CN104450898B - 一种毒蛾属昆虫的物种鉴别方法 - Google Patents

一种毒蛾属昆虫的物种鉴别方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种毒蛾属昆虫的物种鉴别方法，涉及生物技术领域。本发明方法包括如下步骤：找出毒蛾属每个种线粒体COI基因序列的差异位点，形成毒蛾属每个种的标准序列；将毒蛾属待测样品的线粒体COI基因序列与每个种的标准序列进行比对，取最大相似度值，待测昆虫隶属于最大值对应的种。本发明能够鉴定毒蛾属的昆虫，操作简单、准确性高、耗时短、特异性高，为毒蛾属昆虫的鉴定提供技术支撑。使用线粒体COI基因序列的差异位点规律作为种的鉴定特征，为物种建立身份证，准确区分近似种。本发明取待测序列各子序列依次与标准序列进行比对打分，更加合理、准确、严谨。

Description

一种毒蛾属昆虫的物种鉴别方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种毒蛾属昆虫的物种鉴别方法。
背景技术
舞毒蛾(Lymantria dispar，缩写为L.dispar)属鳞翅目(Lepidoptera)毒蛾科(Lymantriidae)毒蛾属(Lymantria)，是一种杂食性农林害虫。根据地理分布、生物学习性和形态特征，舞毒蛾(L.dispar)现在被分为亚洲亚种(L.dispar asiatica Vnukovskii)、欧洲亚种(L.dispar dispar Linnaeus)和日本亚种(L.dispar japonica Motschulsky)。
由于亚洲型舞毒蛾成虫具飞行能力且寄主范围比欧洲型大等原因，美国有关部门认为亚洲型舞毒蛾比欧洲型舞毒蛾对其威胁更大，为了防止亚洲型舞毒蛾传入美国，从1991年开始，美国在其港口及附近地区对该虫开展监测，并先后对来自俄罗斯远东、日本高风险港口的船舶实施特别检疫措施。2009年，北美植物保护组织(NAPPO)通过了《来自亚洲舞毒蛾疫区船舶及货物操作管理指南》(NAPPO植物卫生措施区域标准第33号)，对来自中国相关港口的船舶也实施特别检疫措施。随后，墨西哥、澳大利亚、新西兰等国也对中国船舶采取了同样做法。特别检疫对象也从单一的舞毒蛾扩大到模毒蛾、栎毒蛾等毒蛾属昆虫。为此，我国必须克服相关技术问题，尽快研究出舞毒蛾及毒蛾属内其它近似种的鉴定方法，加快通关速度，避免贸易摩擦，以适应对外贸易发展的需要。
目前，毒蛾属昆虫鉴定还是依赖成虫形态学方法。船舶上经常发现的是幼虫和卵，用形态学方法很难准确鉴定，这对口岸舞毒蛾的检验检疫工作增加了难度。
发明内容
本发明的目的是提供一种毒蛾属昆虫的物种鉴别方法，该方法能够鉴定毒蛾属昆虫，操作简单、准确性高、耗时短、特异性高。
本发明的目的通过下述技术方案予以实现。
一种毒蛾属昆虫的物种鉴别方法，包括以下步骤：
(1)下载毒蛾属昆虫的线粒体COI基因序列，进行多重序列比对，将所有序列转化为长度为L1 bp的序列，找出毒蛾属每个种的差异位点，形成毒蛾属每个种的标准序列；所述标准序列保留每个种的差异位点，其他位点用“N”补足使其长度为L1 bp；所述每个种的差异位点是指线粒体COI基因序列在种内保守、种间差异的碱基位点；
(2)扩增待测样品的线粒体COI基因，进行序列检测，所述待测样品的线粒体COI基因序列长度为L2bp；在所述待测样品线粒体COI基因序列的3’端补充“M”至长度为(L1+L2-1)bp，得到待比对序列；
(3)将待比对序列与每个种的标准序列进行比对，计算相似度S；所述 Nm表示待比对序列与每个种的标准序列碱基匹配的位点数，Nt表示每个种的标准序列中除“N”外的碱基数量。
(4)待测样品隶属于与最大相似度S相对应的种。
在本发明中，步骤(3)的具体方法如下：设n为序列中碱基的位置；首先，n取1～L1中的所有自然数，待比对序列取第1至第n位碱基形成待比对序列的第n个子序列，每个种的标准序列取第L1-n+1至第L1位碱基形成每个种标准序列的第n个子序列，将待比对序列的第n个子序列与每个种标准序列的第n个子序列进行比对，根据相似度计算相似度S，其中Nm1表示待比对序列的第n个子序列与每个种标准序列的第n个子序列碱基匹配的位点数，Nt表示每个种的标准序列中除“N”外的碱基数量；随后，n取2～L2中的所有自然数，待比对序列取第n至第n+L1-1位碱基形成待比对序列的第n+L1-1个子序列，将待比对序列的第n+L1-1个子序列与每个种的标准序列进行比对，根据相似度计算相似度S，其中Nm2表示待比对序列的第n+L1-1个子序列与每个种的标准序列碱基匹配的位点数，Nt表示每个种的标准序列中除“N”外的碱基数量。
优选的技术方案中，步骤(1)从BOLD数据库下载毒蛾属昆虫的线粒体COI基因序列。步骤(1)中的多重比对使用的软件为MEGA软件包中Clustal W软件。
在本发明中，步骤(2)中采用上、下游引物扩增待测样品的线粒体COI基 因，所述上游引物的序列为：5’-ATTCAACCAATCATAAAGATATTGG-3’，所述下游引物的序列为：5’-TAAACTTCTGGATGTCCAAAAAATCA-3’。
在本发明中，碱基匹配是指碱基相同。差异位点，包括两部分信息，序列中的位置及该位置的具体碱基。标准序列中的每个N占据一个碱基位点。
本发明能够鉴定毒蛾属的昆虫，操作简单、准确性高、特异性强，为毒蛾属昆虫的鉴定提供技术支撑。当待鉴定昆虫采用常规方法鉴定为毒蛾属后，采用本发明方法鉴定待测昆虫的种名，效率更高，准确性更高。
本发明与现有技术相比，具有如下优点：使用线粒体COI基因序列的差异位点规律作为种的鉴定特征，为物种建立身份证，准确区分近似种。将昆虫种间的差异追溯到DNA序列上碱基的差异，直观形象。本发明取待测序列各子序列依次与标准序列进行比对打分，更加合理、准确、严谨。本发明方法简单，易于操作，耗时短。本发明方法可以用web网站的形式呈现，为建立标准化，准确性高的物种鉴定平台打下基础。
附图说明
以下将结合附图对本发明作进一步说明。
图1-图8显示了毒蛾属线粒体COI基因每个种的差异位点。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施方式对本发明进行下一步详细描述。
实施例1
将确定为毒蛾属的昆虫采用本发明方法鉴定到种，具体如下：
1.从BOLD(http://www.boldsystems.org/)公开数据库下载毒蛾属(Lymantria)昆虫的线粒体COI基因序列，共有17个种，524条序列。应用MEGA软件包中Clustal W软件进行多重序列比对，也就是将所有序列对齐。将所有序列均转化为583bp长的序列。找出毒蛾属每个种的差异位点，形成毒蛾属每个种的标准序列；标准序列保留每个种的所有差异位点，其他位点用“N”补足使其长度为583bp；每个种的差异位点是指线粒体COI基因序列在种内保守、种间差异的碱 基位点，如图1-5所示。种内保守是指种内所有序列在同一位点处碱基相同。在种内保守的前提下，种间差异是指所有种内只要有一个种在同一位点处的碱基不同就定为种间差异。
2.使用磁珠法试剂盒(北京金麦格生物技术有限公司)提取毒蛾属待测昆虫的基因组DNA。使用上游引物和下游引物扩增线粒体COI基因序列，上游引物序列(SEQIDNO:2)为：5’-ATTCAACCAATCATAAAGATATTGG-3’，下游引物序列(SEQIDNO:3)为：5’-TAAACTTCTGGATGTCCAAAAAATCA-3’。待测样品的线粒体COI基因序列如SEQIDNO:1所示，长度为705bp。
3.在待测样品线粒体COI基因(SEQIDNO:1)序列的3’端补充“M”至序列长度为(705+583-1)bp，得到待比对序列。也就是说，在该基因序列3’端补充582个“M”。每个“M”占据一个碱基位点。
4.比对：设n为序列中碱基的位置。(1)首先，n取1～583中的所有自然数，待比对序列取第1至第n位碱基形成待比对序列的第n个子序列，每个种的标准序列取第583-n+1至第583位碱基形成每个种标准序列的第n个子序列，将待比对序列的第n个子序列与每个种标准序列的第n个子序列进行比对，根据相似度 计算相似度S，其中Nm1表示待比对序列的第n个子序列与每个种标准序列的第n个子序列碱基匹配的位点数，Nt表示每个种的标准序列中除“N”外的碱基数量计算相似度S。(2)随后，n取2～705中的所有自然数，待比对序列取第n至第n+583-1位碱基形成待比对序列的第n+583-1个子序列，将待比对序列的第n+583-1个子序列与每个种的标准序列进行比对，根据相似度 计算相似度S，其中Nm2表示待比对序列的第n+583-1个子序列与每个种的标准序列碱基匹配的位点数，Nt表示每个种的标准序列中除“N”外的碱基数量。
按照上述方法进行比对，待比对序列与每个种的标准序列比对583+705-1次。由于下载的毒蛾属线粒体COI基因共有17个种，所以待带比对序列与17个种的标准序列比对次数为(583+705-1)*17次，共获得(583+705-1)*17个相似度S。取最大相似度S，待测样品隶属于与最大相似度S相对应的种。通过计算发现，待测样品的线粒体COI基因与舞毒蛾种(Lymantria dispar)标准序 列进行比对，得到了最大相似度S(100％)，因此该待测样品为毒蛾属的舞毒蛾种。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 江苏出入境检验检疫局动植物与食品检测中心
<120> 一种毒蛾属昆虫的物种鉴别方法
<130> 20141125
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 705
<212> DNA
<213> 舞毒蛾
<400> 1
tattcaaccc ccacataaag atattggaac cttatatttt atttttggta tttgatcagg 60
aatagtagga acatctctaa gtttactaat tcgagctgaa ttagggaatc ctggatcatt 120
aatcggaaat gatcaaattt ataatactat tgttacagct catgcattta tcataatttt 180
ttttatggtt ataccaatta taattggagg atttggtaat tgattagtac ctttaatatt 240
aggagcccct gatatagctt tcccccgtat aaataatata agattttgat tattgccccc 300
ctcattaacc cttttaattt caagaagaat tgtagaaaat ggagcaggaa caggatgaac 360
tgtttaccct cctctatctt ctaatattgc tcatggaggt agatctgttg atttagctat 420
tttttctctt cacttagctg gtatttcatc aattttagga gcaattaatt ttattactac 480
cattattaat atacgattaa gaaatttatc gtttgatcaa atacctttat ttgtttgaag 540
agttggaatt acagctttcc ttctactttt atctttacct gttttagcag gtgctattac 600
aatattatta actgaccgaa atttaaatac atcctttttt gaccctgcag gaggagggga 660
tccaatcctt taccaacatt tattttgatt ttttggacat catga 705
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 上游引物
<400> 2
attcaaccaa tcataaagat attgg 25
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 下游引物
<400> 3
taaacttctg gatgtccaaa aaatca 26

Claims (1)

1.一种毒蛾属昆虫的物种鉴别方法，其特征在于该方法包括以下步骤：
(1)从BOLD数据库下载毒蛾属昆虫的线粒体COI基因序列，采用MEGA软件包中的Clustal W软件进行多重序列比对，将所有序列转化为长度为L1bp的序列，找出毒蛾属每个种的差异位点，形成毒蛾属每个种的标准序列；所述标准序列保留每个种的差异位点，其他位点用“N”补足使其长度为L1bp；所述每个种的差异位点是指线粒体COI基因序列在种内保守、种间差异的碱基位点；
(2)采用上、下游引物扩增待测样品的线粒体COI基因，进行序列检测，所述待测样品的线粒体COI基因序列长度为L2bp；在所述待测样品线粒体COI基因序列的3’端补充“M”至长度为(L1+L2-1)bp，得到待比对序列；所述上游引物的序列为：5’-ATTCAACCAATCATAAAGATATTGG-3’，所述下游引物的序列为：5’-TAAACTTCTGGATGTCCAAAAAATCA-3’；
(3)将待比对序列与每个种的标准序列进行比对，计算相似度S；所述 Nm表示待比对序列与每个种的标准序列碱基匹配的位点数，Nt表示每个种的标准序列中除“N”外的碱基数量；待测样品隶属于与最大相似度S相对应的种；
步骤(3)的具体方法如下：设n为序列中碱基的位置；首先，n取1～L1中的所有自然数，待比对序列取第1至第n位碱基形成待比对序列的第n个子序列，每个种的标准序列取第L1-n+1至第L1位碱基形成每个种标准序列的第n个子序列，将待比对序列的第n个子序列与每个种标准序列的第n个子序列进行比对，根据相似度计算相似度S，其中Nm1表示待比对序列的第n个子序列与每个种标准序列的第n个子序列碱基匹配的位点数，Nt表示每个种的标准序列中除“N”外的碱基数量；随后，n取2～L2中的所有自然数，待比对序列取第n至第n+L1-1位碱基形成待比对序列的第n+L1-1个子序列，将待比对序列的第n+L1-1个子序列与每个种的标准序列进行比对，根据相似度 计算相似度S，其中Nm2表示待比对序列的第n+L1-1个子序列与每个种的标准序列碱基匹配的位点数，Nt表示每个种的标准序列中除“N”外的碱基数量。
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