CN113684302A - 低镉水稻的特异性pcr检测引物、检测方法和试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于特异性检测低镉水稻的PCR检测引物，以及利用该检测引物进行PCR检测的方法，所述方法是以所述检测引物对待测样品DNA进行PCR扩增，若扩增获得目的片段，则待测样品为低镉水稻；若扩增未获得目的片段，则待测样品不是低镉水稻。由实验结果可以看出，本申请提供的检测引物，扩增靶标序列呈现单一的扩增带，并且与其他基因编辑序列等反应不出现扩增带，表明方法具有高度的特异性与敏感度，在模板添加量为40ng时能够准确检测低镉水稻编辑成分。

Description

低镉水稻的特异性PCR检测引物、检测方法和试剂盒

技术领域

本发明涉及水稻品系检测技术领域，尤其涉及一种用于特异性检测低镉水稻的PCR定性检测引物、利用该检测引物对低镉水稻进行PCR定性检测的方法以及试剂盒。

背景技术

近年来基因编辑技术作为新兴技术得到了迅速发展。基因编辑低镉吸收水稻(简称低镉水稻)，其原理是通过CRISPR-Cas9基因编辑技术，使OsNramp5基因发生突变，影响镉转运蛋白合成，从而有效抑制了水稻镉吸收，极大改善了水稻籽粒中镉污染的问题。从基因编辑检测方法建立方面来看，低镉水稻同时具有碱基小片段删除、单碱基替换等多种编辑形式，从应用角度看，低镉水稻有效解决了我国主粮水稻种植方面的难题，极具应用前景。

已经有研究能够根据水稻镉吸收的特点，比对多个根部Cd转运相关功能蛋白。比较了这些基因突变后Cd吸收差异，发现突变OsNramp5导致Cd含量下降最大，因此获得了以华占(HZ)为背景的OsNramp5突变体，在T1代中有效地分离了无转基因的纯合突变体。并且这些突变体在受高Cd污染的稻田中生长时，其谷物中的Cd含量极低，并且没有表现出发育迟缓或产量降低。

申请人在培育基因编辑低镉水稻新品种过程中，分别以水稻保持系品种华占(HZ)为亲本，编辑并筛选出了稳定且纯合的低镉水稻P7(亲本HZ)。然而，现有技术中还未能够提供一种用于特异性检测低镉水稻的PCR检测引物及方法。

发明内容

为了解决上述问题，本发明旨在针对低镉水稻提供一种能够对其进行有效的PCR扩增的检测引物，并基于该检测引物建立低镉水稻P7品系的特异性PCR定性检测方法。

一方面，本申请提供了一种用于检测低镉水稻的特异性PCR检测引物，所述检测引物选自以下引物对中的任意一种或两种：

引物对1：

P7-PS1-2F：5’-GCAGGTTCTTCCTGTACGAGAGCG-3’

P7-PS1-2R：5’-GACCGGGAAGAATCGTGTAG-3’

所述引物对1的扩增靶序列如下所示：

gcaggttcttcctgtacgagagcgggttcgcgctgttcgtggcgctgctgataaacatcgccgtcgtctccgtctccggcaccgcctgctcctccgccaacctctcccaagaggacgccgacaagtgcgccaacctcagcctcgacacctcctccttccttctcaaggtcattcattcattattacttcctactctttaatattaaaagtttttaaatggattagacgtatcctaatactacagatataggaatttattcagattcgtagtactagcttgtatgtgttcaatttaatcaatatttaattaaccacaataacaccgaattagtctacacgattcttcccggtc；

引物对2：

P7-PS2-1F：5’-GATAAACATCGCCGTCGTCT-3’

P7-PS2-1R：5’-TGACCTTGAGAAGGAAGGAGGAGGTGT-3’

所述引物对2的扩增序列为：

gataaacatcgccgtcgtctccgtctccggcaccgcctgctcctccgccaacctctcccaagaggacgccgacaagtgcgccaacctcagcctcgacacctcctccttccttctcaaggtca。

另一方面，本申请还提供了一种低镉水稻的特异性PCR检测方法，所述方法是以上述检测引物，对待测样品DNA进行PCR扩增，若扩增获得目的片段，则待测样品为低镉水稻；若扩增未获得目的片段，则待测样品不是低镉水稻。

进一步地，所述方法还包括利用CTAB沉淀法对水稻的待测样品进行DNA提取的步骤。

进一步地，所述水稻的待测样品包括水稻叶片。

进一步地，所述PCR扩增时，退火温度为60℃，和/或，所述PCR扩增的反应体系中，引物添加量为0.6μL，以使其在PCR反应体系中的终浓度为0.3μmol/L。

优选的，利用P7-PS1-2F/R进行扩增时，退火温度为60℃，且引物添加量为0.6μL。

进一步地，所述PCR扩增的方法包括：95℃预变性120s；94℃变性20s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共35次循环；72℃延伸2min。

进一步地，所述PCR扩增的反应体系为：2×MasterMix为10μL，终浓度为1×；10μM上游引物0.6μL，终浓度0.3μmol/L；10μM下游引物0.6μL，终浓度0.3μmol/L；DNA模板2μL，终浓度40ng；去离子水补足至反应体系的总体积为20μL。

另一方面，本申请还提供了一种低镉水稻的特异性PCR检测试剂盒，包括：2×MasterMix和检测上下游引物对，所述检测上下游引物对采用上述PCR检测引物。

可选的，本申请中所述低镉水稻，是低镉水稻P7品系。

通过本发明能够带来如下有益效果：

1、本申请提供的PCR检测引物，能够应用于低镉水稻的PCR定性检测中，特别是可以用于检测低镉水稻的靶标核苷酸序列。

2、本申请基于该检测引物建立了低镉水稻的特异性PCR定性检测方法，并优化了待测样品的选择(即采用水稻叶片)、基因组提取的方法(即采用CTAB法提取)以及PCR扩增的反应条件(即退火温度60℃、引物添加量0.6μL)；在确认优化条件后，本申请还进行了对不同品系及不同位点的特异性扩增验证，从实验结果可以看出，本申请提供的检测引物，扩增靶标序列呈现单一的扩增带，并且与其他基因编辑序列等反应不出现扩增带，表明方法具有高度的特异性与敏感度，在模板添加量为40ng时能够准确检测低镉水稻编辑成分。与此同时，定性PCR具有经济、耗时短等特点，非常利于大规模检测实验，提高了检测鉴定的效率，极大地降低了成本，是基因编辑检测中重要的技术选择。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本申请的进一步理解，构成本申请的一部分，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：

图1是低镉水稻分子特征鉴定的方法过程示意图，其中，a是低镉水稻编辑位点os07g0257200示意图，b是能够扩增编辑位点及上下游序列的引物对示意图，c是PCR扩增反应体系示意图，d是PCR扩增程序示意图；

图2是特征鉴定引物扩增结果图；

图3是低镉水稻测序峰图；

图4是低镉水稻测序结果与数据库信息对比图；

图5是PCR引物优选结果图，其中，A为P7品系PS1位点，B为P7品系PS2位点，相邻泳道表示同一引物对突变型及野生型的扩增；

图6是多对引物筛选后，最优引物对在扩增序列的位置之意图，其中，A为P7品系PS1位点引物，B为P7品系PS2位点引物；

图7是PCR检测方法不同退火温度结果示意图，其中，1、2泳道为57℃退火温度时的扩增条带，3、4泳道为60℃退火温度时的扩增条带，5、6为63℃退火温度时的扩增条带；

图8是定性PCR检测特异性验证结果图，其中，A是P7-PS1位点，B是P7-PS2位点。

具体实施方式

为了更清楚的阐释本申请的整体构思，下面以实施例的方式进行详细说明。在下文的描述中，给出了大量具体的细节以便提供对本申请更为彻底的理解。然而，对于本领域技术人员来说显而易见的是，本申请可以无需一个或多个这些细节而得以实施。在其他的例子中，为了避免与本申请发生混淆，对于本领域公知的一些技术特征未进行描述。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1基因编辑低镉水稻分子特征的鉴定

本实施例提供了基因编辑低镉水稻的基因组DNA的提取方法，并对该方法提取获得的基因组DNA进行分子特征的鉴定。

实验材料：

基因编辑低镉水稻由湖南省农业科学研究院提供，包括T7代保持系P7及亲本华占(HZ)；不育系1S及亲本638S，转基因水稻TT51由华中农业大学提供。

基因组提取试剂：

(1)CTAB提取液：成分最终浓度CTAB 20g/L，NaCl 1.4mol/L，Tris-碱0.1mol/L，Na2EDTA 0.02mol/L，混合摇匀后用盐酸将pH调至8.0备用；

(2)CTAB沉淀液：成分最终浓度CTAB 5g/L，NaCl 40mmol/L；

(3)蛋白酶K溶液20mg/mL(擎科生物)，RNase A溶液(擎科生物)；

(4)NaCl溶液：1.2mol/L NaCl溶液；

(5)基因组提取所用到其他试剂包括乙醇、氯仿、异丙醇等均购自中检国研公司，纯度为分析纯；

(6)TIANGEN植物基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司)；

(7)SDS提取缓冲液：十二烷基硫酸钠(Sodium dodecyl sulfate，SDS)质量分数4％，Tris-HCI 100mmol/L，PVP质量分数4％，EDTA(pH＝8.0)50mmol/L，β-巯基乙醇质量分数3％，NaCl 0.5mol/L。

PCR扩增试剂：PCR mixture(Biomed，北京)，GoldView II型核酸染色剂(Solarbio，北京)

琼脂糖凝胶电泳试剂：琼脂糖(Biowest，西班牙)，50×TBE浓缩液(Amresco，美国)，使用时将上述浓缩液稀释成1×缓冲液，作为电泳及制胶共用的缓冲液。

实验仪器：

电子天平(上海越平科学仪器有限公司)，DK-98-1电热恒温水浴锅(天津泰斯特仪器有限公司)，AMC-V1小型高速离心机(美国ACTgene公司)，涡旋振荡仪(江苏其林贝尔仪器制造公司)，微量移液器(德国Eppendorf公司)，CHEMI-SMART3000WL/LC荧光化学发光凝胶成像分析系统(美国生物基因系统公司)，Veriti FAST梯度PCR仪(美国ABI)，NanoDrop微型核酸定量仪(美国Thermal公司)。

一、低镉水稻基因组DNA提取材料部位的选择：

在进行提取方法的筛选前，本申请对低镉水稻的材料部位进行了筛选比较。水稻种子富含营养物质，也会存在一些与基因组DNA相似溶解性的物质，这些物质在提取基因组的过程中并不能完全与DNA分离，致使基因组DNA纯度的下降，同时其中一些成分(例如多糖)会产生抑制PCR核酸扩增的结果，十分影响后续实验进程。通过预实验发现，以种子研磨粉末为材料获取的基因组DNA，纯度和浓度相对偏低，即使多次采用氯仿和异戊醇进行处理，效果也并不理想，很难直接通过琼脂糖电泳观察到基因组条带，并且在使用这些基因组扩增目的片段时，比较容易形成非目的基因条带。因此，实验选择将低镉水稻种子在营养液中水培至株长20cm左右，将单株去根，提取叶片组织的基因组DNA进行实验。具体实验过程不再赘述。

二、低镉水稻基因组DNA提取方法的选择：

1、采用CTAB沉淀法提取：

十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)是一种阳离子去污剂，具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。因此高离子强度溶液环境中的CTAB会与蛋白质和多聚糖形成复合物，但不会沉淀核酸。再通过有机溶剂抽提去除杂质，加入乙醇沉淀，使核酸分离出来，具体操作步骤如下：

(1)将单株培育的基因编辑或野生型水稻叶片加液氮磨碎至粉末状；

(2)将50mg水稻叶片研磨粉放入2mL离心管中，并加入预热过的1mL CTAB提取物、4μL蛋白酶K溶液和1μL RNaseA，置于65℃水浴锅中1h，水浴过程中多次取出震荡并使用枪头搅拌抽吸，保证粉末充分接触裂解液；

(3)将水浴后的体系置于离心机中，13000g转速离心10min，用移液枪将上清液吸出并转移至新的2ml离心管中；

(4)在上述离心管中加入500μL乙醇，并将混合液利用置于涡旋振荡仪上充分混匀至少30s，将混合好的混合液体放入离心机以转速13000g离心10min；

(5)用移液器轻轻吸取上方清液，避免下方沉淀被吸入，并转移至新的2ml离心管中，加入1ml的CTAB沉淀液，室温放置1h；

(6)将上一步混合体系配平并放入离心机中，13000g高速离心5min，弃上清液；

(7)向上一步的沉淀中加入NaCl溶液和氯仿各350μL，涡旋30s充分混匀后，13000g离心10min；

(8)吸取上步得到的分离上清液并添加到含250μL的异丙醇的1.5mL离心管中，轻摇混匀，室温下静置20min；

(9)将上一步体系置于离心机中13000g离心10min，将离心管倒置，吸水纸将多余上清液吸干后加入500μL 75％乙醇，涡旋30s，充分洗涤管中的沉淀，13000g离心10min；

(10)倒置离心管，并在下部放置吸水纸将多余的水分吸干，待沉淀完全晾干后，加入50μL超纯水，涡旋溶解DNA沉淀，通过NanoDrop测定基因组浓度并进行基因组DNA纯度的鉴定；

(11)将基因组稀释至20ng/μL并置于-20℃下待用，实验用基因组浓度为20ng/μL。

2、采用基因组提取试剂盒提取：参考基因组提取试剂盒说明书操作。

3、采用SDS法提取：

十二烷基苯磺酸钠(SDS)是一种阴离子去污剂，具有高温裂解细胞，使蛋白变性等特点，同时SDS与蛋白质和多糖结合成复合物，而与核酸则无结合；实验利用对温度和盐浓度的调节，使SDS-蛋白质复合物的溶解度变小并使杂质沉淀更加完全。将上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA，具体操作步骤如下：

(1)称取30mg低镉水稻研磨粉，加入600μL 2％浓度的SDS缓冲液，65℃水浴中充分反应30min，期间多次震荡离心管，使之充分混匀；

(3)取出后加入0.7倍5mol L-1KAc，冰浴30min；

(4)将上述体系12000rpm离心10min；

(5)用移液枪吸取上清液加至600μL氯仿：异戊醇(24:1)中，轻晃摇匀，置入离心机12000rpm转速离心10min；

(6)在分层的液体中，小心地吸取上清液至新离心管并加入0.7倍体积的乙醇，摇晃混匀后室温静置10min；

(7)将上述体系12000rpm转速离心10min，将离心管倒置至水分蒸发，将沉淀晾干后，加入50μL超纯水充分溶解，通过NanoDrop测定基因组浓度并进行基因组DNA纯度的鉴定；

(8)将基因组稀释至20ng/μL并置于-20℃待用，实验用基因组浓度为20ng/μL。

OD260/OD280和OD260/OD230是核酸纯度的指示值，纯度好的DNA在PH7-8.5的条件下，OD260/OD280约为1.8，如果低于这个值表示存在蛋白质或酚类物质。将上述CTAB法、SDS法和试剂盒提取基因组方法三种方法提取后的基因组使用Nano Drop 3000进行基因组纯度的质控及定量，所得结果如表1所示：

表1

由表1的结果可知，上述三种提取方法提取的基因组的OD260/OD280均在1.8-2.0之间，CTAB法及试剂盒提取方法的OD260/OD230值大于2.0，SDS法OD260/OD230值小于2.0。因此CTAB法及试剂盒提取得到的基因组质量符合检测需求，其中CTAB方法提取基因组的量大于100ng/μL，可用作后续的检测体系的建立。

并且，CTAB沉淀法提取单株水稻DNA质量足够支持完整方法验证的实验，尽可能减小了材料对实验验证的影响。除此以外，由于低镉水稻样品的来源为T4代大田直接收获种子，不可避免掺杂了野生型或不同突变品系的种子，这在实验中的测序结果上也有体现，即混样测序的样品编辑位点多次出现双峰。综合以上原因，实验采取了CTAB沉淀法提取植物叶片的方式获取DNA进行后续实验。

三、基因编辑低镉水稻分子特征鉴定：

(1)根据低镉水稻已知编辑位点os07g0257200，如图1-a所示，在GenBank数据库获取水稻OsNramp5基因ID及序列信息；

(2)根据获取的编辑位点序列信息，设计一段能够扩增编辑位点及上下游序列的引物对，如图1-b所示，采用PCR方法扩增410bp的靶标序列，扩增体系及程序如1-c和1-d所示；

(3)2％琼脂糖凝胶电泳用于验证以上PCR反应是否成功扩增了靶片段：称取2g琼脂糖粉，放入锥形瓶中，加入100mL 1×TAE运行缓冲液，混合并在微波炉中加热1min，直到悬浮液变透明，静置使其达到一定可触温度温度后，加入10μL核酸染料，混合并倒入凝胶制备板，冷却凝胶，开始电泳，15分钟后，在成像分析系统中曝光并观察结果；

(4)将PCR产物分送上海生工生物、擎科新业及诺赛基因三家公司分别进行sanger测序，进行测序结果的协同比对；

(5)比对水稻样品测序结果与数据库基因组序列，确定水稻编辑位点分子特征。

上述方法根据GenBank数据库获取的序列信息设计了扩增引物，并成功扩增出410bp左右的序列，如图2所示。

将PCR产物提交三家公司进行测序，三家公司测序所得突变型品系、野生型品系的结果通过blast对比均一致，擎科公司提供的测序结果峰图如图3所示，精确检测到突变位点的缺失。但是低镉水稻样品测序结果与GenBank提供序列存在差异如图4所示，且验证表明3株低镉水稻编辑样品的单株测序结果均一致，因此后续实验以低镉水稻实测序列为准。

实施例2基于定性PCR技术的低镉水稻检测方法

本实施例对实施例1提供的提取方法提取获得的低镉水稻基因组，基于定性PCR技术，建立基因编辑低镉水稻定性检测体系。

对低镉水稻P7品系进行定性PCR检测体系的建立及优化，具体步骤如下：

(1)配置PCR反应体系，反应需要确定PCR扩增体系中的最优引物添加量以确保最佳的扩增效率以及最少的非特异性扩增，引物添加量设计为上下游引物各1μL或0.6μL，扩增体系见表2：

表2

组分	体积(20μL)	终浓度
			2×MasterMix	10	1×
上游引物(10μM)	1(0.6)	0.5μmol/L(0.3μmol/L)
			下游引物(10μM)	1(0.6)	0.5μmol/L(0.3μmol/L)
模板	2	40ng
			去离子水	补足至20μL	-

(2)将上述配置好的体系分配至PCR管中，盖紧管盖并置于PCR仪中，PCR扩增程序优化预变性程序设置为95℃，120s。由于退火温度对反应特异性扩增影响很大，因此使用55℃，57℃和60℃的三个退火温度来优化程序。扩增完成后，使用2％琼脂糖凝胶，在紫外线灯下观察电泳20分钟的PCR结果。

设置PCR反应程序：95℃预变性2min；94℃变性30s，优化退火温度(55℃、57℃、60℃)退火30s，72℃延伸30s，共35次循环；72℃延伸2min。

低镉水稻有相隔195bp的两个编辑位点PS1和PS2，通过测序获得的序列可知，编辑位点相邻区域内CG含量较高，且存在连续CG碱基对，引物扩增易形成二级结构与引物二聚体，受限制较大。本实施例设计如表3所示的检测引物，以筛选获得扩增效率高且稳定的引物对，其中，表3中所列引物由北京擎科新业公司合成提供。

表3

PCR引物筛选的结果图如图5所示，其中，A为P7品系PS1位点，B为P7品系PS2位点。相邻泳道表示同一引物对突变型及野生型的扩增，比如图5A中，1/2泳道代表P7-PS1-1F/R的扩增结果；3/4泳道代表P7-PS1-2F/R的扩增结果；5/6泳道代表P7-PS1-3F/R的扩增结果；7/8泳道代表P7-PS1-4F/R的扩增结果。图5B中，1/2泳道代表P7-PS2-1F/R的扩增结果；3/4泳道代表P7-PS2-2F/R的扩增结果；5/6泳道代表P7-PS2-3F/R的扩增结果；7/8泳道代表P7-PS2-4F/R的扩增结果。

由图5的结果可知，A中3/4泳道的引物组合及5/6引物组合对阳性样品实现了稳定扩增(A-3，A-5)，而阴性样品没有产生扩增条带(A-4，A-6)，综合考虑320bp扩增片段易与区别引物二聚体，选择图5A中的3/4引物组合为P7-PS1的特异性引物组合，即，P7-PS1-2F/R。类似地，仅B-1和B-2引物组合准确区分了野生型与突变型的样品，因此，选择图5B中的1/2引物组合为P7-PS2的特异性引物组合，即，P7-PS2-1F/R，并应用于后续实验。

其中，引物P7-PS1-2F/R和P7-PS2-1F/R在靶标序列中的位置如图6所示，图6中A为P7品系PS1位点引物，B为P7品系PS2位点引物。

实施例3低镉水稻PCR定性检测方法条件的优化

对定性PCR结果影响最大的因素是退火时的反应温度，如果温度偏低则不会产生非特异扩增，偏高就会降低扩增效率，因此采取57℃、60℃、63℃三种退火梯度温度进行程序的优化；引物的添加量过多易生成引物二聚体，引物诱导扩增的效率就会变慢，因此在优化过程中，以P7-PS1-2F/R为例，引物添加量分别采用1μL和0.6μL两个添加量。所得结果如图7所示。

由图7可知，利用P7-PS1-2F/R进行扩增时，在退火温度为57℃时，野生型扩增结果显示弱阳性，退火温度为60℃、63℃时可以实现野生型与突变型的明显区分，但在63℃时，突变型的扩增也受到影响，因此选定60℃为退火温度。

在引物添加量为1μL时，扩增出现引物二聚体条带，且扩增不稳定，因此选用0.6μL引物添加量，即终浓度为0.3μmol/L。

实施例4定性PCR检测方法特异性验证

对于基因编辑检测来说，是否能稳定区分突变型和野生型是鉴定方法是否可行的关键因素。因此，本实施例进行了检测体系特异性的验证，将水稻突变型P7和野生型HZ作为研究对象验证扩增特异性。所得结果如图8所示。

由图8可知，针对P7-PS1位点(图8-A)、P7-PS2位点(图8-B)的引物P7-PS1-2F/R和P7-PS2-1F/R，可以实现对P7品系的扩增，对HZ、TT51和1S则无扩增，因此具有显著的特异性。

综合上述实验结果可以看出，本申请提供的检测引物，扩增靶标序列呈现单一的扩增带，并且与其他基因编辑序列等反应不出现扩增带，表明方法具有高度的特异性与敏感度，在模板添加量为40ng时能够准确检测低镉水稻编辑成分。

以上所述仅为本申请的实施例而已，并不用于限制本申请。对于本领域技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的权利要求范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国检验检疫科学研究院

<120> 低镉水稻的特异性PCR检测引物、检测方法和试剂盒

<130> 111

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 352

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ps1

<400> 1

gcaggttctt cctgtacgag agcgggttcg cgctgttcgt ggcgctgctg ataaacatcg 60

ccgtcgtctc cgtctccggc accgcctgct cctccgccaa cctctcccaa gaggacgccg 120

acaagtgcgc caacctcagc ctcgacacct cctccttcct tctcaaggtc attcattcat 180

tattacttcc tactctttaa tattaaaagt ttttaaatgg attagacgta tcctaatact 240

acagatatag gaatttattc agattcgtag tactagcttg tatgtgttca atttaatcaa 300

tatttaatta accacaataa caccgaatta gtctacacga ttcttcccgg tc 352

<210> 2

<211> 122

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ps2

<400> 2

gataaacatc gccgtcgtct ccgtctccgg caccgcctgc tcctccgcca acctctccca 60

agaggacgcc gacaagtgcg ccaacctcag cctcgacacc tcctccttcc ttctcaaggt 120

ca 122

Claims (8)

1.用于检测低镉水稻的特异性PCR检测引物，其特征在于，所述检测引物选自以下引物对中的任意一种或两种：

引物对1：

P7-PS1-2F：5’-GCAGGTTCTTCCTGTACGAGAGCG-3’

P7-PS1-2R：5’-GACCGGGAAGAATCGTGTAG-3’

所述引物对1的扩增的靶序列如SEQ ID No.1所示；

引物对2：

P7-PS2-1F：5’-GATAAACATCGCCGTCGTCT-3’

P7-PS2-1R：5’-TGACCTTGAGAAGGAAGGAGGAGGTGT-3’

所述引物对2的扩增的靶序列如SEQ ID No.2所示。

2.一种低镉水稻的特异性PCR检测方法，其特征在于，所述方法是以如权利要求1所述的检测引物，对待测样品DNA进行PCR扩增，若扩增获得目的片段，则待测样品为低镉水稻；若扩增未获得目的片段，则待测样品不是低镉水稻。

3.根据权利要求2所述的PCR检测方法，其特征在于，所述方法还包括利用CTAB沉淀法对水稻的待测样品进行DNA提取的步骤。

4.根据权利要求3所述的PCR检测方法，其特征在于，所述水稻的待测样品包括水稻叶片。

5.根据权利要求2所述的PCR检测方法，其特征在于，所述PCR扩增时，退火温度为60℃，和/或，所述PCR扩增的反应体系中，引物添加量为0.6μL，以使其在PCR反应体系中的终浓度为0.3μmol/L。

6.根据权利要求2所述的PCR检测方法，其特征在于，所述PCR扩增的方法包括：95℃预变性120s；94℃变性20s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共35次循环；72℃延伸2min。

7.根据权利要求2所述的PCR检测方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应体系为：2×MasterMix为10μL，终浓度为1×；10μM上游引物0.6μL，终浓度0.3μmol/L；10μM下游引物0.6μL，终浓度0.3μmol/L；DNA模板2μL，终浓度40ng；去离子水补足至反应体系的总体积为20μL。

8.一种低镉水稻的特异性PCR检测试剂盒，其特征在于，包括：2×MasterMix和检测上下游引物对，所述检测上下游引物对采用如权利要求1所述的PCR检测引物。

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