sequencing) 과정을 수행하는 차세대 시쿼싱 수행부(240); 상기 PCR수행부(230) 또는 상기 차세대 시쿼싱 수행부(240)의 분석결과와 상기 표준유전자정보제공모듈(300)에서 제공되는 정보를 비교하여 생물종의 검출결과를 도출하는 검출결과 비교분석부(250);를 포함하는, 환경 DNA 조사방법을 이용한 도시 생물종 검출시스템을 적용하여,
    대상지역에 존재하는 생물종의 검출을 위해, 상기 대상지역 내의 물시료를 채수하는 1단계; 상기 샘플시료 검출모듈(100)에서 상기 채수된 물시료 내의 환경 DNA를 필터모듈을 통해 필터링하여 수집하는 2단계; 상기 환경 DNA검출모듈(200)에서 상기 필터모듈의 필터를 원심분리하여 상기 필터내에 존재하는 환경 DNA만을 추출하는 3단계 및 상기 추출된 환경 DNA에 대한 생물종의 탐지를 위해 realtime PCR 또는 차세대 시퀀싱(Next Generation Sequencing)을 수행하는 4단계;를 수행하고, 상기 4단계의 결과를 상기 표준유전자정보제공모듈(300)에서 제공되는 유전자데이터베이스 내에 데이터와 비교하여 생물종에 대한 검출결과를 도출하는 5단계;를 포함하며,
    육상생태계 서식종 또는 해양생태계서식종을 판별하도록 하되, 상기 4단계 및 5단계는, 상기 도시 생물종 검출시스템의 상기 환경 DNA검출모듈(200)에서
    추출된 환경 DNA 중 특정 목표종 탐지를 위한 단일종을 검출하기 위하여 특정종에 대한 프라이머를 구축하고 realtime PCR을 수행하여 단일종에 대한 검출을 수행하는 A단계 또는 추출된 환경 DNA 중 특정 분류군의 여러 종을 동시에 검출하기 위하여 차세대 시퀀싱(Next Generation Sequencing) 과정을 통해 다종을 동시 검출을 수행하는 B단계, 또는 A단계 및 B단계를 동시에 수행하도록 C단계를 선택적으로 수행할 수 있도록 하는,
    환경 DNA 조사 방법을 이용한 도시 생물종 검출 방법.
  2. 삭제
  3. 청구항 1에 있어서,
    상기 2단계는,
    상기 필터모듈은 카트리지형 필터 또는 유리섬유형 필터를 적용하여, 필터내에 채수된 시료내 포함된 환경 DNA의 일부를 추출하는 단계인,
    환경 DNA 조사 방법을 이용한 도시 생물종 검출 방법.
  4. 삭제
  5. 환경 DNA 조사 방법을 이용한 도시 생물종 검출을 수행하는 시스템에 있어서,
    생물종 검출을 수행하는 대상지역에서 물(water) 시료를 취수하여 저장하며, 필터링을 통해 상기 물시료 내의 환경DNA를 추출하여 제공하는 샘플시료 검출모듈(100); 상기 샘플시료 검출모듈(100)에서 제공되는 환경 DNA를 로딩하여, 단일종 또는 다수종의 검출목표에 따라 realtime PCR 또는 차세대 시퀀싱(Next Generation Sequencing) 중 어느 하나의 샘플의 증폭분석 방식을 선택하고,
    표준 유전자 정보와 대비하여, 대상지역의 생물종의 검출결과를 도출하는 환경 DNA검출모듈(200); 육상 또는 수상 생물의 표준 유전자정보를 상기 환경 DNA 검출모듈(200)에 제공하는 표준유전자정보제공모듈(300);을 포함하며,
    상기 샘플시료 검출모듈(100)은, 상기 대상지역의 물(water) 시료를 취수하여 저장하여 분류하는 수시료취득부(110);와 상기 수시료취득부(110)에서 제공되는 시료의 일부를 채취하여 필터모듈을 통해 시료내 포함된 환경 DNA를 필터로 필터링하는 수시료 필터링부(120); 상기 필터내에 잔류하는 환경 DNA만을 추출하여 분리하는 환경 DNA 추출부(130); 상기 환경 DNA 추출부(130)에서 추출된 환경 DNA를 환경 DNA검출모듈(200)로 제공하는 환경 DNA제공부(140);를 포함하며,
    상기 환경 DNA 검출모듈(200)은,
    상기 환경 DNA제공부(140)에서 제공되는 환경 DNA를 분류하여 저장하는 환경 DNA로딩부(210); 로딩된 환경 DNA에 대하여 분석을 수행할 생물종을 선택하고, 이에 따른 분석방법을 결정하는 검출방식선정부(220); 상기 검출방식선정부(220)에서 선정된 분석방법에 따라 단일종의 경우에는 추출된 환경 DNA 중 특정 목표종 탐지를 위한 단일종을 검출하기 위하여 특정종에 대한 프라이머를 구축하고 realtime PCR을 수행하여 단일종에 대한 검출을 수행하는 PCR수행부(230); 상기 검출방식선정부(220)에서 선정된 분석방법에 따라 다수 종의 검출의 경우에는, 추출된 환경 DNA 중 특정 분류군의 여러 종을 동시에 검출하기 위하여 차세대 시퀀싱(Next Generation Sequencing) 과정을 수행하는 차세대 시쿼싱 수행부(240); 상기 PCR수행부(230) 또는 상기 차세대 시쿼싱 수행부(240)의 분석결과와 상기 표준유전자정보제공모듈(300)에서 제공되는 정보를 비교하여 생물종의 검출결과를 도출하는 검출결과 비교분석부(250);를 포함하며,
    상기 환경 DNA 검출모듈(200)이 추출된 환경 DNA 중 특정 목표종 탐지를 위한 단일종을 검출하기 위하여 특정종에 대한 프라이머를 구축하고 realtime PCR을 수행하여 단일종에 대한 검출을 수행하는 A단계 또는 추출된 환경 DNA 중 특정 분류군의 여러 종을 동시에 검출하기 위하여 차세대 시퀀싱(Next Generation Sequencing) 과정을 통해 다종을 동시 검출을 수행하는 B단계를 선택적으로 수행하거나, A단계 및 B단계를 동시에 수행하도록 C단계를 진행할 수 있도록 하는,
    환경 DNA 조사방법을 이용한 도시 생물종 검출시스템.
  6. 삭제
  7. 삭제
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Kim, WM. et al., Journal of the Korean Society of Environmental Restoration Technology (2020) 23(2):69-89 (2020.04.30. 공개)*
Miya, M. et al., Journal of Visualized Experiments (2016) 117:e54741*

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