CN110157830A - 一种香蕉a、b基因组的分型方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种香蕉A、B基因组的分型方法，该方法包括以下步骤：利用PCR‑RFLP标记区分尖叶蕉、长梗蕉基因组，利用IRAP标记确定长梗蕉基因组的个数，结合流式细胞仪测定的倍性结果，确定香蕉种质资源基因型。使用本发明提供的方法不受田间栽培条件和环境影响，取材方便，在香蕉生长任何时期都能进行倍型和基因型准确而快速鉴定。

Description

一种香蕉A、B基因组的分型方法
技术领域
本发明属于香蕉种质资源基因组类型鉴定技术领域，具体涉及一种香蕉A、B基因组的分型方法。
背景技术
香蕉(Musa spp.L.)主要生长在热带和南亚热带地区，是多年生的大型草本果树，也是重要的世界性水果之一。香蕉种植已发展为华南诸省农业结构调整中实现农民增收的主要高效益经济作物。然而，香蕉栽培面临着生物(真菌、细菌和病毒侵染，线虫和昆虫危害)和非生物(干旱、冷害、台风、盐害、重金属污染和营养缺乏等)逆境胁迫，多种检疫性的病虫危害制约香蕉的发展和生存，如枯萎病、叶斑病、线条病毒病、根结线虫和香蕉象甲等。其中，香蕉枯萎病被认为是当前最具毁灭性的病害。培育抗病虫、适应性广、高产优质的香蕉品种，是从根本上解决此类问题的唯一途径。然而，现代栽培香蕉由两个野生二倍体尖叶蕉(MusaacuminataColla，A基因组)和长梗蕉(MusabalbisianaColla，B基因组)经过种内和种间杂交及多倍化进化而来。由于香蕉栽培种大多是三倍体，没有或很少种子，雌雄育性很低，利用传统育种方法培育香蕉品种比较困难，且育种周期很长。因此，缩短育种周期，通过分子标记辅助育种和生物技术应用在今后的香蕉遗传育种中具有重要的作用。然而现今香蕉育种中还存在诸多障碍和技术困难。由于栽培香蕉种质资源中存在A、B基因组构成的多种基因型，以及存在多种倍型(如二倍体、三倍体和四倍体)。
现今世界范围内栽培香蕉主要有AA、AAA、ABB、AAB和BB、BBB等基因型。目前，国内对于香蕉的基因组倍型鉴定主要还是通过外部形态特征来判断，从假茎色泽、叶柄槽、花序梗到苞片的形状、色泽以及果实发育过程中胚珠数量等十五个尖苞叶蕉(代表A基因型)和长梗蕉(代表B基因型)的对比性状来获得相应的分数，来判断属于哪种基因型(Stover andSimmonds，1987；黄秉智等编著，香蕉种质资源描述规范和数据标准，2006)。这种判断标准使用方便，在世界范围内广为接受和应用。然而，由于香蕉品种的外部性状容易受栽培条件和环境因子的影响，倍型和基因型的判断会有较大偏差，不利于种质资源鉴定和遗传育种进程，缺乏较精确的理论依据。而且，外部形态特征需要通过观察整个生长周期的生物学特性来描述和判断，往往需要2-3年才能得到初步的判断，需时较长。而一些杂交育种苗期筛选和田间和组培突变体的倍型和基因型鉴定时，需要快速而准确的判断，通过此方法较难在短时期内达到理想的效果，阻碍了育种进程和品种审定时所需要的精确的生物学特性描述。另外，除A和B染色体基因组外，少数栽培香蕉品种中还存在S(M.schizocarpa)和T(M.textiles)基因组，也很难通过外部形态特征来判断品种的基因型构成。因此，需要建立一种不受田间栽培条件和环境影响，取材方便，在香蕉生长任何时期都能进行倍型和基因型准确而快速鉴定。
发明内容
本发明的目的在于提供一种香蕉A、B基因组的分型方法，可以准确的对香蕉种质资源基因型进行鉴定。
本发明的技术方案为如下：
一种香蕉A、B基因组的分型方法，包括以下步骤：
(1)DNA提取：提取待检测样品的总DNA；
(2)尖叶蕉、长梗蕉基因组区分：以待检测样品的总DNA作为模板，利用引物ITS L-F:5'-TCGTAACAAGGTTTC CGTAGGTG-3'/ITS 4-R:5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'进行PCR-RFLP扩增；将扩增产物纯化回收，经AfaI酶酶切后进行琼脂糖凝胶电泳，若酶切后只扩增出一条530bp的特异带，则待检测样品只含尖叶蕉基因组(A基因组)，若酶切后扩增出大小分别为350bp和180bp的特异带，则待检测样品只含长梗蕉基因组(B基因组)，若酶切后扩增出大小分别为530bp、350bp、180bp的特异带，则待检测样品既含尖叶蕉基因组(A基因组)又含长梗蕉基因组(B基因组)；
(3)长梗蕉基因组个数确定：以待检测样品的总DNA作为模板，使用单引物GyLTRev5'-CTTAGGCAAAACCAGCTAAGTCCG-3'进行IRAP扩增，将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，若扩增出大小为350bp的特异带，则待检测样品含有长梗蕉基因组(B基因组)，而只含有尖叶蕉基因组(A基因组)的待检测样品不会显示350bp条带；进一步的，将含有长梗蕉基因组(B基因组)的待检测样品进行特异性扩增，具体为：以含有长梗蕉基因组的待检测样品的总DNA作为模板，使用引物BFor:5'-AGGGTTCGAAGTATAGGTTC GG-3'/BRev:5'-AATGTTTAAGTAGAGGGCAAGACG-3'进行扩增，将扩增产物纯化回收，经AluI酶酶切后进行琼脂糖凝胶电泳，若酶切后只扩增出一条200bp的特异带，则待检测样品只含有1个长梗蕉基因组，若酶切后扩增出两条200bp的特异带，则待检测样品含有2个长梗蕉基因组，以此确定长梗蕉基因组的个数；
(4)香蕉种质资源基因型确定：采用流式细胞仪对香蕉的倍性进行鉴定，结合步骤S2尖叶蕉、长梗蕉基因组的区分结果，以及步骤S3长梗蕉基因组的个数的确定结果，确定香蕉种质资源基因型。
所述步骤S2的PCR-RFLP扩增反应体系包括：DNA模板1.0μL，PCR Mix 27μL，引物ITS L/ITS 4各1.0μL，加ddH2O至终体积为50μL；反应热循环为：首先94℃预变性4min；然后进入循环，每个循环94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环；最后72℃延伸7min，4℃冷却取出。
所述步骤S3的IRAP扩增反应体系包括：DNA模板0.5μL，PCR Mix 10.5μL，引物GyLTRev 1.0μL，加ddH2O至终体积为25μL；反应热循环为：首先94℃预变性5min；然后进入循环，每个循环94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸2min+3s，共30个循环；最后72℃延伸10min，4℃冷却取出。
所述步骤S3的将含有长梗蕉基因组的待检测样品进行特异性扩增的反应体系包括：DNA模板0.4μL，PCR Mix 10.6μL，引物对BFor/BRev各0.5μL，加ddH2O至终体积为20μL；反应热循环为：首先94℃预变性5min；然后进入循环，每个循环94℃变性30s，51℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；最后72℃延伸7min，4℃冷却取出。
所述步骤S4的采用流式细胞仪对香蕉的倍性进行鉴定，是以Calcutta4二倍体作为内参进行测定的。
本发明的有益效果是：本发明利用PCR-RFLP标记区分尖叶蕉、长梗蕉基因组(A、B基因组)，利用IRAP标记确定B基因组的个数，并结合流式细胞仪测定的倍性结果，可以准确的对香蕉种质资源基因型进行鉴定。
附图说明
图1为PCR-RFLP扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图。其中，1：TMB*1378(ITC1296)、2：CRBP37(ITC1342)、3：Pv42-81(ITC1312)、4：NBA14(ITCO267)、5：FJ、6：DJ、7：Akpakpak(ITC0217)、8：Curare(ITC1165)、9：Ibwi(ITC1465)、10：Willians(ITC0570)、11：BGY1、12：BGY3、13：PC12-05(ITC1260)、14：CIRAD930(ITC1511)、15：TMP*1297-3(ITC1278)、16：Lidi(ITC0395)、17：Calcutta4(ITC0249)，M：Marker。
图2为PCR-RFLP扩增产物进行AfaI酶酶切后的琼脂糖凝胶电泳图。其中，1：TMB*1378(ITC1296)、2：CRBP37(ITC1342)、3：Pv42-81(ITC1312)、4：NBA14(ITCO267)、5：FJ、6：DJ、7：Akpakpak(ITC0217)、8：Curare(ITC1165)、9：Ibwi(ITC1465)、10：Willians(ITC0570)、11：BGY1、12：BGY3、13：PC12-05(ITC1260)、14：CIRAD930(ITC1511)、15：TMP*1297-3(ITC1278)、16：Lidi(ITC0395)、17：Calcutta4(ITC0249)，M：Marker。
图3为使用IRAP标记引物(Gy LTRev)进行扩增得到的扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图。其中，1：TMB*1378(ITC1296)、2：CRBP37(ITC1342)、3：Pv42-81(ITC1312)、4：NBA14(ITCO267)、5：FJ、6：DJ、7：Akpakpak(ITC0217)、8：Curare(ITC1165)、9：Ibwi(ITC1465)、10：Willians(ITC0570)、11：BGY1、12：BGY3、13：PC12-05(ITC1260)、14：CIRAD930(ITC1511)、15：TMP*1297-3(ITC1278)、16：Lidi(ITC0395)、17：Calcutta4(ITC0249)，M：Marker。
图4为使用引物对BFor/BRev进行扩增得到的扩增产物经AluI酶酶切后的琼脂糖凝胶电泳图。其中，1：TMB*1378(ITC1296)、2：CRBP37(ITC1342)、3：Pv42-81(ITC1312)、4：NBA14(ITCO267)、5：FJ、6：DJ、7：Akpakpak(ITC0217)、8：Curare(ITC1165)、9：Ibwi(ITC1465)、10：Willians(ITC0570)、11：BGY1、12：BGY3、13：PC12-05(ITC1260)、14：CIRAD930(ITC1511)、15：TMP*1297-3(ITC1278)、16：Lidi(ITC0395)、17：Calcutta4(ITC0249)，M：Marker。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
以下实施例均以广东省农科院果树研究所种质资源圃的17个栽培和野生种(TMB*1378(ITC1296)、CRBP37(ITC1342)、Pv42-81(ITC1312)、NBA14(ITCO267)、FJ、DJ、Akpakpak(ITC0217)、Curare(ITC1165)、Ibwi(ITC1465)、Willians(ITC0570)、BGY1、BGY3、PC12-05(ITC1260)、CIRAD930(ITC1511)、TMP*1297-3(ITC1278)、Lidi(ITC0395)、Calcutta4(ITC0249))为试验材料，进行香蕉种质资源基因组类型的分子标记鉴定的。
实施例1
一种香蕉A、B基因组的分型方法，包括以下步骤：
(1)提取待检测样品的总DNA：
取0.5g植物体材料在液氮下迅速研磨成粉末状，转入到2mL离心管中，加入65℃预热的提取缓冲液(100mM Tris-HCl pH8.0、20mM EDTA pH8.0、1.4M NaCl、3％CTAB、2％PVP、4％-β巯基乙醇)下颠倒充分混匀后65℃水浴1h左右，期间每隔10-15min摇匀一次。取出离心管加入氯仿：异戊醇(24:1v/v)充分混匀后静置2min，13500g离心10min后取上清至一新离心管加入2/3体积-20℃预冷的异丙醇上下颠倒混匀后13500g离心10min，收集沉淀加入1M NaCl溶解DNA，加入等体积的苯酚：氯仿(1:1)混匀后13000g离心8min，取上清加入氯仿：异戊醇(24:1v/v)室温下13000g离心8min，取上清加入2倍体积预冷的无水乙醇室温下13000g离心10min倒出上清，取沉淀用75％的乙醇洗涤2次，室温挥发乙醇，用TE或无菌水溶解DNA，再用一定量的RNA酶消化1-2h。采用(eppendorf Biophotometer plus)260/280nm波长紫外分光光度计测定基因组DNA的质量浓度和纯度，1％的琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA片段大小和完整性的结果，-20℃保存备用。
(2)以待检测样品的总DNA作为模板，利用引物ITS L-F:5'-TCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTG-3'/ITS 4-R:5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'进行PCR-RFLP扩增；PCR扩增反应体系包括：DNA模板1.0μL，PCR Mix 27μL，引物ITS L/ITS 4各1.0μL，加ddH2O至终体积为50μL；反应热循环为：首先94℃预变性4min；然后进入循环，每个循环94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环；最后72℃延伸7min，4℃冷却取出。取2μL PCR产物经1％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果见图1。将其它PCR产物进行纯化回收，经AfaI酶酶切后进行3％的琼脂糖凝胶电泳检测，若酶切后只扩增出一条530bp的特异带，则待检测样品只含尖叶蕉基因组(A基因组)，若酶切后扩增出大小分别为350bp和180bp的特异带，则待检测样品只含长梗蕉基因组(B基因组)，若酶切后扩增出大小分别为530bp、350bp、180bp的特异带，则待检测样品既含尖叶蕉基因组(A基因组)又含长梗蕉基因组(B基因组)，结果见图2。由图1可知，根据ITS序列设计的引物在17个供试材料中都能产生一条大小约为700bp的条带。由图2可知，品种NBA14(ITCO267)、Ibwi(ITC1465)、Willians(ITC0570)、CIRAD930(ITC1511)、TMP*1297-3(ITC1278)、Lidi(ITC0395)、Calcutta4(ITC0249)只扩增出一条530bp的特异带，其只含尖叶蕉基因组(A基因组)；品种BGY3扩增出大小分别为350bp和180bp的特异带，其只含长梗蕉基因组(B基因组)；品种TMB*1378(ITC1296)、CRBP37(ITC1342)、Pv42-81(ITC1312)、FJ、DJ、Akpakpak(ITC0217)、Curare(ITC1165)、PC12-05(ITC1260)扩增出大小分别为530bp、350bp和180bp的特异带，其既含有尖叶蕉基因组(A基因组)，也含有长梗蕉基因组(B基因组)。品种BGY1均未扩增出530bp、350bp和180bp的特异带，其既不含有尖叶蕉基因组(A基因组)，也不含有长梗蕉基因组(B基因组)。
(3)以待检测样品的总DNA作为模板，使用单引物Gy LTRev 5'-CTTAGGCAAAACCAGCTAAGTCCG-3'进行IRAP扩增，反应体系包括：DNA模板0.5μL，PCR Mix10.5μL，引物Gy LTRev 1.0μL，加ddH2O至终体积为25μL；反应热循环为：首先94℃预变性5min；然后进入循环，每个循环94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸2min+3s，共30个循环；最后72℃延伸10min，4℃冷却取出，将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，若扩增出大小为350bp的特异带，则待检测样品含有长梗蕉基因组(B基因组)，而只含有尖叶蕉基因组(A基因组)的待检测样品不会显示350bp条带，结果见图3。有图3可知，品种TMB*1378(ITC1296)、CRBP37(ITC1342)、Pv42-81(ITC1312)、FJ、DJ、Akpakpak(ITC0217)、Curare(ITC1165)、PC12-05(ITC1260)、BGY3均扩增出大小为350bp的特异带，其含有长梗蕉基因组(B基因组)，品种NBA14(ITCO267)、Ibwi(ITC1465)、Willians(ITC0570)、CIRAD930(ITC1511)、TMP*1297-3(ITC1278)、Lidi(ITC0395)、Calcutta4(ITC0249)均没有扩增出大小为350bp的特异带，其只含尖叶蕉基因组(A基因组)。
将含有长梗蕉基因组(B基因组)的待检测样品进行特异性扩增，具体为：以含有长梗蕉基因组的待检测样品的总DNA作为模板，使用引物BFor:5'-AGGGTTCGAAGTATAGGTTCGG-3'/BRev:5'-AATGTTTAAGTAGAGGGCAAGACG-3'进行扩增，反应体系包括：DNA模板0.4μL，PCRMix 10.6μL，引物对BFor/BRev各0.5μL，加ddH2O至终体积为20μL；反应热循环为：首先94℃预变性5min；然后进入循环，每个循环94℃变性30s，51℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；最后72℃延伸7min，4℃冷却取出，将扩增产物纯化回收，经AluI酶酶切后进行琼脂糖凝胶电泳，若酶切后只扩增出一条200bp的特异带，则待检测样品只含有1个长梗蕉基因组，若酶切后扩增出两条200bp的特异带，则待检测样品含有2个长梗蕉基因组，以此确定长梗蕉基因组的个数，结果见图4。
(4)采用流式细胞仪对17个香蕉品种的倍性进行鉴定，具体步骤为：取幼嫩的香蕉叶片去除主脉，然后放入加有冷的1mL OTTOI buffer(0.1MA柠檬酸，0.5％Tween 20)溶液的培养皿中，用刀片将其快速切碎，然后通过50μm孔径的尼龙网膜进行过滤，再加入OTTOIIbuffer(0.4M Na2HPO4)对细胞核进行固定，最后加入10μL的RNA酶，20μL的碘化丙锭(PI)染料进行着色，避光处理30分钟后用移液枪从中吸取300μL加入到50μm孔径的尼龙网膜上进行过滤，在滤液中加入700μL PBS溶液(每升含有KCl 2g、KH2PO4 2g、NaCl 80g、Na2HPO4.12H2O 34.84g或Na2HPO4.7H2O 21.68g，溶剂为水)，然后进行上样检测，每检测完一个样品需用超纯水进行一次进样管清洗。以Calcutta4(AA)二倍体作为内参，调整阀值使Calcutta4出峰频段在50，对其它样本依次进行检测，FCM检测结果显示三倍体的样品出峰频段在75，四倍体的出峰频段在100，结果见表1。
表1 17个香蕉品种的基因组类型鉴定结果
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种香蕉A、B基因组的分型方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)DNA提取：提取待检测样品的总DNA；
(2)尖叶蕉、长梗蕉基因组区分：以待检测样品的总DNA作为模板，利用引物ITS L-F:5'-TCGTAACAAGGTTTCCGTA GGTG-3'/ITS 4-R:5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'进行PCR-RFLP扩增；将扩增产物纯化回收，经AfaI酶酶切后进行琼脂糖凝胶电泳，若酶切后只扩增出一条530bp的特异带，则待检测样品只含尖叶蕉基因组，若酶切后扩增出大小分别为350bp和180bp的特异带，则待检测样品只含长梗蕉基因组，若酶切后扩增出大小分别为530bp、350bp、180bp的特异带，则待检测样品既含尖叶蕉基因组又含长梗蕉基因组；
(3)长梗蕉基因组个数确定：以待检测样品的总DNA作为模板，使用单引物Gy LTRev5'-CTTAGGCAAAACCAGCTAAGTCCG-3'进行IRAP扩增，将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，若扩增出大小为350bp的特异带，则待检测样品含有长梗蕉基因组，而只含有尖叶蕉基因组的待检测样品不会显示350bp条带；将含有长梗蕉基因组的待检测样品进行特异性扩增，以含有长梗蕉基因组的待检测样品的总DNA作为模板，使用引物BFor:5'-AGGGT TCGAAGTATAGGTTCGG-3'/BRev:5'-AATGTTTAAGTAGAGGGCAAGACG-3'进行扩增，将扩增产物纯化回收，经AluI酶酶切后进行琼脂糖凝胶电泳，若酶切后只扩增出一条200bp的特异带，则待检测样品只含有1个长梗蕉基因组，若酶切后扩增出两条200bp的特异带，则待检测样品含有2个长梗蕉基因组，以此确定长梗蕉基因组的个数；
(4)香蕉种质资源基因型确定：采用流式细胞仪对香蕉的倍性进行鉴定，结合步骤S2尖叶蕉、长梗蕉基因组的区分结果，以及步骤S3长梗蕉基因组的个数确定结果，确定香蕉种质资源基因型。
2.根据权利要求1所述的香蕉A、B基因组的分型方法，其特征在于，所述步骤S2的PCR-RFLP扩增反应体系包括：DNA模板1.0μL，PCR Mix 27μL，引物ITS L/ITS 4各1.0μL，加ddH2O至终体积为50μL；反应热循环为：首先94℃预变性4min；然后进入循环，每个循环94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环；最后72℃延伸7min，4℃冷却取出。
3.根据权利要求1所述的香蕉A、B基因组的分型方法，其特征在于，所述步骤S3的IRAP扩增反应体系包括：DNA模板0.5μL，PCR Mix 10.5μL，引物Gy LTRev 1.0μL，加ddH2O至终体积为25μL；反应热循环为：首先94℃预变性5min；然后进入循环，每个循环94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸2min+3s，共30个循环；最后72℃延伸10min，4℃冷却取出。
4.根据权利要求1所述的香蕉A、B基因组的分型方法，其特征在于，所述步骤S3的将含有长梗蕉基因组的待检测样品进行特异性扩增的反应体系包括：DNA模板0.4μL，PCR Mix10.6μL，引物对BFor/BRev各0.5μL，加ddH2O至终体积为20μL；反应热循环为：首先94℃预变性5min；然后进入循环，每个循环94℃变性30s，51℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；最后72℃延伸7min，4℃冷却取出。
5.根据权利要求1所述的香蕉A、B基因组的分型方法，其特征在于，所述步骤S4的采用流式细胞仪对香蕉的倍性进行鉴定，是以Calcutta4二倍体作为内参进行测定的。
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