CN1632117A - 一种分子标记及其开发方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种分子标记及其开发方法，本发明依据内含子长度的不同，在内含子两侧外显子上或在内含子内部差异位点两侧保守序列上设计引物，并通过电子PCR和实际PCR进行检验，从而将ILP开发成能够用PCR进行检测的分子标记。这种标记具有共显性、数量丰富、实验简单、稳定性好、特异性高等优点，可应用于遗传图谱构建、基因或QTL定位、标记辅助育种、遗传多样性分析、基因组研究等许多方面。
Description
技术领域
本发明涉及基因组学、生物信息学和分子生物学三个领域，特别地，涉及一种分子标记以及利用基因组测序和cDNA测序数据开发这种分子标记的方法。
背景技术
遗传标记是指可以明确反映遗传多态性的生物特征。根据生物特征所表现的层次，遗传标记可分成形态标记、细胞学标记、生化标记、分子标记四种类型。其中分子标记是DNA水平上遗传变异的直接反映，具有数量丰富，信息量大，与基因表达无关，检测不受季节、环境和个体发育阶段的影响等优点，因而是最理想的遗传标记。分子标记广泛应用于遗传作图、基因定位、基因克隆、动植物育种、遗传多样性分析、亲缘关系鉴定、遗传病鉴定、法医学鉴定等许多领域，因而具有重要的理论和应用价值。
自1980年首次提出分子标记的概念以来，已经发展出十多种分子标记。但除了第一代分子标记RFLP(限制性片段长度多态性)是基于DNA Southern杂交技术的之外，后来发展的分子标记皆是基于DNA扩增(PCR)技术的。PCR技术由于操作方便，因而更受欢迎。早期发展出的基于PCR的分子标记主要有RAPD(随机扩增多态DNA)、AFLP(扩增片段长度多态性)、ISSR(简单序列重复间区)等。这些标记的特点是扩增产物是随机的，且一般表现为显性，因而不太理想，目前已用得较少。随着分子标记技术的发展，人们越来越青睐特异引物的分子标记，因为它们在染色体上的位置是已知的，而且通常表现为共显性。目前最受欢迎的特异引物标记是微卫星(或称SSR)标记，它具有多态性高、数量丰富、在基因组中分布均匀等优点。SSR标记的不足是前期开发需要很高的投入，但一旦开发成功，使用起来就非常方便，使用户受益无穷。目前，对于已完成全基因组测序的拟南芥和水稻来说，借助生物信息学手段，开发SSR标记已不太困难。目前在水稻中已开发出将近3000个SSR标记。另外，数量最为丰富的SNP(单核苷酸多态性)也正成为一种极具应用潜力的新型分子标记。SNP不仅可以通过PCR进行检测，也可以通过DNA芯片来检测。但目前对SNP的检测在技术上还显得太复杂，难度较大，因而还难以广泛应用。
发明内容
本发明的目的是利用已完成基因组测序及大量cDNA测序的动植物，提供一种分子标记。
该发明目的是通过以下技术方案来实现的：一种分子标记，其特征在于，它是基因的内含子。进一步地，所述分子标记基于基因的内含子长度的多态性。
本发明的目的还在于提供一种分子标记的开发方法。
该发明目的是通过以下技术方案来实现的：一种权利要求1所述的分子标记的开发方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)序列下载：获得基因组序列和cDNA序列；
(2)序列分析：将获得的基因组序列与cDNA序列进行联配，得到每个基因的内含子数量及长度，对相应的内含子进行比较，从而得到两基因组间有长度差异的内含子；
(3)引物设计：引物设计在两侧的外显子上或在内含子内部差异位点两侧的保守序列上；
(4)电子PCR：利用设计的引物和基因组序列进行电子PCR，选择只有一个PCR产物的标记作为分子标记；
(5)命名：将通过电子PCR获到的分子标记进行命名；
(6)建立数据库：建立分子标记的数据库，内容包括标记的序列、引物及其所在的基因组DNA克隆和cDNA的名称以及实际PCR产物的电泳结果照片。
进一步地，所述步骤(3)中，所述引物长度一般在18-25碱基之间；所述步骤(5)中，所述命名方式为：用RI开头，后面跟上数字，每一个标记的名称都是唯一的；所述步骤(6)中，所述数据库采用MySQL作为关系数据库，采用PHP语言来编写Web检索系统。
本发明具有以下技术效果：本发明的基于内含子长度多态性的分子标记具有共显性、数量丰富、稳定性好、在基因组中位置已知、特异性高等优点，而且实验操作简单方便，结果可靠。利用本发明的技术方法对93-11，日本晴，F1(93-11/日本晴)，广陆矮，协青早，IR64，越光，秀水11，Merim，Katy，Kyeema进行实验，所有品种都有扩增产物，差异明显，多态性水平高。这一内含子长度多态性的分子标记可应用于遗传图谱构建、基因或QTL定位和图位克隆、标记辅助育种、遗传多样性分析、基因组研究等许多方面。
附图说明
图1是本发明的开发方法的流程图；
图2是本发明ILP的示意图；
图3是本发明引物设计的示意图；
图4是本发明的分子标记的PCR扩增的实例图，泳道1-12分别为Marker，93-11，日本晴，F1(93-11/日本晴)，广陆矮，协青早，IR64，越光，秀水11，Merim，Katy，Kyeema。
具体实施方式
本发明的分子标记基于内含子长度多态性(Intron Length Polymorphism，ILP)。内含子是基因中的非编码区段，具有很高的遗传多态性，因而可以作为一种分子标记。水稻和拟南芥已经完成全基因组测序，并且已在两个亚种或生态型上完成测序，并已测定了大量的全长cDNA序列，有关资料可以从互联网数据库[如TIGR(http：//www.tigr.org)、RGP(http：//rgp.dna.affrc.go.jp/)、BGI(http：//rise.genomics.org.ac)等]获得。借助生物信息学的方法，对DNA序列数据进行有效的分析。这为大规模检索和开发基于内含子多态性的分子标记提供了可能。
下面根据附图，以水稻为例详细说明本发明分子标记的开发方法。
如图1所示，本发明的分子标记的开发方法包括以下步骤：
1、序列下载
利用国际水稻测序中心发布的粳稻品种Nipponbare的基因组序列数据和华大基因中心发布的籼稻品种93-11的基因组序列数据，分别从TIGR网站(http：//www.tigr.org)和Rise网站(http：//rise.genomics.org.cn)下载。此外，还利用已公布的水稻全长cDNA序列数据，从日本的KOME网站http：//cdna01.dna.affrc.go.jp/cDNA/)下载。
2、序列分析
通过BLASTN程序(参数为e值＜10-20)，把cDNA与Nipponbare和93-11的基因组序列进行联配，获得匹配最好的基因组序列，然后通过SIM4程序把cDNA序列与基因组序列进行精确联配，获得每个基因的内含子数量及长度，并对相应的内含子进行比较，获得两亚种基因组间有长度差异的内含子，如图2所示。
3、引物设计
对于长度较短(＜500bp)的内含子，PCR引物设计在两侧的外显子上，其好处是外显子较基因组的其它序列要保守。但对于长度较长(＞500bp)的内含子，则在内含子内部差异位点两侧的保守序列上设计引物。引物长度一般在18-25碱基之间，退火温度一般在54-60℃之间。用primer3的程序进行引物设计，如图3所示。一般在不同的位置设计出五对引物，供选择。
4、电子PCR
在进行电子PCR时，将误配碱基数设定为0个。选择只有一个PCR产物的标记作为候选标记，去除一对引物在不同克隆上扩增到多个PCR产物的标记。
5、命名
将通过电子PCR获到的分子标记进行命名，命名方式为：用RI开头，后面跟上数字，例如：RI00008。每一个标记的名称都是唯一的。
6、建立数据库
在前面开发工作的基础上，建立水稻ILP标记的数据库(基于多态性的关系数据库)，内容包括标记的序列、引物及其所在的籼、粳稻基因组DNA克隆和cDNA的名称以及实际PCR产物的电泳结果照片。本数据库采用MySQL作为关系数据库，采用PHP语言来编写Web检索系统。
下面实验验证本发明分子标记引物的正确性和可行性，并检验引物的通用性和多态性水平。
图4是本发明的分子标记的PCR扩增的实例，泳道1-12分别为Marker，93-11，日本晴，F1(93-11/日本晴)，广陆矮，协青早，IR64，越光，秀水11，Merim，Katy，Kyeema
为了验证分子标记引物的正确性和可行性，合成标记的引物，以Nipponbare和93-11为材料，剪取幼嫩叶片提取基因组DNA作为模板，按常规PCR程序进行扩增。退火温度设定在54-60℃之间，循环35次。根据预测的扩增产物大小的不同，在琼脂糖凝胶或非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离，用紫外线照射或银染显带。扩增结果与预期吻合的，说明引物设计是正确的和可行的。
为了检验引物的通用性和多态性水平，选择若干个不同亚种或生态类型的水稻品种，用上述合成的引物，按上述相同的方法进行实验，观察各个品种的扩增情况和差异条带数目。在所有品种中皆有扩增产物的，说明通用性好；差异条带数多的，说明多态性水平高。
上述实施例用来解释说明本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种分子标记，其特征在于，它是基因的内含子。
2.根据权利要求1所述的分子标记，其特征在于，所述分子标记基于基因的内含子长度的多态性。
3.根据权利要求1所述的分子标记，其特征在于，该分子标记的PCR产物长度在100～1100bp以内。
4.一种权利要求1所述的分子标记的开发方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)序列下载：获得基因组序列和cDNA序列。
(2)序列分析：将获得的基因组序列与cDNA序列进行联配，得到每个基因的内含子数量及长度，对相应的内含子进行比较，从而得到两基因组间有长度差异的内含子。
(3)引物设计：引物设计在两侧的外显子上或在内含子内部差异位点两侧的保守序列上。
(4)电子PCR：利用设计的引物和基因组序列进行电子PCR，选择只有一个PCR产物的标记作为分子标记。
(5)命名：将通过电子PCR获到的分子标记进行命名。
(6)建立数据库：建立分子标记的数据库，内容包括标记的序列、引物及其所在的基因组DNA克隆和cDNA的名称以及实际PCR产物的电泳结果照片。
5.根据权利要求4所述的开发方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述引物长度一般在18-25碱基之间。
6.根据权利要求4所述的开发方法，其特征在于，所述步骤(5)中，所述命名方式为：用RI开头，后面跟上数字，每一个标记的名称都是唯一的。
7.根据权利要求4所述的开发方法，其特征在于，所述步骤(6)中，所述数据库采用MySQL作为关系数据库，采用PHP语言来编写Web检索系统。
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