CN110484634A - 基于普通pcr技术的木毒蛾快速鉴定引物及其应用、鉴定方法 - Google Patents
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Abstract
基于普通PCR技术的木毒蛾快速鉴定引物及其应用、鉴定方法，属于林业和植物检疫技术领域。该木毒蛾快速鉴定引物包括上游引物LX‑F和下游引物LX‑R，所述上游引物LX‑F核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述下游引物LX‑R核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明利用普通PCR技术，基于木毒蛾线粒体COI基因设计特异性引物，可快速实现木毒蛾卵、幼虫和虫体不完整情况下的鉴定，可以准确与毒蛾属其他昆虫卵块、幼虫等的区分，避免形态鉴定可能产生的混淆。
Description
技术领域
本发明属于林业和植物检疫技术领域，具体涉及基于普通PCR技术的木毒蛾快速鉴定引物及其应用、鉴定方法。
背景技术
木毒蛾隶属鳞翅目Lepidoptera裳蛾科Erebidae毒蛾亚科Lymantriinae 毒蛾族Lymantriini毒蛾属Lymantria，在进出境检验检疫中非常容易与重要检疫害虫舞毒蛾混淆，毒蛾属包括多种昆虫，木毒蛾与舞毒蛾、栎毒蛾、枫毒蛾、雪松毒蛾等形态相近，尤其是幼虫形态。
现有针对木毒蛾的检验方案即运用形态学方法对木毒蛾与舞毒蛾、雪松毒蛾、栎毒蛾等近缘种进行区分。
然而，形态学鉴定方法的缺陷不仅在于对卵、幼虫和蛹等虫态的鉴定困难,对于虫体不完整的情况也无法作出快速准确的鉴定，木毒蛾与同属其他毒蛾如舞毒蛾、栎毒蛾等在外形非常相似，尤其木毒蛾作为北美地区进境检疫严密监控对象舞毒蛾的近缘种，增加了我国口岸出口船舶贸易检验检疫工作的难度，而目前尚无针对木毒蛾与毒蛾属其他昆虫的快速鉴定方法。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种基于普通PCR技术的木毒蛾快速鉴定引物及其应用、鉴定方法的技术方案。
所述的基于普通PCR技术的木毒蛾快速鉴定引物，其特征在于包括上游引物LX-F和下游引物LX-R，所述上游引物LX-F核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述下游引物LX-R核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
所述的引物在快速鉴定木毒蛾与其近缘种中的应用。
所述的应用，其特征在于所述木毒蛾近缘种包括舞毒蛾、栎毒蛾、枫毒蛾和雪松毒蛾。
所述的基于普通PCR技术的木毒蛾快速鉴定方法，其特征在于包括以下步骤：
1）取上游引物LX-F和下游引物LX-R，分别对木毒蛾与其近缘种进行特异性PCR扩增；
2）取扩增产物进行电泳，染色，成像分析，若扩增得到424bp条带，则鉴定为木毒蛾。
所述的方法，其特征在于所述步骤1）中PCR反应体系为20μL，包括1 μL模板DNA，10μM上下游引物各0.4μL，2.5mM dNTPs1.6μL，2 μL 10 × PCR buffer，5 U/μL TaqDNApolymerase0.1 μL，13.5 μL ddH2O，PCR buffer含有Mg2 +；PCR反应条件为：94ºC预变性3min；然后进入循环，94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min，35个循环；最后72℃延伸10 min。
本发明利用普通PCR技术，基于木毒蛾线粒体COI基因设计特异性引物，可快速实现木毒蛾卵、幼虫和虫体不完整情况下的鉴定，可以准确与毒蛾属其他昆虫卵块、幼虫等的区分，避免形态鉴定可能产生的混淆。
附图说明
图1为本发明的引物LX-F/ LX-R在木毒蛾上的位置示意图；
图2为引物LX-F/ LX-R特异性扩增电泳结果示意图，图中M：分子标记DL2000；1：LD-HLJ；2：LD-JL；3：LD-SY；4：LD-HB；5：LD-NM；6：LD-LYG；7： LX；8：LM；9：LSI；10：LSU；
图3为引物LX-F/ LX-R在不同退火温度下的电泳结果示意图，图中泳道1-6退火温度分别为54℃，55℃，56℃，57℃，58℃，59℃。
具体实施方式
以下结合实施例来进一步说明本发明。
实施例1
实现对木毒蛾的快速检测，依据目前研究成果，我们选择了木毒蛾(LX)、栎毒蛾(LM)、枫毒蛾(LSI)、雪松毒蛾(LSU)以及舞毒蛾（LD）的六个地理种群，包括黑龙江（LD-HLJ）、内蒙（LD-NM）、吉林(LD-JL)、沈阳(LD-SY)、河北(LD-HB)、连云港(LD-LYG)，基于线粒体COI基因设计了木毒蛾的特异性引物，可特异性扩增木毒蛾。
具体操作如下：
1.DNA提取。使用以上十种毒蛾成虫的足进行DNA提取，DNA提取采用德国QIAGEN公司的DNeasy®Tissue Kit提取试剂盒。
2. 目标序列选取。对木毒蛾的mtDNA全序列进行分析，如图1所示，选择突变率较高的基因片段作为扩增的目的片段。
3. 特异性引物设计。针对所做类群，设计上游引物为LX-F:5’-TTAGCTGGTATTTCCTCA -3’（SEQ ID NO.1所示）,下游引物为LX-R:5’-CAATATCTATACCTACAGTGA-3’（ SEQ ID NO.2所示）。
4. PCR实验。将以上引物LX-F/ LX-R（引物由杭州擎科生物公司合成）对木毒蛾及其近缘种进行特异性扩增。所配PCR反应体系为20μL，包括1 μL模板DNA，上下游引物各0.4μL（10 μM），1.6μL dNTPs（2.5mM），2 μL 10 × PCR buffer（含有Mg2 +），0.1 μL TaqDNApolymerase（5 U/μL），13.5 μL ddH2O。PCR反应条件为：94ºC预变性3 min；然后进入循环，94 ºC变性30 s，56ºC退火30 s，72ºC延伸1 min，35个循环；最后72ºC延伸10 min。
5.取10µL PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶1×TAE缓冲液中电泳，核酸染料(GelRed)染色，在凝胶成像系统(Alpha Imager HP)中观察并成像分析。只有木毒蛾样品的PCR产物扩增产物得到424bp条带，其它近缘种均无条带出现，如图2所示。
6.不同退火温度的梯度PCR实验。经初步实验，引物LX-F/ LX-R在低于54℃时，木毒蛾、雪松毒蛾均出现条带，此时无特异性。电泳结果显示，引物LX-F/ LX-R 的最佳退火温度为56℃，如图3所示。
序列表
<110> 浙江省检验检疫科学技术研究院
<120> 基于普通PCR技术的木毒蛾快速鉴定引物及其应用、鉴定方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequence)
<400> 1
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<212> DNA
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caatatctat acctacagtg a 21
Claims (5)
1.基于普通PCR技术的木毒蛾快速鉴定引物，其特征在于包括上游引物LX-F和下游引物LX-R，所述上游引物LX-F核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述下游引物LX-R核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.如权利要求1所述的引物在快速鉴定木毒蛾与其近缘种中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述木毒蛾近缘种包括舞毒蛾、栎毒蛾、枫毒蛾和雪松毒蛾。
4.基于普通PCR技术的木毒蛾快速鉴定方法，其特征在于包括以下步骤：
1）取上游引物LX-F和下游引物LX-R，分别对木毒蛾与其近缘种进行特异性PCR扩增；
2）取扩增产物进行电泳，染色，成像分析，若扩增得到424bp条带，则鉴定为木毒蛾。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于所述步骤1）中PCR反应体系为20μL，包括1 μL模板DNA，10 μM上下游引物各0.4μL，2.5mM dNTPs1.6μL，2 μL 10 × PCR buffer，5 U/μLTaqDNA polymerase0.1 μL，13.5 μL ddH2O，PCR buffer含有Mg2 +；PCR反应条件为：94ºC预变性3 min；然后进入循环，94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min，35个循环；最后72℃延伸10 min。
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