CN100393889C - 禾本科通用型标记iacgm - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种通用型分子标记的开发方法，包括利用已知物种的基因组序列数据，还包括以下步骤：1)在已知一个物种A的内含子长度多态性、即ILP的基础上，借助生物信息学方法，将ILP所在的物种A与物种B的cDNA测序数据进行比对，在物种B的全基因组范围内搜索与该物种A的ILP所在cDNA同源的cDNA；物种B为物种A同科但不同属的物种；2)PCR引物设计：在多态内含子两侧外显子的保守序列上设计PCR引物，并通过电子PCR和实际PCR进行检验；从而开发出能够在与物种A同科不同种或同科不同属的物种内，通过PCR进行检测的通用型分子标记，即IACGM。利用本发明的开发方法，能设计出通用性好、特异性高、称为基于内含子长度多态性的扩增共有序列遗传标记。
Description
技术领域
本发明涉及基因组学、生物信息学和分子生物学这三大领域，确切地说，涉及一种通用型分子标记的开发方法，以及依此方法开发的禾本科通用型标记。
背景技术
遗传标记是指可以明确反映遗传多态性的生物特征。根据生物特征所表现的层次，遗传标记可分成形态标记、细胞学标记、生化标记、分子标记四种类型。其中分子标记是DNA水平上遗传变异的直接反映，具有数量丰富，信息量大，与基因表达无关，检测不受季节、环境和个体发育阶段的影响等优点，因而是最理想的遗传标记。分子标记广泛应用于遗传作图、基因定位、基因克隆、动植物育种、遗传多样性分析、亲缘关系鉴定、遗传病鉴定、法医学鉴定等许多领域，因而具有重要的理论和应用价值。
自1980年首次提出分子标记的概念以来，已经发展出十多种分子标记。但除了第一代分子标记RFLP(限制性片段长度多态性)是基于DNA Southern杂交技术的之外，后来发展的分子标记皆是基于DNA扩增(PCR)技术的。PCR技术由于操作方便，因而更受欢迎。基于PCR的分子标记主要有两种类型，一种类型标记的扩增产物是随机的，如RAPD(随机扩增多态DNA)、AFLP(扩增片段长度多态性)、ISSR(简单序列重复间区)等。这些标记虽然适用于各种生物，但是由于扩增产物没有特异性，使得其在不同物种(特别是远缘物种)间缺乏可比性，因而并不能作为不同物种间的通用型分子标记。另一种类型为特异引物的分子标记，其扩增产物是特异的，它们在染色体上的位置是已知的，而且通常表现为共显性。目前应用最多的特异引物分子标记是微卫星(或称SSR)标记，它具有多态性高、数量丰富、在基因组中分布均匀等优点。但由于除了位于编码区的EST-SSR之外，SSR标记大多数分布在保守性低的无用序列区域，因而其引物通常只在本物种中才具有特异性，用到其它物种中时往往丧失特异性，退化为随机引物，所以通用性差。高等真核生物基因组中具有功能的基因和调控序列仅占很小的比例(编码序列一般只占整个基因组的十分之一)，大部分都是无用的序列。不同物种间的序列同源性主要存在于基因和调控序列中，而那些无用序列则往往同源性很低。因此，基于基因序列开发的标记的通用性和可靠性较随机引物要高许多。目前，对于已完成全基因组测序的拟南芥和水稻来说，借助生物信息学手段，开发特异性标记已不太困难，但是对于那些目前尚没有测序或已知序列较少的物种而言，很难开发特异性的分子标记。Saha等根据牛毛草的EST-SSR开发了157对SSR标记引物，试验表明，这些引物在禾本科不同种属间中具有一定的通用性。
Brunel等提出了一种基于PCR技术且通用性很好的分子标记，称为扩增共有序列遗传标记(ACGM)。该技术是根据一种植物中已知功能的基因的保守编码序列设计引物对另一种植物进行PCR扩增。但是，在不同物种间开发具有一定通用性的ACGM引物是比较困难的，目前仅见拟南芥和芸苔属之间的研究报道，在引物的开发上也是利用它们之间的同源基因相互探测。也有关于直接利用数据库中的信息对不同物种直接进行tBLASTX研究的报道。
内含子是基因中的非编码区段，具有很高的遗传多态性。已有的研究发现ACGM标记在芸苔属和拟南芥之间多态位点多存在于内含子区域。吴为人等在水稻籼稻和粳稻亚种之间检测到大量的内含子多态位点并开发了一种大规模检测内含子多态性位点的方法，这为直接应用内含子多态位点开发ACGM标记提供了便利。目前如何直接应用内含子多态位点开发ACGM标记，尚未见相关研究报道。
发明内容
针对现有技术中存在的不足之处，本发明利用已知物种的基因序列、基于内含子长度多态，提供一种能设计通用性好、特异性高、称为基于内含子长度多态性的扩增共有序列遗传标记(intron length polymorphism-based amplified consensus genetic marker，IACGM)的通用型分子标记开发方法。
本发明为达到以上目的，是通过这样的技术方案来实现的：提供一种通用型分子标记的开发方法，包括利用已知物种的基因组序列数据，还包括以下步骤：
1)在已知一个物种A的内含子长度多态性、即ILP的基础上，借助生物信息学方法，将ILP所在的物种A与物种B的cDNA测序数据进行比对，在物种B的全基因组范围内搜索与该物种A的ILP所在cDNA同源的cDNA；物种B为物种A同科但不同属的物种；；
2)PCR引物设计：在多态内含子两侧外显子的保守序列上设计PCR引物，并通过电子PCR和实际PCR进行检验；从而开发出能够在与物种A同科不同种或同科不同属的物种内，通过PCR进行检测的通用型分子标记，即IACGM。。
作为本发明的通用型分子标记的开发方法的一种改进：物种为已具备基因组和cDNA测序数据的动物或植物。
以禾本科为例，本发明的IACGM标记的开发方法的内容如下：
1、在内含子长度多态两侧不同属的物种全基因组之间搜索同源基因：在已知水稻籼、粳稻品种内含子长度多态性(ILP)的基础上，借助生物信息学方法，该将ILP所在水稻的cDNA序列与另外一种或几种与禾本科其它属的物种cDNA测序数据进行比对，在不同属的全基因组范围内搜索与该ILP所在cDNA同源的cDNA。
2、PCR引物设计：在多态内含子两侧外显子的保守序列上设计PCR引物，并通过电子PCR和实际PCR进行检验，从而开发成能够在同一科不同种或属物种内通过PCR进行检测的通用型内含子多态分子标记(IACGM)。对所设计引物的正确性和特异性通过电子PCR进行检验。
3、实验检验：以用于搜索内含子长度多态性的那对籼、粳稻品种为材料，用设计的引物进行实际的PCR分析，检验所开发的ILP引物的正确性和可行性。同时，另外选取若干个不同属的禾本科植物为材料，进行PCR分析，以检验所开发的IACGM引物的通用性和多态性水平。
IACGM的标记引物选自下列引物对，其中的核苷酸序列为5′→3′，
IGA1 正向：CCGTCAACAAAGTTTGCTCC
反向：ATTGGACATGCTCTCCATCC
IGA2 正向：AGCTCATCGACTCTGTGCTC
反向：GGGTACTCCTCTCTGATCTTGG
IGA3 正向：CCTCGACGGCTTCTCCTT
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反向：TGTCCTTGTGGCTGAAGAAG
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反向：GACTGCTCGTCGTACTCGTC
IGA7 正向：GAGGTCGGCATCAAGAAGTT
反向：GTACGACTGCATCGTCGG
IGA8 正向：AAGAAGAAGGAGAGGGCGAC
反向：AATCAAGCGAGAGTGCCAGT
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IGA10 正向：GGGAGCTTGGAAAATCATCTG
反向：TGAAGGTAAGCTAGTCCTTTTGC
IGA11 正向：GCACCACAGGAACCTCGTC
反向：GATTTTCCATCTTTGCTGCC
IGA12 正向：TCCTCCACCACCAGCCAT
反向：GCGTCAGCATCTCGTTCAG
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反向：ACAATGTCGCGCTCGGTAG
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反向：GTGAGCACCTCCAGCACC
IGA15 正向：AGAGCTATTGGTGCTGACAGA
反向：CAACAGTGGCTTACCACCAT
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反向：CCCATAGGGAAAGCAGGAAG
IGA17 正向：GCTAAGGTGAACCTCCCCA
反向：TGTTGTCGCAGACGATCTTG
IGA18 正向：ACCAGGAACGAGTACAACGG
反向：CTACTCCGGCGATCACGA
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反向：CTCTGTCCACCACGCTGAA
IGA20 正向：GACATGATGAAGACGGCAAA
反向：GAAGCAGCACACGTAGATGG
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反向：AGCAATGCTCGCCTATCCT
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反向：TCCTGATCGGTCACATTGAA
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反向：TTGCCATTAGGGTCCTTGA。
通用型引物与随机引物不同，通用型引物在不同物种中锚定的扩增区域在进化上是同源基因。
本发明的通用型分子标记的开发方法，是针对已完成基因组测序及大量cDNA测序的动植物(如人类、水稻、拟南芥)的。由于IACGM标记是在基因序列中开发的，因此具有通用性好、特异性高等优点，可应用于遗传图谱构建、基因同源克隆、遗传多样性分析、基因组研究等许多方面。
附图说明
图1是本发明的IACGM标记的开发路线示意图；
图2是IACGM标记所用引物的设计方法示意图。
具体实施方式
参照上述附图，对本发明的具体实施方式进行详细说明。
实施例1、
1、序列下载：
本发明利用国际水稻测序中心发布的粳稻品种Nipponbair的基因组序列数据和禾本科其它物种基因组序列数据，分别从TIGR网站(http://www.tigr.org)和NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.org)下载。此外，还利用已公布的水稻全长cDNA序列数据，从日本的KOME网站(http://cdna01.dna.affrc.go.jp/cDNA/)下载。
2、序列分析：
用所有水稻候选ILP标记引物对小麦、大麦和玉米的cDNA/EST库进行BLASTN搜索，选取错配碱基数＜4的保守引物。
3、引物设计：
对初选的水稻ILP标记，进一步在其内含子两侧的外显子上用ePrimer3软件重新设计引物，以提高引物的保守性。引物长度一般在18-25碱基之间，退火温度一般在50-62℃之间。
所设计的引物具体由下列核苷酸序列组成：
| 标记 | 正向引物序列(5′→3′) | 反向引物序列(5′→3′) |
| IGA1 | CCGTCAACAAAGTTTGCTCC | ATTGGACATGCTCTCCATCC |
| IGA2 | AGCTCATCGACTCTGTGCTC | GGGTACTCCTCTCTGATCTTGG |
| IGA3 | CCTCGACGGCTTCTCCTT | GCGCATTCCTTGTACAGCTC |
| IGA4 | GACCTCAACAAGCTTGAGCC | TGTCCTTGTGGCTGAAGAAG |
| IGA5 | AGGAGTCCAGGGACATCATC | GCACTTTGAACGGCACCT |
| IGA6 | CGGCAGCTGCAAGTACATC | GACTGCTCGTCGTACTCGTC |
| IGA7 | GAGGTCGGCATCAAGAAGTT | GTACGACTGCATCGTCGG |
| IGA8 | AAGAAGAAGGAGAGGGCGAC | AATCAAGCGAGAGTGCCAGT |
| IGA9 | GCCCCCGTATGGAACAAC | CTCCCTGTCGAAGTTGGC |
| IGA10 | GGGAGCTTGGAAAATCATCTG | TGAAGGTAAGCTAGTCCTTTTGC |
| IGA11 | GCACCACAGGAACCTCGTC | GATTTTCCATCTTTGCTGCC |
| IGA12 | TCCTCCACCACCAGCCAT | GCGTCAGCATCTCGTTCAG |
| IGA13 | GGAGCTGGAGGCGGTTAAG | ACAATGTCGCGCTCGGTAG |
| IGA14 | TCATATGGCTACATCGCCC | GTGAGCACCTCCAGCACC |
| IGA15 | AGAGCTATTGGTGCTGACAGA | CAACAGTGGCTTACCACCAT |
| IGA16 | GCATGGACATACTCTATGAGTGC | CCCATAGGGAAAGCAGGAAG |
| IGA17 | GCTAAGGTGAACCTCCCCA | TGTTGTCGCAGACGATCTTG |
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| IGA19 | AACACGCTCAACGTCAACCT | CTCTGTCCACCACGCTGAA |
| IGA20 | GACATGATGAAGACGGCAAA | GAAGCAGCACACGTAGATGG |
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| IGA22 | AGTTATCCAGGCTGGGCTGT | AGCAATGCTCGCCTATCCT |
| IGA23 | GACATGATGAAGACGGCAAA | GAAGCAGCACACGTAGATGG |
| IGA24 | CCATGCCGTACTGGTCATTC | GTAGTCGATGTCCGTCCACA |
| IGA25 | ATGTGCTTCCACCCTGACC | GCCAATCTGCCTGTGCTT |
| IGA26 | GGCCAAAATAATGGAAGATCG | AGTGATGAAAGAGCAAGGCA |
| IGA27 | ACCGCCCTAGTCCCAAAC | ACAGAGTCAGCAAAGATGCG |
| IGA28 | ACCCCTACGTGGTCTCCG | CCACGTCGAGCTTCTCCC |
| IGA29 | CGTCATCACCAAGGCTTACA | TCCTGATCGGTCACATTGAA |
| IGA30 | AACTTCATGGAGATCGGGC | CCCTCCACGTAGCTGAACC |
| IGA31 | CGTCGAGGACATGGACATC | GACTCCGGCAGCTCACAG |
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| IGA33 | AGCTCGTCTTCCCCGTCTAC | GAAGGTCGGGGAGGTGTT |
| IGA34 | AGGCAGTTGCTCTCCGAGTA | CCTTCGATGTAACAGTCCCTT |
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| IGA36 | CAAGAAGAAGCGCTACCACC | CTTCAGCCGCTGCTTGTC |
| IGA37 | CAAGAACTGGTTCTCGAGCTATG | CCTCAAAGCAGAATCACCATC |
| IGA38 | TTCGTCCTCGTCAGGATCTC | TTGCCATTAGGGTCCTTGA |
4、电子PCR：
对设计的引物在籼、粳稻基因组序列中进行了e-PCR检验，要求只产生单一扩增产物。由此即获得候选的禾本科IACGM标记。
5、分类与命名：
根据电子PCR的结果，我们将禾本科IACGM标记用IGAn表示，其中n为编号，如IGA16。每一个标记的名称都是唯一的。
6、引物正确性和可行性的实验验证：
合成候选标记的引物，以粳稻品种Nipponbare和籼稻品种93-11为材料，剪取幼嫩叶片提取基因组DNA作为模板，按常规PCR程序进行扩增。退火温度设定在50-62℃之间，循环35次。根据预测的扩增产物大小的不同，在琼脂糖凝胶或非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离，用紫外线照射或银染显带。扩增结果与预期吻合的，说明引物设计是正确的和可行的。
7、引物通用性和多态性水平的检验：
选择若干个不同属或种的禾本科植物材料，用第6步获得的引物，按第6步相同的方法进行实验，观察各个品种的扩增情况和差异条带数目。在所有品种中皆有扩增产物，说明通用性好；差异条带数多，说明多态性水平高。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的一个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
Claims (1)
1.禾本科通用型标记IACGM，以水稻作为物种A，其特征是：所述IACGM的标记引物选自下列引物对，其中的核苷酸序列为5′→3′，
IGA1 正向：CCGTCAACAAAGTTTGCTCC
反向：ATTGGACATGCTCTCCATCC
IGA2 正向：AGCTCATCGACTCTGTGCTC
反向：GGGTACTCCTCTCTGATCTTGG
IGA3 正向：CCTCGACGGCTTCTCCTT
反向：GCGCATTCCTTGTACAGCTC
IGA4 正向：GACCTCAACAAGCTTGAGCC
反向：TGTCCTTGTGGCTGAAGAAG
IGA5 正向：AGGAGTCCAGGGACATCATC
反向：GCACTTTGAACGGCACCT
IGA6 正向：CGGCAGCTGCAAGTACATC
反向：GACTGCTCGTCGTACTCGTC
IGA7 正向：GAGGTCGGCATCAAGAAGTT
反向：GTACGACTGCATCGTCGG
IGA8 正向：AAGAAGAAGGAGAGGGCGAC
反向：AATCAAGCGAGAGTGCCAGT
IGA9 正向：GCCCCCGTATGGAACAAC
反向：CTCCCTGTCGAAGTTGGC
IGA10 正向：GGGAGCTTGGAAAATCATCTG
反向：TGAAGGTAAGCTAGTCCTTTTGC
IGA11 正向：GCACCACAGGAACCTCGTC
反向：GATTTTCCATCTTTGCTGCC
IGA12 正向：TCCTCCACCACCAGCCAT
反向：GCGTCAGCATCTCGTTCAG
IGA13 正向：GGAGCTGGAGGCGGTTAAG
反向：ACAATGTCGCGCTCGGTAG
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IGA15 正向：AGAGCTATTGGTGCTGACAGA
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| 小麦EST-SSRs的通用性研究. 李宏伟等.植物遗传资源学报，第4卷第3期. 2003 * |
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