CN114250315B - 一种与水稻镉吸收相关基因OsNramp5连锁的SNP分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种与水稻镉吸收相关基因OsNramp5连锁的SNP分子标记及其应用。所述SNP分子标记为OS900239_K01或OS900248_K01，所述OS900239_K01的多态性位点位于蜀恢498的7号染色体第8989006位的碱基处，多态性为T/C；所述OS900248_K01的多态性位点位于蜀恢498的7号染色体第9226651位的碱基处，多态性为T/G。利用所述分子标记，并结合KASP检测技术，可快速、精准、高通量的检测水稻材料中OsNramp5基因是否缺失，解决传统分子标记辅助育种中的技术问题，加快珞红3A或珞红4A在镉低积累新品种选育进程中的应用。

Description

一种与水稻镉吸收相关基因OsNramp5连锁的SNP分子标记及其应用

本案是以申请号为2021112182049，申请日为2021年10月20日，名称为《一种与水稻镉吸收相关基因OsNramp5连锁的SNP分子标记及其应用》的专利申请为母案的分案申请。

技术领域

本发明涉及水稻育种领域，具体涉及一种与水稻镉吸收相关基因OsNramp5连锁的SNP分子标记及其应用。

背景技术

镉(cadmium，Cd)是一种广泛存在于环境中的重金属元素，由于金属冶炼、工业活动及含镉肥料的使用，部分地区土壤中的镉含量严重超标。水稻作为重要的主粮作物，受镉污染尤为严重。稻米中镉含量超标会严重影响人体健康，长期摄入高镉稻米会诱发肾脏慢性中毒、骨质疏松、脊柱变形等多种疾病。

目前，已克隆参与水稻镉吸收、转运和积累的基因31个，主要分为6类：水稻Fe²⁺转运蛋白、重金属转运ATP酶、低亲和性阳离子转运蛋白、金属耐受蛋白、ABC转运蛋白和自然抗性相关巨噬细胞蛋白。OsNramp5属于自然抗性相关巨噬细胞蛋白，负责Mn²⁺、Fe²⁺和Cd²⁺的吸收和转运，并影响离子在根部和叶片中的分布，对维持水稻体内的离子平衡具有重要作用。

基因敲除OsNramp5可使水稻丧失吸收Mn和Cd的能力，导致水稻的地上部分与地下部分中Mn和Cd含量显著低于野生型。相关学者通过对1143份水稻资源进行重测序分析，发现水稻品种珞红3A和珞红4A的7号染色体存在一段约408Kb的片段缺失，该缺失片段中包含整个OsNramp5基因。进一步研究表明，由于珞红3A和珞红4A中的大片段缺失，两个品种的Cd吸收能力显著降低。有研究也证实珞红4A在该段缺失处插入了一段2980bp的序列。共分离试验表明，2980bp的插入片段与水稻中Cd的积累存在紧密关联。珞红3A与珞红4A作为天然的镉低积累品种，在水稻镉低积累新品种的选育和解决水稻镉污染问题中具有重要的应用价值。

目前，可用于镉低积累新品种选育的分子标记较少，这些标记的使用需要繁琐的凝胶电泳检测，自动化程度低通量小，大大的限制了镉低积累新品种的选育进程。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种与水稻镉吸收相关基因OsNramp5连锁的SNP分子标记及其应用。

本发明还提出上述SNP分子标记的引物组。

本发明还提出上述水稻OsNramp5基因的检测方法。

本发明还提出上述SNP分子标记或引物组的应用。

根据本发明的第一方面实施方式的SNP分子标记，所述SNP分子标记为OS900239_K01或OS900248_K01，所述OS900239_K01的多态性位点位于蜀恢498的7号染色体第8989006位的碱基处，多态性为T/C；所述OS900248_K01的多态性位点位于蜀恢498的7号染色体第9226651位的碱基处，多态性为T/G。

根据本发明第二方面实施方式的上述SNP分子标记的引物组，每个SNP分子标记的引物组独立地包括特异性引物和通用引物，其中，所述特异性引物序列包括Primer X和Primer Y。

根据本发明的一些实施方式，在所述SNP分子标记为OS900239_K01的情况下，所述特异性引物包括如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；在所述SNP分子标记为OS900248_K01的情况下，所述特异性引物包括如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列。

根据本发明的一些实施方式，在所述SNP分子标记为OS900239_K01的情况下，所述通用引物核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；在所述SNP分子标记为OS900248_K01的情况下，所述通用引物核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

根据本发明的一些实施方式，优选地，所述特异性引物分别连接FAM和HEX荧光接头序列。

根据本发明的一些实施方式，所述引物组在水稻基因型检测中的应用。

根据本发明的第三方面实施方式的利用上述SNP位点检测水稻镉吸收相关基因OsNramp5的方法，所述方法包括以下步骤：

S1、从水稻中提取基因组DNA；

S2、对步骤S1中提取的基因组DNA中的所述SNP分子标记进行多态性检测，根据检测结果判断所述水稻材料中是否含有OsNramp5基因。

根据本发明的一些实施方式，优选地，所述步骤S1中，基因组DNA提取采用简化CTAB法(十六烷基三甲基溴化铵法)。

根据本发明的一些实施方式，优选地，所述步骤S2中，用KASP(竞争性等位基因特异性PCR)技术对SNP位点进行检测。

根据本发明的第四方面实施方式的上述SNP分子标记或引物组的应用，所述应用为上述SNP分子标记或引物组在水稻育种中的应用。

根据本发明的一些实施方式，所述应用为上述SNP分子标记或引物组在检测水稻镉吸收相关基因OsNramp5中的应用。

根据本发明的一些实施方式，所述应用为利用上述分子标记的检测方法对水稻中OsNramp5基因进行检测，选择不携带OsNramp5基因的水稻材料进行后续育种。

根据本发明的一些实施方式，所述应用为提供一种检测OsNramp5基因的SNP分子标记试剂盒，所述试剂盒包括上述引物组。

根据本发明的一些实施方式，所述试剂盒包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1～3所示的引物或核苷酸序列如SEQ ID NO.4～6所示的引物。

根据本发明的一些实施方式，所述试剂盒用于水稻育种。

根据本发明的一些实施方式，所述应用为提供了一种基因芯片，所述基因芯片包括上述引物组。

根据本发明的一些实施方式，所述试剂盒包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1～3所示的引物或核苷酸序列如SEQ ID NO.4～6所示的引物。

根据本发明的一些实施方式，所述基因芯片应用于水稻的基因分型。

根据本发明实施方式的一种与水稻镉吸收相关基因OsNramp5连锁的SNP分子标记，至少具有如下有益效果：利用所述分子标记，并结合KASP检测技术，可快速、精准、高通量的检测水稻材料中OsNramp5基因是否缺失，解决传统分子标记辅助育种中的技术问题，加快珞红3A或珞红4A在镉低积累新品种选育进程中的应用。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明，其中：

图1为本发明实施例1中的分子标记开发流程图；

图2为本发明实施例1中的分子标记OS900239_K01在F1群体中分型结果图；

图3为本发明实施例1中的分子标记OS900239_K01在34份水稻材料中分型结果图；

图4为本发明实施例2中的标记OS900248_K01在F1群体中分型结果图；

图5为本发明实施例2中的标记OS900248_K01在34份水稻材料中分型结果图。

具体实施方式

以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。

实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1与水稻镉吸收相关基因OsNramp5连锁的SNP分子标记OS900239_K01

该分子标记的设计过程，如图1所示，通过已克隆目标基因OsNramp5在染色体上的物理位置，确定OsNramp5基因片段缺失连锁区域，提取SNP位点和侧翼序列，设计和合成标记的引物序列，并对标记进行筛选测试，具体如下：

1引物设计

根据已发表文献中提供的OsNramp5基因缺失片段连锁区域，比对重测序BAM文件，发现在参考基因组蜀恢498的7号染色体第8989006位的碱基处存在T/C多态性。当检测位点碱基为C时，说明该水稻材料中缺失OsNramp5基因片段，当检测位点碱基为T时，说明该水稻材料中OsNramp5基因片段未缺失。提取蜀恢498中该位点前后50bp侧翼序列，利用BatchPrimer3引物设计网站对其进行引物设计。标记信息如表1所示，从表中可以看出，标记由3条引物组成，其中2条特异性引物的5’端分别连接FAM和HEX荧光接头序列。引物委托Invitrogen公司合成。

表1标记信息

2样品检测

DNA提取：从水稻叶片中提取基因组DNA，采用简化CTAB法，包括以下步骤：

(1)取约30mg叶片至1.3mL 96孔板，并置于冻干机中，抽真空12h或以上；

(2)抽真空结束后，使用分珠器向每孔中加入两粒钢珠，并盖上硅胶膜，置于高通量研磨仪中研磨1min，研磨后置于深孔板离心机中瞬离，将磨碎组织离心到孔底；

(3)用移液工作站TECAN向每孔加CTAB提取液700μL，震荡混匀后置于65℃水浴锅中温浴约1-1.5h，每20min将1.3mL 96孔板取出于漩涡振荡器上振荡数次；

(4)温浴结束后取出1.3mL 96孔板，将其置于深孔板冷冻离心机中，4000rpm离心10min；

(5)用移液工作站TECAN将每孔380μL上清转移到新的1.3mL 96孔板中，并加入等体积氯仿，颠倒混匀后静置2min，置于深孔板冷冻离心机中，4000rpm，离心10min；

(6)离心后，用移液工作站TECAN抽取上清液250μL至预先加好250μL异丙醇的0.8mL 96孔板中，漩涡振荡混匀，将其置于-20℃冰箱沉淀1h或以上；

(7)取出0.8mL 96孔板置于深孔板冷冻离心机中，4000rpm，离心15min；

(8)弃掉上清，用移液工作站TECAN向每孔中加入250μL 70％乙醇，漩涡振荡器上振荡数次，5000rpm，离心15min；

(9)弃掉上清，并置于65℃烘箱中30min将其烘干；

(10)每孔加200μL灭菌超纯水，置于室温过夜溶解备用。

KASP反应测试：KASP反应测试在Douglas Arraytape基因分型平台上进行，反应体系如表2所示，从表中可以看出，PCR扩增反应使用的扩增体系以0.8μL计为：样品DNA 20ng-50ng烘干后加入100μM两条特异性引物各0.0013μL，100μM通用引物0.0033μL，2×KASPMaster Mix 0.3945μL，超纯水0.3996μL。PCR扩增在水浴热循环仪中完成，Touchdown PCR反应条件为：94℃预变性15min；第一步扩增反应，94℃变性20s，65℃～57℃退火并延伸60s，10个循环，每个循环退火及延伸的温度降低0.8℃；第二步扩增反应，94℃变性20s，57℃退火并延伸60s，30个循环。反应完成后利用Arraytape扫描系统对KASP反应产物进行荧光数据读取，荧光扫描的结果会自动转化成图形。

表2 KASP检测的反应体系

	终浓度	体积
			100μM Primer C	0.42μM	0.0033μL
100μM Primer X	0.17μM	0.0013μL
			100μM Primer Y	0.17μm	0.0013μL
2×KASP Master Mix	1×	0.3945μL
			超纯水		0.3996μL
DNA(干燥)		20ng-50ng
			总体积		0.8μL

3标记分型数据

根据上述检测方法，用标记OS900239_K01对珞红4A、R900及珞红4A/R900组合F1进行KASP反应验证。

分型结果如图2所示，从图中可以看出，珞红4A在目标位点检测结果为碱基C，R900在目标位点检测结果为碱基T，珞红4A/R900组合F1在目标位点检测结果为碱基T:C。表明本申请方案提供的标记OS900239_K01可以准确对水稻材料进行分型。

4特异性和实用性检测

为检测本发明中标记的特异性及实用性，根据上述检测方法，检测34份水稻材料，包含珞红4A、珞红4A/R900组合F1、核心水稻育种材料、常规稻材料等。

标记分型结果如图3所示，从图中可以看出，珞红4A在目标位点检测结果为碱基C，材料中缺失OsNramp5基因片段；珞红4A/R900组合F1在目标位点检测结果为碱基T:C，材料为杂合型；剩余32份水稻材料在目标位点检测结果为碱基T，材料中OsNramp5基因片段未缺失。标记OS900239_K01在检测OsNramp5基因片段缺失与否时具有高特异性，可准确并高效的鉴别水稻材料中是否含有OsNramp5基因片段。

实施例2与水稻镉吸收相关基因OsNramp5连锁的SNP分子标记OS900248_K01

该分子标记的设计过程，如图1所示，通过已克隆目标基因OsNramp5在染色体上的物理位置，确定OsNramp5基因片段缺失连锁区域，提取SNP位点和侧翼序列，设计和合成标记的引物序列，并对标记进行筛选测试，具体如下：

1引物设计

根据已发表文献中提供的OsNramp5基因缺失片段连锁区域，比对重测序BAM文件，发现在参考基因组蜀恢498的7号染色体第9226651位的碱基处存在T/G多态性。当检测位点碱基为G时，说明该水稻材料中缺失OsNramp5基因片段，当检测位点碱基为T时，说明该水稻材料中OsNramp5基因片段未缺失。提取蜀恢498中该位点前后50bp侧翼序列，并比对珞红4A中相应的重测序序列，利用BatchPrimer3引物设计网站对其进行引物设计。标记信息如表3所示，从表中可以看出，标记由3条引物组成，其中2条特异性引物的5’端分别连接FAM和HEX荧光接头序列。引物委托Invitrogen公司合成。

表3标记信息

2样品检测

DNA提取：从水稻叶片中提取基因组DNA，采用简化CTAB法，具体方法同实施例1一致。

KASP反应测试：KASP反应测试在Douglas Arraytape基因分型平台上进行，具体方法同实施例1一致。

3标记分型数据

根据上述检测方法，用标记OS900248_K01对珞红4A、R900及珞红4A/R900组合F1进行KASP反应验证。

分型结果如图4所示，从图中可以看出，珞红4A在目标位点检测结果为碱基G，R900在目标位点检测结果为碱基T，珞红4A/R900组合F1在目标位点检测结果为碱基T:G，表明本申请方案提供的标记OS900248_K01可以准确对水稻材料进行分型。

4特异性和实用性检测

为检测本发明中标记的特异性及实用性，根据上述检测方法，检测34份水稻材料，包含珞红4A、珞红4A/R900组合F1、核心水稻育种材料、常规稻材料等。

标记分型结果如图5所示，从图中可以看出，珞红4A在目标位点检测结果为碱基G，材料中缺失OsNramp5基因片段；珞红4A/R900组合F1在目标位点检测结果为碱基T:G，材料为杂合型；剩余32份水稻材料在目标位点检测结果为碱基T，材料中OsNramp5基因片段未缺失。结果表明本发明方案提供的SNP分子标记OS900248_K01在检测OsNramp5基因片段缺失与否时具有高特异性，可准确并高效的鉴别水稻材料中是否含有OsNramp5基因片段。

上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

序列表

<110> 华智生物技术有限公司

<120> 一种与水稻镉吸收相关基因OsNramp5连锁的SNP分子标记及其应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gtagctggct atgtattgtc gttaa 25

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gtagctggct atgtattgtc gttag 25

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gcactataag atgcttggat ggaat 25

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgagcaaaa ctgaggccaa actt 24

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atgagcaaaa ctgaggctaa actg 24

<210> 6

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ccatttccct caaaatcacc caaaac 26

Claims (2)

1.一种利用SNP位点检测水稻镉吸收相关基因OsNramp5的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

S1、从水稻中提取基因组DNA；

S2、对步骤S1中提取的基因组DNA中的SNP分子标记进行多态性检测，根据检测结果判断所述水稻材料中是否含有OsNramp5基因；当检测位点碱基为G时，说明该水稻材料中缺失OsNramp5基因片段，当检测位点碱基为T时，说明该水稻材料中OsNramp5基因片段未缺失；所述SNP分子标记为OS900248_K01，所述OS900248_K01的多态性位点位于蜀恢498的7号染色体第9226651位的碱基处，多态性为T/G。

2.一种镉低积累水稻育种方法，其特征在于，包括如下步骤：采用如权利要求1所述检测方法对水稻中OsNramp5基因进行检测，选择不携带OsNramp5基因的水稻材料进行育种。

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