CN106636350A - 一种与白叶枯病抗性基因Xa7紧密连锁的SNP分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及分子标记，具体公开了一种与白叶枯病抗性基因紧密连锁的SNP分子标记K_060570，其序列如SEQ ID No.2所示，第61bp位点处的碱基为G或A。本发明进一步提供了利用KASP反应可高通量的对水稻材料进行Xa7抗性基因检测的引物组合，及所述分子标记和所述引物组合在检测白叶枯病抗性基因Xa7和在水稻抗病性辅助育种中的应用。本发明应用KASP技术对所寻找到的SNP分子标记进行基因分型，可以快速、精确的检测Xa7基因，大幅提高基因转育的效率。且检测过程不需要酶切、电泳及测序等，操作简便，利于高通量快速检测，彻底杜绝了PCR产物的气溶胶污染和EB对环境的污染、甲醛对人体的危害。

Description

一种与白叶枯病抗性基因Xa7紧密连锁的SNP分子标记及其 应用

技术领域

本发明涉及分子标记，具体地说，涉及一种与白叶枯病抗性基因紧密连锁的SNP分子标记。

背景技术

水稻白叶枯病菌具有生理小种专化性，品种的抗性基本上都是受核基因组中的主效抗性基因控制，自世纪年代日本科学家利用黄玉和兰泰耶玛斯与金南风杂交后代分析其对日本菌群抗性反应，鉴定出并命名个显性抗性基因后，有关水稻白叶枯病抗性基因的鉴定与发掘研究就没停止过。1975年以后，国际水稻研究所(用菲律宾生理小种先后鉴定出个抗病基因(章琦，2007)。其他国家科研人员也相继鉴定出一批抗性基因，但由于各国科学家使用的菌系不同，其鉴定结果缺乏国与国之间的可比性，在一定程度上影响到这一研究领域的进展。因此从1982年开始，IRRI与日本科学家开始合作进行白叶枯病基因鉴定工作，创建了水稻白叶枯病抗性基因鉴别系统，到1987年确认了Xa1、Xa2、Xa3、Xa4、Xa5、Xa6、Xa7、Xa8、Xa10、Xa11、Xa12等11个抗性基因的存在(Ogawa et al.,1987)。随后有更多的基因被鉴定、定位与克隆。截至到目前，已确认和报道的白叶枯抗性基因有38个，命名排序至Xa38(虞玲锦等，2012；国家水稻数据中心)。其中有26个为显性基因，其余为隐性基因；已经被定位的有26个，其中有8个基因已被克隆，分别为Xa1、Xa5、Xa27、Xa13、Xa3/Xa26、Xa4、Xa21和Xa23(王春连，2006；裴庆利等，2011；国家水稻数据中心)。

目前，育种家们通过分子标记辅助选择(molecμLar assisted selectoin，MAS)，已利用Xa4、Xa21和Xa23选育出了许多抗病恢复系品种，如IR26、IR28、IR30、IR32、IR36、IR50、IR54等。国内大面积种植的杂交稻中大多含有Xa4基因，不过长期大面积地使用单一抗源已经导致了新致病菌株的进化，杂交稻抗病的持久性得不到保证。

Xa7基因源于孟加拉稻种DV85和DV86，是一个具有广谱抗性的显性抗白叶枯病基因，国际水稻所将DV85与IR24回交，构建了含Xa7的近等基因系IRBB7；我国一个强优恢复系水稻品种“镇恢084”以91-2156为母本，与由DV85选育的抗病品系R19杂交而成，该品种也带有Xa7基因。因此，利用MAS等现代育种技术，将Xa7基因导入主栽的杂交稻恢复系中，有望大大提高我国水稻的抗病性和生产安全。

然而，由于Xa7基因还没有被克隆，无法设计基因功能标记。以致在传统水稻育种中抗白叶枯病基因Xa7未得到较好的利用。

因此，当前仍需进一步探索新的白叶枯病抗性基因紧密连锁的分子标记，从而为加快水稻抗病遗传基础和抗病育种研究提供技术支撑。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供与白叶枯病抗性基因Xa7紧密连锁的SNP(single nucleotide polymorphism)分子标记K_060569和K_060570及其应用。

为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：

第一方面，本发明提供了一种与白叶枯病抗性基因Xa7紧密连锁的SNP分子标记K_060569，其序列如SEQ ID No.1所示，第61bp位点处的碱基为C或G。

本发明还提供了一种与白叶枯病抗性基因Xa7紧密连锁的SNP分子标记K_060570，其序列如SEQ ID No.2所示，第61bp位点处的碱基为G或A。

本发明经试验研究发现，上述分子标记与白叶枯病抗性基因Xa7紧密连锁，含Xa7基因的水稻品种在K_060569测试位点检测结果均为碱基C，且在K_060570测试位点检测结果均为碱基G；18个不含Xa7水稻品种无论是其他抗白叶枯基因供体还是普感材料均未在K_060569和K_060570测试位点分别检测出碱基C和G。

第二方面，本发明分别针对前述分子标记提供了利用KASP反应可高通量的对水稻材料进行Xa7抗性基因检测的引物组合，如表1所示：

表1标记序列表

进一步地，含有上述引物组合的试剂或试剂盒也在本发明的保护范围之内。

进一步地，本发明提供了所述引物组合在检测白叶枯病抗性基因Xa7中的应用。

具体包括如下步骤：

S1、提取水稻样品基因组DNA；

S2、以水稻基因组DNA为模板，利用某一分子标记对应的引物组合进行KASP反应检测；其中，两条特异性引物分别连接不同的荧光序列；

S3、若只检测到引物Primer Y所连荧光序列对应的荧光信号，则判断水稻样品为携带白叶枯病抗性基因Xa7的纯和型；若只检测到引物Primer X所连荧光序列对应的荧光信号，则判断水稻样品为不携带白叶枯病抗性基因Xa7的纯和型；若同时检测到两种荧光，则判断水稻样品为携带白叶枯病抗性基因Xa7的杂合型。

所述荧光序列可为本领域常规使用的荧光序列，优选两个荧光颜色差异大的荧光序列。在本发明的一个具体实施方式中，选择使用FAM和VIC荧光序列分别连接在两条特异性引物的5’端。

上述应用的实质为该分子标记的检测方法。其中，PCR反应程序与体系可采用本领域常规技术，本发明对此不另作限定。

第三方面，本发明还提供了前述分子标记在水稻抗病性辅助育种中的应用，利用前述方法分子标记的检测方法对该分子标记进行检测，选择携带白叶枯病抗性基因Xa7的水稻样品进行后续育种。

本发明的有益效果在于：

本发明提供了两个与白叶枯病抗性基因Xa7紧密连锁的SNP分子标记，可用于Xa7基因的鉴定及辅助选择育种，对促进Xa7基因在商业化育种中的应用具有重要意义

白叶枯病抗性基因Xa7具有高抗、广谱、持久的特点，但由于还没有被克隆，无法设计基因功能标记。本发明应用KASP技术对所寻找到的SNP分子标记进行基因分型，可以快速、精确的检测Xa7基因，大幅提高基因转育的效率。且检测过程不需要酶切、电泳及测序等，操作简便，利于高通量快速检测，彻底杜绝了PCR产物的气溶胶污染和EB对环境的污染、甲醛对人体的危害。

附图说明

图1为利用分子标记K_060569检测自然群体分型图。

图2为利用分子标记K_060570检测自然群体分型图。

图3为分子标记K_060569与分子标记K_060570的染色体定位。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

本实施例用于说明本发明提供的分子标记在检测白叶枯病抗性基因Xa7中的应用，具体步骤如下：

1、针对本发明所述的分子标记设计利用KASP反应可高通量的对水稻材料进行Xa7抗性基因检测的引物组合，如表1所示。

2、采用简化CTAB法，从水稻叶片中提取基因组DNA。

①取样放入2.0mL Tube中，预先加入两粒钢珠和750μL CTAB溶液，震荡匀浆样品1.5min；

②65℃震荡加热0.5-1h；

③冷却至室温，在通风橱中加入750mL氯仿︰异戊醇(24︰1)溶液混匀；

④12000rmp离心10min，取上清约500mL转移至新的1.5mL离心管中；

⑤加入等体积异丙醇溶液轻摇混匀，于-20℃沉淀1小时以上，12000rmp离心10min，去上清；

⑥加入1000mL70％乙醇，轻弹沉淀，1000rmp离心3min，去上清；

⑦加300μL H₂O过夜溶解备用。

3、KASP反应测试：

KASP反应测试在LGC SNPline基因分型平台上进行。在微孔反应板中加入20ngDNA样品，烘干后加入KASP反应混合液，反应体系见表2。

表2KASP检测的反应体系

	终浓度	体积(μL)
			100UM Primer C	0.42UM	0.0125
100UM Primer X	0.17UM	0.0050
			100UM Primer Y	0.17UM	0.0050
2x KASP Master Mix	1x	1.4792
			超纯水		1.4983
总体积		3

PCR扩增在水浴热循环仪中完成，Touchdown PCR反应条件为：94℃预变性15分钟；第一步扩增反应，94℃变性 20秒，65℃～57℃退火并延伸60秒，10个循环，每个循环退火及延伸的温度降低0.8℃；第二步扩增反应，94℃变性 20秒，57℃退火并延伸60秒，26个循环。反应完成后利用扫描仪Pherastar对KASP反应产物进行荧光数据读取，荧光扫描的结果会自动转化成图形。

本发明中使用的LGC SNPline基因分型平台与其配套试剂耗材均购于英国LGC公司。

用标记K_060569和K_060570对已知含Xa7基因的水稻品种的水稻品种IRBB7、DZ78、DV85、华恢1437、华恢1337共5份基因供体材料和其它已知不含Xa7的18个水稻品种进行KASP初筛反应验证，结果如表3。含Xa7基因的水稻品种在K_060569测试位点检测结果均为碱基C，且在K_060570测试位点检测结果均为碱基G；18个不含Xa7水稻品种无论是其他抗白叶枯基因供体还是普感材料均未在K_060569和K_060570测试位点分别检测出碱基C和G。

表3SNP标记K_060569和K_060570KASP反应测试结果

为检测本发明中标记的特异性和实用性，利用190份材料对SNP标记K_060569和K_060570进行自然群体验证。190份材料中包括已知含纯合Xa7基因的品种、Xa7基因的F1单株、Xa7基因的F2单株、含有其他抗白叶枯供体、普感材料、常见杂交稻和核心水稻育种材料。标记在自然群体分型结果如图1和图2所示，2个标记检测结果高度一致，6份已知含Xa7基因的品种检测为具有白叶枯抗性的纯合Xa7基因型，6份Xa7基因的F1单株检测出杂合Xa7基因型，10份Xa7基因的F2单株检测出基因型分离，含有其他抗白叶枯供体、普感材料和核心水稻育种材料均检测为无白叶枯抗性纯合xa7基因型，常见杂交稻中少数出检测出杂合Xa7基因型。可见，SNP标记K_060569和K_060570检测Xa7基因位点为高特异性的抗性位点，可便捷高效的用于鉴定水稻品种中是否含有Xa7基因。

实施例2

1、分子标记的遗传位置验证

利用9个在父母本中具有多态性的全基因组标记以及本发明中的两个与Xa7连锁标记进行遗传位置验证，本发明的两个与Xa7连锁的分子标记均被定位到6号染色体82.7cM位置，如图3所示。

2、分子标记的表型验证

利用120株供体亲本华1228S和轮回亲本R608的F2杂交群体对本发明中的两个与Xa7连锁标记进行遗传表型验证。在水稻孕穗期，对F2群体120个单株及2个亲本品种接种广东白叶枯病菌株GD1358，21天后调查病情，表型数据与基因型一致性在90％以上，再次验证了本发明的可行性和准确性。选取极抗的50个单株提取DNA，经两个SNP标记分别检测，所有极抗单株均表现为抗病基因型或杂合基因型，选择效率达到100％。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 华智水稻生物技术有限公司

<120> 一种与白叶枯病抗性基因Xa7紧密连锁的SNP分子标记及其应用

<130> KHP161117902.2

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 121

<212> DNA

<213> K_060569

<220>

<221> misc_feature

<222> (61)..(61)

<223> s is g, or c

<400> 1

cctgaatcaa taaaactagc tgacatgcat cttcacatta cttagaattt agaaacggat 60

sttcaatcgc aaataggatg ttcttcaatc acaaaaggag tagtcaacat tagctggtac 120

a 121

<210> 2

<211> 121

<212> DNA

<213> K_060570

<220>

<221> misc_feature

<222> (61)..(61)

<223> r is g, or a

<400> 2

ctggctacag ctagattgct tcaaaaacga cctgtcgttg ctgtaattta tttgctcaac 60

rtagtattgt cattttaaaa cctttcgtac aaatatttat tatggcctta tgggcataac 120

c 121

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

acatcctatt tgcgattgaa c 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

acatcctatt tgcgattgaa g 21

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gctgacatgc atcttcacat 20

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gctgtaattt atttgctcaa cg 22

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

tgctgtaatt tatttgctca aca 23

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

atgcccataa ggccataata 20

Claims (6)

1.一种与白叶枯病抗性基因Xa7紧密连锁的SNP分子标记，其特征在于，其序列如SEQID No.2所示，第61bp位点处的碱基为G或A。

2.用于检测权利要求1所述分子标记的引物组合，其特征在于，包括：

(1)两条特异性引物：

Primer X：5’-GCTGTAATTTATTTGCTCAACG-3’；

Primer Y：5’-TGCTGTAATTTATTTGCTCAACA-3’；

(2)一条通用引物：

Primer C：5’-ATGCCCATAAGGCCATAATA-3’。

3.含有权利要求2所述引物组合的试剂或试剂盒。

4.权利要求2所述的引物组合在检测白叶枯病抗性基因Xa7中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：

S1、提取水稻样品基因组DNA；

S2、以水稻基因组DNA为模板，利用权利要求2所述引物组合进行KASP反应检测；其中，两条特异性引物分别连接不同的荧光序列；

S3、若只检测到引物PrimerY所连荧光序列对应的荧光信号，则判断水稻样品为携带白叶枯病抗性基因Xa7的纯和型；若只检测到引物PrimerX所连荧光序列对应的荧光信号，则判断水稻样品为不携带白叶枯病抗性基因Xa7的纯和型；若同时检测到两种荧光，则判断水稻样品为携带白叶枯病抗性基因Xa7的杂合型。

上述应用的实质为前述分子标记的检测方法。

6.权利要求1所述分子标记在水稻抗病性辅助育种中的应用，其特征在于，包括如下步骤：

S1、提取水稻样品基因组DNA；

S2、以水稻基因组DNA为模板，利用权利要求2所述引物组合进行KASP反应检测；其中，两条特异性引物分别连接不同的荧光序列；

S3、选择检测到引物PrimerY所连荧光序列对应的荧光信号的水稻样品进行育种。