CN108330204A - 鉴定番茄黄化曲叶病毒抗性基因的分子标记及其应用 - Google Patents
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Abstract
本申请提供了鉴定番茄黄化曲叶病毒抗性基因的分子标记及其应用，包括用于鉴定番茄黄化曲叶病毒抗性基因的引物对和试剂盒，鉴定番茄是否含有番茄黄化曲叶病毒抗性基因的方法，以及区分抗番茄黄化曲叶病毒番茄和感番茄黄化曲叶病毒番茄的方法。本申请所提供的分子标记能够快速准确地鉴定出番茄黄化曲叶病毒抗性基因，具有通量高、准确性好、效率高等优点，尤其适用于大规模材料的检测。
Description
技术领域
本申请属于分子生物学领域，具体涉及番茄黄化曲叶病毒抗性基因Ty-1紧密连锁的InDel分子标记及其应用。
背景技术
番茄是一种在全世界栽培极为广泛的蔬菜，也是我国的主要栽培蔬菜之一。然而在番茄生产过程中，病毒病日益严重，导致产量和品质下降，因此选育抗病品种就显得十分重要。
近几年，由番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl virus,TYLCV)引起的番茄黄化曲叶病毒病已成为全世界番茄生产上危害最严重的病害之一(Jones，2009)。培育抗病新品种是防治此病的根本途径(Abdelbacki et al.，2010)。
目前，番茄抗病育种主要是用Ty-1及Ty-3作为主抗病基因源。Ty-1和Ty-3为等位基因，且基因序列已被克隆(Verlaan et al.，2013)，这为分子标记辅助育种奠定了基础。
目前对于Ty-1的分子标记主要为CAPS标记。REX-1标记很长一段时间内被用于Mi1基因的鉴定，后来随着Ty-1基因的定位，发现REX-1标记与Ty-1基因也存在紧密连锁关系，也可以应用于Ty-1基因的鉴定(Milo，J.，2001.)，但是REX-1标记与Ty-1基因之间存在一定的重组。2007年(Pérez de Castro et al.，2007)又开发了CAPS标记JB1。
然而，CAPS标记均需要对PCR产物进行酶切，实验流程长，操作复杂，不适宜规模型操作。后期国内的学者也陆续开发了一些标记，例如，于力(2008)、付婉(2013)等人开发的标记都存在试验步骤繁琐、流程长、效率低、通量有限的弊端。
发明内容
一方面，本申请提供了鉴定番茄是否含有番茄黄化曲叶病毒抗性基因的方法，其包括：利用选自以下的至少一种引物对来扩增待鉴定的番茄样品中的核酸片段：其中，第一引物对包含正向引物：5’-ATGGGTGATCCGTTGATTGAAGA-3’，和反向引物：5’-GGAAGAAGAGCGTTTGAGTAGAC-3’；和/或第二引物对包含正向引物：5’-GGGTGATCCGTTGATTGAAG-3’，和反向引物：5’-TCTTCTTGATAGGACGACGTGA-3’；以及确定所扩增的核酸片段的长度，其中，当第一引物对扩增的核酸片段包含308bp长度和/或第二引物对扩增的核酸片段包含208bp长度时，所述番茄样品含有黄化曲叶病毒抗性基因。
在一实施方案中，所述方法中所使用的引物对还包含荧光基团。在另一实施方案中，所述荧光基团选自羧基荧光素、六氯荧光素、羧基四甲基罗丹明和羧基-X-罗丹明。
在一实施方案中，所述方法中所使用的番茄样品选自叶片、种子和果实。
另一方面，本申请提供了区分抗黄化曲叶病毒番茄和感黄化曲叶病毒番茄的方法，其包括：利用选自以下的至少一种引物对来扩增待区分的番茄样品中的核酸片段：其中，第一引物对包含正向引物：5’-ATGGGTGATCCGTTGATTGAAGA-3’，和反向引物：5’-GGAAGAAGAGCGTTTGAGTAGAC-3’；和/或第二引物对包含正向引物：5’-GGGTGATCCGTTGATTGAAG-3’，和反向引物：5’-TCTTCTTGATAGGACGACGTGA-3’；以及确定所扩增的核酸片段的长度，其中，i)当第一引物对扩增的核酸片段长度为308bp和/或第二引物对扩增的核酸片段长度为208bp时，所述番茄样品为纯合的抗黄化曲叶病毒番茄；ii)当第一引物对扩增的核酸片段长度为208bp和/或第二引物对扩增的核酸片段长度为196bp时，所述番茄样品为感黄化曲叶病毒番茄；或者iii)当第一引物对扩增的核酸片段长度为308bp和208bp，和/或第二引物对扩增的核酸片段长度为208bp和196bp时，所述番茄样品为杂合的抗黄化曲叶病毒番茄。
在一实施方案中，所述方法中所使用的引物对还包含荧光基团；任选地，所述荧光基团选自羧基荧光素、六氯荧光素、羧基四甲基罗丹明和羧基-X-罗丹明。
在一实施方案中，所述方法中所使用的番茄样品选自叶片、种子和果实。
此外，本申请还提供了用于鉴定番茄黄化曲叶病毒抗性基因的引物对，其包含第一引物对和/或第二引物对，其中第一引物对包含正向引物：5’-ATGGGTGATCCGTTGATTGAAGA-3’，和反向引物：5’-GGAAGAAGAGCGTTTGAGTAGAC-3’；和/或第二引物对包含正向引物：5’-GGGTGATCCGTTGATTGAAG-3’，和反向引物：5’-TCTTCTTGATAGGACGACGTGA-3’。
在一实施方案中，所述引物对还包含荧光基团。在另一实施方案中，所述荧光基团选自羧基荧光素、六氯荧光素、羧基四甲基罗丹明和羧基-X-罗丹明。
相应地，本申请提供了用于鉴定番茄黄化曲叶病毒抗性基因的试剂盒，其包含第一引物对和/或第二引物对，其中第一引物对包含正向引物：5’-ATGGGTGATCCGTTGATTGAAGA-3’，和反向引物：5’-GGAAGAAGAGCGTTTGAGTAGAC-3’；和/或第二引物对包含正向引物：5’-GGGTGATCCGTTGATTGAAG-3’，和反向引物：5’-TCTTCTTGATAGGACGACGTGA-3’。
在一实施方案中，所述试剂盒还包含：扩增缓冲液、dNTPs混合物、DNA聚合酶、MgCl2以及ddH2O。
进一步地，本申请还提供了引物对或者试剂盒的以下用途：i)鉴定番茄黄化曲叶病毒抗性基因Ty-1；ii)鉴定番茄是否含有黄化曲叶病毒抗性基因Ty-1；iii)区分抗黄化曲叶病毒番茄和感黄化曲叶病毒番茄，例如在Ty-1位点，区分抗黄化曲叶病毒番茄和感黄化曲叶病毒番茄；iv)区分纯合的抗黄化曲叶病毒番茄和杂合的抗黄化曲叶病毒番茄，例如在Ty-1位点，区分纯合的抗黄化曲叶病毒番茄和杂合的抗黄化曲叶病毒番茄；v)番茄育种；或者vi)番茄黄化曲叶病毒病防控。
本申请首次开发出用于番茄的InDel分子标记，其结合毛细管电泳技术能够快速准确地鉴定出目标基因，具有通量高、准确性好、效率高等优点，尤其适用于大规模材料的检测。
附图说明
图1为Ty1ID01引物的琼脂糖凝胶电泳结果。
图2为Ty1ID03引物的琼脂糖凝胶电泳结果。
在图1和图2中，数字依次表示泳道；1为DNA Marker，条带大小依次为500bp、400bp、300bp、200bp、150bp、100bp、50bp；2至4为抗番茄黄化曲叶病毒病材料00470所扩增出的特异性条带；5至7为感番茄黄化曲叶病毒病材料13268所扩增出的特异性条带。
图3为Ty1ID01荧光引物的ABI 3730XL DNA毛细管电泳检测结果图。
图4为Ty1ID03荧光引物的ABI 3730XL DNA毛细管电泳检测结果图。
在图3和图4中，上横坐标指示条带大小；灰色区域为设置的Bin区间，黑色区域指示最高峰；下横坐标“al”代表等位基因型，数值表示最高峰对应的条带大小。其中，A为感番茄黄化曲叶病毒病材料13268扩增出的特异峰，B为抗番茄黄化曲叶病毒病材料00470扩增出的特异峰，C为F2代分离群体中杂合子扩增出的特异峰。
图5为人工诱发黄化曲叶病毒病表现型照片。
在图5中，左图为抗病植株，叶片平展，生长正常；右图为感病植株，叶片边缘卷曲，生长异常。
具体实施方式
提供以下定义和方法用以更好地界定本申请以及在本申请实践中指导本领域普通技术人员。除非另作说明，术语按照相关领域普通技术人员的常规用法理解。
插入/缺失多态性(insertion/deletion,InDel)是由于等位基因位点处的DNA序列在不同个体间发生了核苷酸片段的插入/缺失而产生的长度多态性变异。
根据目标位点两侧的序列设计特异引物进行PCR扩增，扩增片段的长度多态性即是InDel标记，在整个基因组中，InDel的多态性频率仅次于SNP标记，远高于SSR标记。InDel标记为共显性标记，可区分显性纯合子和杂合子，具有较好的稳定性和较为丰富的多态性，广泛应用于高分辨率图谱构建、关联分析、基因定位和目标性状分析标记筛选等领域。
本申请基于已公开的抗番茄黄化曲叶病毒病和感番茄黄化曲叶病毒病材料的cDNA序列，利用Sequencher5.1软件来分析InDel位点，经过序列比对，筛选出位于Ty-1基因上的可信且差异大的InDel位点，在该InDel位点上感病材料相对于抗病材料缺失12个碱基。
在此基础上，本申请发明人针对该InDel位点设计多对引物，筛选出能够准确且可靠地鉴定抗病番茄和感病番茄的引物Ty1ID01(包含正向引物：5’-ATGGGTGATCCGTTGATTGAAGA-3’，和反向引物：5’-GGAAGAAGAGCGTTTGAGTAGAC-3’)和Ty1ID03(包含正向引物：5’-GGGTGATCCGTTGATTGAAG-3’，和反向引物：5’-TCTTCTTGATAGGACGACGTGA-3’)。
本申请所提供的引物还可包含本领域已知适用的任何荧光基团，以适应高通量检测需求，使扩增产物适用于荧光毛细管电泳检测。在具体实施方案中，荧光基团选自羧基荧光素、六氯荧光素、羧基四甲基罗丹明和羧基-X-罗丹明等，例如6-FAM，HEX等。
可以将本申请所提供的引物制备成试剂盒以便于使用。因此，本申请还提供了用于鉴定番茄黄化曲叶病毒抗性基因的试剂盒，其包含引物对Ty1ID01和/或Ty1ID003。
本申请所提供的可准确稳定地鉴定番茄黄化曲叶病毒抗性基因的引物或包含该引物的试剂盒，可用于鉴定番茄是否含有番茄黄化曲叶病毒抗性基因Ty-1，并且作为共显性标记进一步区分纯合的抗番茄黄化曲叶病毒番茄和杂合的抗番茄黄化曲叶病毒番茄，从而进行番茄育种以及番茄黄化曲叶病毒病防控等。
在具体实施方案中，本申请提供了鉴定番茄是否含有番茄黄化曲叶病毒抗性基因的方法，其包括：利用本申请所提供的引物对Ty1ID01和/或Ty1ID003来扩增待鉴定的番茄样品。具体地，当引物对Ty1ID01扩增的核酸片段长度为308bp，或者为308bp和296bp时，和/或引物对Ty1ID03扩增的核酸片段长度为208bp，或者为308bp和196bp时，所述番茄样品含有番茄黄化曲叶病毒抗性基因Ty-1；相反地，当引物对Ty1ID01扩增的核酸片段长度为296bp，和/或引物对Ty1ID03扩增的核酸片段长度为196bp时，所述番茄样品不含番茄黄化曲叶病毒抗性基因Ty-1。
在另一具体实施方案中，本申请提供了区分抗番茄黄化曲叶病毒番茄和感番茄黄化曲叶病毒番茄的方法，其包括：利用本申请所提供的引物对Ty1ID01和/或Ty1ID003来扩增待鉴定的番茄样品。具体地，当引物对Ty1ID01扩增的核酸片段长度为308bp和/或引物对Ty1ID03扩增的核酸片段长度为208bp时，所述番茄样品为纯合的抗番茄黄化曲叶病毒番茄；当引物对Ty1ID01扩增的核酸片段长度为296bp和/或引物对Ty1ID03扩增的核酸片段长度为196bp时，所述番茄样品为感番茄黄化曲叶病毒番茄；或者当引物对Ty1ID01扩增的核酸片长度为308bp和296bp，和/或引物对Ty1ID03扩增的核酸片段长度为208bp和196bp时，所述番茄样品为杂合的抗番茄黄化曲叶病毒番茄。
在具体实施方案中，所述番茄样品选自叶片、种子和果实中的任一种。
以下实施例仅用于说明而非限制本申请范围的目的。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等《分子克隆实验手册》(Sambrook J&Russell DW,Molecularcloning:a laboratory manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
实施例1InDel标记的开发
根据WO 2012/125025A1中所公开的抗番茄黄化曲叶病毒病和感番茄黄化曲叶病毒病材料的cDNA序列，利用Sequencher5.1软件来分析InDel位点。
将InDel位点序列与基因组序列进行比对，选取位于Ty-1基因上的可信且差异大的位点1个，在该位点上感病材料相对于抗病材料缺失12个碱基。
为优化筛选出能够准确、可靠地鉴定抗病番茄和感病番茄的引物，利用PrimerPremier 5软件针对该InDel位点设计多对PCR扩增引物，其中：
1)引物的长度一般为15-30bp，常用的是18-24bp，但不应大于38。
2)引物所对应的模板序列的Tm值在55-80℃之间，以72℃左右最佳。
3)引物序列的GC含量一般为40-60％，且上下游引物的GC含量不能相差太大。
4)引物中碱基需随机分布，且在模板内无相似性较高的其它序列，尤其在3’端。同时避免引物3’端出现3个以上的连续碱基。
5)避免引物二聚体的产生。
6)避免扩增产物的单链形成二级结构。
7)对设计的引物进行BLAST检测，确保其在基因组上的特异性。
在此仅以其中的三对引物为例，依次命名为Ty1ID01、Ty1ID02、Ty1ID03，其序列如下：
Ty1ID01-F：ATGGGTGATCCGTTGATTGAAGA，
Ty1ID01-R：GGAAGAAGAGCGTTTGAGTAGAC；
Ty1ID02-F：GGTGATCCGTTGATTGAAGAAAT，
Ty1ID02-R：GAGACAATCCGGGTAGCGATCA；
Ty1ID03-F：GGGTGATCCGTTGATTGAAG，
Ty1ID03-R：TCTTCTTGATAGGACGACGTGA。
为了适应高通量检测需求，使扩增产物适用于荧光毛细管电泳检测，可在上述引物中添加荧光基团。
在上游引物的5’端添加6-FAM荧光基团，分别合成Ty1ID01-F-FAM、Ty1ID02-F-FAM、Ty1ID03-F-FAM引物，该引物仍可与下游引物进行组合，适用于荧光毛细管电泳检测。
实施例2InDel标记的扩增
本实施例中所使用的材料为本申请人选育的高世代纯合抗番茄黄化曲叶病毒病材料00470和感番茄黄化曲叶病毒病材料13268，上述材料已用CAPS标记(Chen et al.，2012)进行了基因型的验证。
使用CTAB法提取番茄叶片中的基因组DNA，提取所得DNA溶液浓度为10-50ng/μl，保存于-20℃。
使用FOREGENE植物叶片直接PCR试剂盒(Plant Leaf Direct PCR Kit,成都福际生物技术有限公司)配置PCR反应体系，反应总体积为10μl，包括：2xForegene PCR Mix，5μl；DNA提取液(10-50ng/μl)，1μl；上下游引物各0.1μl(10pmol/μl)；以及ddH2O，3.8μl。
PCR反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30sec，59℃退火30sec，72℃延伸30sec，35个循环；72℃延伸5min。
1.利用3％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物
图1示出利用Ty1ID01引物进行PCR扩增后的电泳结果，图2示出利用Ty1ID03引物进行PCR扩增的结果，其中，图中数字依次表示泳道；1为DNA Marker，条带大小依次为500bp、400bp、300bp、200bp、150bp、100bp、50bp；2至4为00470材料所扩增出的特异性条带；5至7为13268材料所扩增出的特异性条带。Ty1ID02引物未扩增出目标条带。
结果显示，Ty1ID01在00470材料中扩增得308bp，在13268材料中扩增得296bp；Ty1ID03在00470材料中扩增得208bp，在13268材料中扩增得196bp。可见，二者在抗病番茄和感病番茄中的扩增产物均相差12bp，均与设计预期相符。
2.利用荧光毛细管电泳检测PCR产物
对添加了荧光基团的引物扩增的PCR产物稀释200倍后，取1μl与8.95μl HiDi、0.05μl Liz 500混合，于ABI 3730XL DNA分析仪上进行毛细管电泳。
图3示出利用Ty1ID01引物进行PCR扩增后的电泳结果，图4示出利用Ty1ID03引物进行PCR扩增的结果，图中上横坐标指示条带大小；灰色区域为设置的Bin区间，黑色区域指示最高峰；下横坐标“al”代表等位基因型，数值表示最高峰对应的条带大小，并且图中的A为13268材料扩增出的特异峰，B为00470材料扩增出的特异峰。
结果显示，Ty1ID01在00470材料中扩增得308bp，在13268材料中扩增得296bp；Ty1ID03在00470材料中扩增得208bp，在13268材料中扩增得196bp。可见，二者在抗病番茄和感病番茄中的扩增产物均相差12bp，均与设计预期相符。
以上结果表明，所设计的Ty1ID01和Ty1ID03均能够鉴定抗病番茄与感病番茄。
实施例3使用Ty1ID01和Ty1ID03鉴定抗病番茄和感病番茄
将父本高世代纯合抗番茄黄化曲叶病毒病材料00470与母本感番茄黄化曲叶病毒病材料13268杂交制备F1，F1自交获得F2代分离群体，共计220株。
在密闭的玻璃温室内种植F2分离群体，在3叶期人工释放带黄化曲叶病毒病的烟粉虱给番茄材料接种，不喷施任何杀虫剂，任其自然发病。接种后定期观察发病情况，30天后，待感病材料13268完全发病时统计F2群体各单株的发病情况。
使用番茄黄化曲叶病毒病病害严重度评价标准(Friedmann et al.，1998)进行表型观察：0，植株无任何感病症状；1，顶端叶尖和叶缘出现轻微的黄化；2，植株上部分叶片的末端出现轻微的黄化和卷曲；3，植株的叶片大面积变黄，卷曲甚至有杯突出现，同时叶片面积缩小，但植株仍可继续生长；4，植株严重萎缩，叶片变黄，呈现杯突和卷曲，植株停止生长。0至2等级记为抗病(R)，3、4等级记为感病(S)；00470为阳性对照病害程度为0记为R，13268为阴性对照病害程度为4记为S。
经观察，F2分离群体中表现型为R的单株数为168，为S的单株数为52；在统计学上，符合孟德尔遗传规律3：1的分离比例，说明表现型观察准确。图5为人工诱发黄化曲叶病毒病表现型照片，左图为抗病植株，叶片平展，生长正常；右图为感病植株，叶片边缘卷曲，生长异常。
采用如实施例2所述的方式，分别提取220株材料的DNA样本，使用Ty1ID01和Ty1ID03两对引物分别进行PCR扩增，使用ABI3730XL DNA分析仪进行毛细管电泳分析PCR产物。
结果显示，两对引物基因型结果完全一致：检测带型如图3和图4中B的单株数为60，检测带型如图3和图4中C的单株数为108、检测带型同图3和图4中A的单株数为52；在统计学上，符合孟德尔遗传规律1：2：1的分离比例，说明基因型检测准确；并且，前两者的表现型均为R，第三者的表现型均为S，基因型与表现型结果相吻合。
以上结果表明，Ty1ID01和Ty1ID03均能够准确地对抗病番茄和感病番茄进行鉴定。
实施例4Ty1ID01和Ty1ID03在分子标记辅助育种中的应用
使用同1个父本高世代纯合抗番茄黄化曲叶病毒病材料00470与36个母本材料杂交得F1，F1自交得F2，通过观察表现型，从F2群体中选择189株抗病单株、3株感病单株，对选出的单株进行基因型鉴定。
表现型观察方法同实施例3，基因型鉴定方法同实施例2。
结果显示，189株抗病单株中，60株材料扩增出了同图3和图4中B所示带型，129株扩增出了同图3和图4中C所示带型，3株感病单株均只扩增同图3和图4中A所示带型；基因型鉴定结果与表现型鉴定结果相符。
对鉴定出的60株纯合抗病单株进一步选育，其后代在抗病性上不会产生分离，可明显提高育种效率且缩短育种年限。
以上结果表明，Ty1ID01和Ty1ID03标记准确可靠，可应用于分子标记辅助选择育种。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本申请作了详尽的描述，但在本申请基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本申请精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本申请要求保护的范围。
序列表
<110> 中国种子集团有限公司
<120> 鉴定番茄黄化曲叶病毒抗性基因的分子标记及其应用
<130> 16C12753CN
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atgggtgatc cgttgattga aga 23
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ggaagaagag cgtttgagta gac 23
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ggtgatccgt tgattgaaga aat 23
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gagacaatcc gggtagcgat ca 22
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gggtgatccg ttgattgaag 20
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
tcttcttgat aggacgacgt ga 22
Claims (9)
1.鉴定番茄是否含有番茄黄化曲叶病毒抗性基因的方法，其包括：
利用选自以下的至少一种引物对来扩增待鉴定的番茄样品中的核酸片段：
第一引物对：
正向引物：5’-ATGGGTGATCCGTTGATTGAAGA-3’，和
反向引物：5’-GGAAGAAGAGCGTTTGAGTAGAC-3’；和/或第二引物对：
正向引物：5’-GGGTGATCCGTTGATTGAAG-3’，和
反向引物：5’-TCTTCTTGATAGGACGACGTGA-3’；以及
确定所扩增的核酸片段的长度，
其中，当第一引物对扩增的核酸片段包含308bp长度和/或第二引物对扩增的核酸片段包含208bp长度时，所述番茄样品含有番茄黄化曲叶病毒抗性基因。
2.区分抗番茄黄化曲叶病毒番茄和感番茄黄化曲叶病毒番茄的方法，其包括：
利用选自以下的至少一种引物对来扩增待区分的番茄样品中的核酸片段：
第一引物对：
正向引物：5’-ATGGGTGATCCGTTGATTGAAGA-3’，和
反向引物：5’-GGAAGAAGAGCGTTTGAGTAGAC-3’；和/或第二引物对：
正向引物：5’-GGGTGATCCGTTGATTGAAG-3’，和
反向引物：5’-TCTTCTTGATAGGACGACGTGA-3’；以及
确定所扩增的核酸片段的长度，
其中，
i)当第一引物对扩增的核酸片段长度为308bp和/或第二引物对扩增的核酸片段长度为208bp时，所述番茄样品为纯合的抗番茄黄化曲叶病毒番茄；ii)当第一引物对扩增的核酸片段长度为296bp和/或第二引物对扩增的核酸片段长度为196bp时，所述番茄样品为感番茄黄化曲叶病毒番茄；或者
iii)当第一引物对扩增的核酸片段包含308bp和296bp长度，和/或第二引物对扩增的核酸片段包含208bp和196bp长度时，所述番茄样品为杂合的抗番茄黄化曲叶病毒番茄。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述引物对还包含荧光基团；任选地，所述荧光基团选自羧基荧光素、六氯荧光素、羧基四甲基罗丹明和羧基-X-罗丹明。
4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述番茄样品选自叶片、种子和果实。
5.用于鉴定番茄黄化曲叶病毒抗性基因的引物对，其选自：
第一引物对：
正向引物：5’-ATGGGTGATCCGTTGATTGAAGA-3’，和
反向引物：5’-GGAAGAAGAGCGTTTGAGTAGAC-3’；和/或第二引物对：
正向引物：5’-GGGTGATCCGTTGATTGAAG-3’，和
反向引物：5’-TCTTCTTGATAGGACGACGTGA-3’。
6.如权利要求5所述的引物对，其中所述引物对还包含荧光基团；任选地，所述荧光基团选自羧基荧光素、六氯荧光素、羧基四甲基罗丹明和羧基-X-罗丹明。
7.用于鉴定番茄黄化曲叶病毒抗性基因的试剂盒，其包含权利要求5或6所述的引物对。
8.如权利要求7所述的试剂盒，其还包含：扩增缓冲液、dNTPs混合物、DNA聚合酶、MgCl2以及ddH2O。
9.如权利要求5或6所述的引物对或者如权利要求7或8所述的试剂盒，其用于：
i)鉴定番茄黄化曲叶病毒抗性基因Ty-1；
ii)鉴定番茄是否含有番茄黄化曲叶病毒抗性基因Ty-1；
iii)区分抗黄化曲叶病毒番茄和感黄化曲叶病毒番茄；
iv)区分纯合的抗黄化曲叶病毒番茄和杂合的抗黄化曲叶病毒番茄；
v)番茄育种；或者
vi)番茄黄化曲叶病毒病防控。
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