CN102533995A

CN102533995A - 一种区分欧洲型或亚洲型舞毒蛾的方法

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Publication number: CN102533995A
Application number: CN2011104583157A
Authority: CN
Inventors: 安榆林; 钱路; 徐梅; 郑斯竹; 杨晓军; 朱宏斌; 汪潇琳
Original assignee: PROPAGATION AND FOOD TEST CENTER OF JIANGSU ENTRY-EXIT INSPECTION AND QUARANTINE BUREAU
Current assignee: PROPAGATION AND FOOD TEST CENTER OF JIANGSU ENTRY-EXIT INSPECTION AND QUARANTINE BUREAU
Priority date: 2011-12-31
Filing date: 2011-12-31
Publication date: 2012-07-04
Anticipated expiration: 2031-12-31
Also published as: CN102533995B

Abstract

本发明涉及一种区分欧洲型或亚洲型舞毒蛾的方法，设计了引物对和探针序列，以所述样品总DNA为DNA模板，实时荧光定量PCR完成时，ABI7500实时荧光定量PCR仪显示样品检测结果为AlleleY值时，表明样品406位点碱基为G，即该样品为亚洲型舞毒蛾；当样品检测结果显示为AlleleX值时，表明样品406位点碱基为A，即样品为欧洲型舞毒蛾。检测快速，准确地鉴定欧洲型和亚洲型舞毒蛾，适用于口岸对进口木材的检测。

Description

一种区分欧洲型或亚洲型舞毒蛾的方法

技术领域

本发明涉及一种区分欧洲型或亚洲型舞毒蛾的检测方法，属于生物技术领域。

背景技术

舞毒蛾Lymantria dispar (L. ) 属鳞翅目Lepidoptera毒蛾科Lymantriidae，是一种杂食性农林害虫。根据其地理分布、生物学习性和形态特征，现在被分为亚洲亚种L . dispar asiatica Vnukovskii、欧洲亚种L. dispar dispar 和日本亚种L . dispar japonica (Motschulsky)。此前亚洲亚种和日本亚种被统称为亚洲型舞毒蛾。亚洲型舞毒蛾主要分布在亚洲和部分欧洲地区，雌成虫能飞行，可危害500余种寄主植物。欧洲型舞毒蛾原产欧洲，于1869年由欧洲传入美国，雌成虫不能飞行，危害约250种寄主植物。

由于亚洲型舞毒蛾成虫具飞行能力且寄主范围比欧洲型大等原因，美国有关部门认为亚洲型舞毒蛾比欧洲型舞毒蛾对其威胁更大。为了防止亚洲型舞毒蛾传入美国，从1991年开始，美国在其港口及附近地区对该虫开展监测，并先后对来自俄罗斯远东、日本高风险港口的船舶实施特别检疫措施。2007 年以来，北美植物保护组织(NAPPO)及其成员国先后致函中国政府，准备对来自中国相关港口的船舶也实施特别检疫措施。2009年8月，该组织正式通过了《来自亚洲舞毒蛾疫区船舶及货物操作管理指南》（NAPPO植物卫生措施区域标准第33号）。为此，我国必须克服相关技术问题，尽快研究出舞毒蛾不同地理种群差异的鉴定方法，避免来源地的混淆，以适应对外贸易的发展的需要。

尽管舞毒蛾存在生物学和形态学上的差异，但至今仍没有完全可信的形态和行为特征可以用来区分舞毒蛾不同基因型。因此，生化标记和基因标记技术常被用来区分舞毒蛾不同地理种群的技术手段。同功酶实验揭示了日本、欧洲、美国种群间的基因差异，Bogdanowicz等人报道了用线粒体DNA作为舞毒蛾来源的示踪诊断，Pfeifer等运用PCR内切酶技术分析核糖体DNA，区分了亚洲和北美种群。近年来，RAPD技术和AFLP技术也被用来作为舞毒蛾不同种群的分子标记。

线粒体DNA (mitochondrial DNA , mt DNA)是核外DNA，具有母系遗传、进化速率快、缺少重组等特点，已成为群体遗传结构、地理变异、系统发育及物种特征研究等领域的有效分子标记。线粒体DNA的CO I基因有显著的遗传分化并能为种群的鉴定提供有效信息，同时线粒体DNA的CO I基因易于扩增和测序，是研究昆虫地理群体及近缘种问题的有效且不可或缺的工具。

目前，现有方法大都需要经过繁琐的操作步骤和大量数据分析才能区分舞毒蛾的地里种群，而且无法做到对单一个体的区分，这对口岸舞毒蛾的检验检疫工作增加了难度。

发明内容

本发明的目的是提供一种区分欧洲型或亚洲型舞毒蛾的检测方法，通过世界不同地理种群舞毒蛾线粒体CO I基因碱基差异设计特异引物和MGB探针，能达到准确、快速、方便区分出舞毒蛾的地理来源，以适合口岸检疫人员操作。

本发明区分欧洲型或亚洲型舞毒蛾的检测方法如下步骤：

（1）提取样品总DNA ；

（2）以所述样品总DNA为DNA模板，以F和R为引物，MGB1和MGB2为探针，在ABI7500实时荧光定量PCR仪中进行实时荧光定量PCR；以AG序列为亚洲型阳性对照中的DNA模板，以OG序列为欧洲型阳性对照中的DNA模板；阴性对照中以ddH₂O替代DNA模板；

所述引物F的序列为：GGATGAACTGTTTACCCTCCTCTATCT；

所述引物R的序列为：TTGATGAAATACCAGCTAAGTGAAGAGAAAA；

所述探针MGB1的序列为：ACAGATCTACCTCTATGAGCA；

所述探针MGB2的序列为： AGATCTACCTCCATGAGCA；

所述探针MGB1以绿色荧光蛋白作为荧光报告基团，所述探针MGB2以羧基荧光素作为荧光报告基团；

所述AG序列为：ggatgaactgtttaccctcctctatcttctaatattgctcatggaggtagatctgttgatttagctattttttctcttcacttagctggtatttcatcaa；

所述OG序列为：ggatgaactgtttaccctcctctatcttctaatattgctcatagaggtagatctgttgatttagctattttttctcttcacttagctggtatttcatcaa。

（3）结果分析：实时荧光定量PCR完成时，ABI7500实时荧光定量PCR仪显示样品检测结果为Allele Y值时，表明样品406位点碱基为G，即该样品为亚洲型舞毒蛾；当样品检测结果显示为Allele X 值时，表明样品406位点碱基为A，即样品为欧洲型舞毒蛾。

所述实时荧光定量PCR的反应体系为：所述样品总DNA约50ng，2.5 μl 的10×引物探针预混MIX， 12.5 μl 的2×Taq MAN 缓冲液，ddH₂O 补足总体积至25 μl；所述亚洲型阳性对照以AG序列替代样品总DNA，所述欧洲型阳性对照以OG序列替代样品总DNA，阴性对照中以ddH₂O替代样品总DNA。

所述实时荧光定量PCR的具体步骤为：50℃条件下2 min；95℃条件下10 min；40个循环包括95℃条件下15 s，60℃条件下1min。

本发明基于MGB探针特异性强、结果可靠、检测速度快等特点，通过大量测序找到欧洲型和亚洲型舞毒蛾的保守碱基差异位点后，利用MGB探针对样品进行基因分型检测，所测结果与测序结果完全一致，表明该方法能够应用于舞毒蛾不同地理种群的区分。本方法与传统的分子标记与测序方法相比，利用MGB探针标记，从DNA抽提到获取实时荧光PCR图谱，整个过程在4h内便可完成，大大节约了检疫工作的人力和物力成本,达到快速、准确地鉴定欧洲型和亚洲型舞毒蛾的目的。

附图说明

图1是欧洲型、亚洲型舞毒蛾荧光信号基因分型散点图，其中“●”表示Allele X，即样品为欧洲型舞毒蛾，“◆”表示Allele Y，即样品为亚洲型舞毒蛾；“▲”表示Both，即样品为杂合子；“■”表示NTC，即样品为阴性对照；“X”表示Undetermined，即样品为待定；其中，结果显示为◆的样品是RVO1、RFV2、RV、RN1、RN2、JAP1、JAP2、JAP3、MG1、MG2、HLJ、MG3；结果显示为●的样品是MA1、MA2、ME、NJ1、MA3、WV、PA、NJ2。

图2 是采用本发明方法检测具体样品，其中“●”表示Allele X，即样品为欧洲型舞毒蛾；“◆”表示Allele Y，即样品为亚洲型舞毒蛾；“▲”表示Both，即样品为杂合子；“■”表示NTC，即样品为阴性对照；结果显示为◆的样品是RVO1 、NMCF1；结果显示为●的样品是MA1、NJ5。

具体实施方式

实施例1 区分欧洲型或亚洲型舞毒蛾的检测

亚洲型选用来自俄罗斯远东地区、蒙古、日本、中国的4个地理种群，欧洲型选自来自美国的地理种群，20份舞毒蛾成虫（卵），详见表1。

表1 实验用虫样信息

Figure 2011104583157100002DEST_PATH_IMAGE001

检测步骤如下：

(1) 提取样品总DNA

本次实验所采取的基因组DNA的提取方法参照Boyce（1989）的方法，根据实际情况对实验步骤做了部分修改。用镊子挑取舞毒蛾成虫胸部或单个卵块挑5粒卵，用蒸馏水冲洗3遍，后将样品置于1.5 ml离心管中。在该离心管中加入600 μl PTE浸泡液（浓度为0.01M 的Tris-Cl缓冲液, 其中含有0.2M EDTA, 0.05M NaCl， pH8.0）于4℃条件下过夜。弃浸泡液，在解剖镜下挑取所浸泡胸部肌肉或卵粒于新离心管中，用剪刀充分剪碎后加匀浆缓冲液（A液：B液：C液=8：1：1；其中A液：浓度为0.05M的Tris缓冲液, 其中含有浓度为0.1M的NaCl, 浓度为0.1M的Na2EDTA, pH7.0～8.0；B液：质量浓度为5%的SDS溶液；C液：浓度为2mg/ml的蛋白酶K溶液）600 μl，55℃水浴过夜。然后加入600 μl饱和酚，离心管上下颠倒2 min混匀后放入低温（4℃）离心机8000 r/min离心10 min，取上清液再提取一次。取上清液加600 μl氯仿/异戊醇溶液，颠倒2 min混匀后放入低温（4℃）离心机8000 r/min离心10 min。取上清液加预冷100%乙醇（预置于-7℃）1ml混匀后放入-20℃冰箱保存2小时沉淀DNA。于低温（4℃）离心机12000 r/min离心5 min，弃上清液后加预冷乙醇（体积浓度为75%）1 ml，在12000 r/min离心5 min（此步重复一次）。弃上清液加预冷乙醇（100%）1 ml，在12000 r/min离心5 min，弃上清液取沉淀，晾干后加30 μl 1×TE（浓度为10 mM的Tris-Cl缓冲液, pH 8.0，其中含有浓度为1 M的EDTA）溶解DNA，作为样品总DNA备用，放入-20℃冰箱中保存。

（2）　PCR扩增和序列测定

根据已发表的鳞翅目线粒体基因组序列，在COI基因两翼设计通用引物对：

COIF：CTTAAAATTTGCAATTTTATATC；

COIR: TTAAATCCATTACATATAGTCTG（takara公司合成），扩增产物大小1685 bp。

50 μl的PCR 反应体系包括5 μl 10×buffer（takara公司），4 μL dNTPs (2.5 mmol/L，takara公司)，4 μL MgCl₂(25 mmol/L)，上下游引物各10 pmol，0.5 U Taq 酶（takara公司），1 μl 的模板DNA（即提取的样品总DNA），以无菌水补至50 μl。PCR步骤为94℃预变性2 min；30个循环包括94℃变性30 s，45℃退火40 s，72℃延伸2.5 min；最后72℃延伸10 min。PCR产物用1.5%的琼脂糖电泳检测，在1685 bp位置出现一条特异性的条带，回收该条带后直接进行测序，以PCR 引物作为测序引物进行双向测序，由南京金思瑞生物科技有限公司完成。所测定的舞毒蛾COI基因序列已经提交GenBank 数据库，登录号见表1。

以样品总DNA为模板, 利用引物对COIF/COIR扩增所有样品,均得到一条特异PCR产物。对扩增产物进行双向测序, 拼接后与已发表的线粒体基因组序列比对，确定舞毒蛾COI基因全长1531bp，编码510个氨基酸。

所有测得的不同地理种群舞毒蛾样品的COI基因差异集中在1297bp范围内，共鉴定出17个差异位点，所有差异位点均发生的是转换变异。美国种群和亚洲种群有14个稳定的碱基位点差异，在亚洲型内部有4个位点存在碱基差异，其中日本有3个位点，蒙古1个位点。如表2所示。所有25个舞毒蛾样品中，COⅠ基因编码的509个氨基酸有2个位置存有差异，在135位置上亚洲17个舞毒蛾样本为G，美国的6个样本为S；在388位置上MG1和MG4为S，而其余样品则为G。从所测的23个舞毒蛾样品中仅鉴定出5个单元型, 其中4种是共享单元型(表1)。俄罗斯、中国、蒙古（MG2、MG3、MG5）12个样品的的序列完全一致；蒙古种群中MG1和MG4的2个样品序列完全一致；日本的3个样品中,JAP1和JAP3序列完全一致，JAP2是非共享单元型；来自美国的6个样品序列完全一致。计算的单元型(基因)多样性Hd为0.672, 核苷酸多样性Pi仅为0.00429。

表2. 舞毒蛾不同地理种群COⅠ序列各单元型的变异位点

Figure 2011104583157100002DEST_PATH_IMAGE003

注：“-”表示该碱基与Hap1相应位点碱基一致。

发明人对17个差异位点进行了仔细分析，发现：只有406位置上的碱基差异导致了欧洲型和亚洲型舞毒蛾在氨基酸上的差异，且在样品中稳定存在，所以选择该位置作为荧光探针标记。

（3）以样品总DNA为模板，以F和R为引物，MGB1和MGB2为探针，在ABI7500实时荧光定量PCR仪中进行实时荧光定量PCR；以AG序列为亚洲型阳性对照中的模板，以OG序列为欧洲型阳性对照中的模板；阴性对照中以ddH₂O替代模板；

所述引物F的序列为：GGATGAACTGTTTACCCTCCTCTATCT；

所述引物R的序列为：TTGATGAAATACCAGCTAAGTGAAGAGAAAA；

所述探针MGB1的序列为：ACAGATCTACCTCTATGAGCA；

所述探针MGB2的序列为： AGATCTACCTCCATGAGCA；

MGB1探针，与欧洲型舞毒蛾序列相同，以VIC（绿色荧光蛋白）作为荧光报告基团， MGB2探针，与亚洲型舞毒蛾序列相同，以FAM（羧基荧光素）作为荧光报告基团。

引物与探针交由ABI公司订制合成40×预混MIX，用无菌ddH₂O稀释至10×作为预混MIX，-20℃保存备用。在PCR反应管中配置以下反应体系： 25 μl体系中加入DNA模板（样品总DNA）１μl约50ng，2.5 μl 的10 X引物探针预混MIX， 12.5 μl 的2×Taq MAN 缓冲液，ddH₂O补足体积至25 μl。所述亚洲型阳性对照以AG序列替代样品总DNA，所述欧洲型阳性对照以OG序列替代样品总DNA，阴性对照中以ddH₂O替代样品总DNA。

使用ABI7500实时荧光定量PCR仪进行等位基因分析，第一步：读取扩增前荧光信号；第二步：进行荧光定量扩增，具体反应步骤：50℃条件下2 min，95℃条件下10 min，40个循环包括95℃条件下15 s，60℃条件下1min。

（4）结果分析：实时荧光定量PCR反应结束后，ABI7500实时荧光定量PCR仪立即进行终点读板分型，以标记探针的FAM 和VIC作为检测信号，机器将根据记录的数据将两种荧光信号进行比较计算，自动分型，制作出荧光信号基因分型散点图。当样品检测结果为Allele Y值时，表明样品406位点碱基为G，即该样品为亚洲型舞毒蛾；当样品检测结果显示为Allele X 值时，表明样品406位点碱基为A，即样品为欧洲型舞毒蛾。

利用引物F和R以及两条荧光探针，扩增100bp的COI基因的保守序列片段，其中含有406位点的差异碱基，采用终点读板基因分型模式检测483-533 nm通道(FAM)和523-568 nm通道(VIC)的数据，经过计算比较二者的比值，得到基因分型散点图(图1)。

从图1可以看出被检测的20个样品分成两簇，所测样品没有在406bp处既含有G，又含有A的分型，即各样品均按其基因型表现为纯合子，说明设计的引物及探针具有特异性，完全能够用于SNP快速分析。亚洲型样品RVO1、RFV2、RV、RN1、RN2、JAP1、JAP2、JAP3、MG1、MG2、HLJ、MG3在406bp处为G，显示为◆Allele Y；欧洲型样品MA1、MA2、ME、NJ1、MA3、WV、PA、NJ2在406bp处为A，显示为●Allele X。该检测结果与测序结果完全一致，表明该方法能很好的区分亚洲型与欧洲型舞毒蛾。

实施例2 采用本发明方法检测具体样品

选取RVO1（亚洲型）和MA1（欧洲型）作为阳性对照，内蒙古赤峰市采集的舞毒蛾NMCF1和上海检验检疫局赠送的NJ5（美国新泽西州）样品作为待检测样品。检测步骤如下：

（1）提取样品总DNA ：参照实施例1

（2）实时荧光定量PCR检测

以样品总DNA为模板，以F和R为引物，MGB1和MGB2为探针，在ABI7500实时荧光定量PCR仪中进行实时荧光定量PCR；

引物F的序列为：GGATGAACTGTTTACCCTCCTCTATCT；

引物R的序列为：TTGATGAAATACCAGCTAAGTGAAGAGAAAA；

探针MGB1的序列为ACAGATCTACCTCTATGAGCA；

探针MGB2的序列为AGATCTACCTCCATGAGCA；

引物与探针交由ABI公司订制合成40×预混MIX，用无菌ddH2O稀释至10×作为预混MIX，-20℃保存备用。在PCR反应管中配置以下反应体系：25 μl体系中加入DNA模板（样品DNA）１μl约50ng，2.5 μl 的10 ×引物探针预混MIX， 12.5 μl 的2×Taq MAN 缓冲液，ddH₂O补足体积至25 μl。

（3）结果分析：实时荧光定量PCR反应结束后，ABI7500实时荧光定量PCR仪立即进行终点读板分型，以标记探针的FAM 和VIC作为检测信号，机器将根据记录的数据将两种荧光信号进行比较计算，自动分型，制作出荧光信号基因分型散点图。根据该图，阳性对照RVO1和样品NMCF1的检测结果为◆Allele Y，即样品为亚洲型舞毒蛾，该样品406位点碱基为G；阳性对照MA1和样品NJ5的的检测结果为●Allele X，即样品为欧洲型舞毒蛾（图2）。

SEQUENCE LISTING

<110> 江苏出入境检验检疫局动植物与食品检测中心

<120> 一种区分欧洲型或亚洲型舞毒蛾的方法

<130> 20111230

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 27

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> F

<400> 1

ggatgaactg tttaccctcc tctatct 27

<210> 2

<211> 31

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> R

<400> 2

ttgatgaaat accagctaag tgaagagaaa a 31

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> MGB1

<400> 3

acagatctac ctctatgagc a 21

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> MGB2

<400> 4

agatctacct ccatgagca 19

<210> 5

<211> 100

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> AG

<400> 5

ggatgaactg tttaccctcc tctatcttct aatattgctc atggaggtag atctgttgat 60

ttagctattt tttctcttca cttagctggt atttcatcaa 100

<210> 6

<211> 100

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> OG

<400> 6

ggatgaactg tttaccctcc tctatcttct aatattgctc atagaggtag atctgttgat 60

ttagctattt tttctcttca cttagctggt atttcatcaa 100

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> COIF

<400> 7

cttaaaattt gcaattttat atc 23

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> COIR

<400> 8

ttaaatccat tacatatagt ctg 23

Claims

1.一种区分欧洲型或亚洲型舞毒蛾的方法：

（1）提取样品总DNA；

所述引物F的序列为：GGATGAACTGTTTACCCTCCTCTATCT；

所述引物R的序列为：TTGATGAAATACCAGCTAAGTGAAGAGAAAA；

所述探针MGB1的序列为：ACAGATCTACCTCTATGAGCA；

所述探针MGB2的序列为： AGATCTACCTCCATGAGCA；

所述AG序列为：

ggatgaactgtttaccctcctctatcttctaatattgctcatggaggtagatctgttgatttagctattttttctcttcacttagctggtatttcatcaa；

所述OG序列为：

ggatgaactgtttaccctcctctatcttctaatattgctcatagaggtagatctgttgatttagctattttttctcttcacttagctggtatttcatcaa；

2.根据权利要求1所述区分欧洲型或亚洲型舞毒蛾的方法，其特征在于所述实时荧光定量PCR的反应体系为：所述样品总DNA约50ng，2.5 μl 的10 X引物探针预混MIX， 12.5 μl 的2×Taq MAN 缓冲液，ddH₂O 补足总体积至25μl的；所述亚洲型阳性对照以AG序列替代样品总DNA，所述欧洲型阳性对照以OG序列替代样品总DNA，阴性对照中以ddH₂O替代样品总DNA。

3.根据权利要求2所述区分欧洲型或亚洲型舞毒蛾的方法，其特征在于所述荧光实时定量PCR的具体步骤为：50℃条件下2 min；95℃条件下10 min；40个循环包括95℃条件下15 s，60℃条件下1min。