CN105274257A - 一种鲤疱疹病毒ii型实时荧光pcr检测方法 - Google Patents

一种鲤疱疹病毒ii型实时荧光pcr检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种鲤疱疹病毒II型实时荧光PCR检测方法，包括提取病毒样品中CyHV-2病毒的DNA，进行实时荧光PCR扩增检测，其中，上游引物F：5ˊ-CTGGGTACTGTCTGTCCATGTTG-3ˊ，下游引物R：5ˊ-CAAAACGGGCTGGCAGTCT-3ˊ，探针P：5ˊFAM-TTG？TAC？CAG？CAC？TCG？CCA？ATG？AGC？A-BHQ？3ˊ。本发明建立的荧光定量PCR方法与已报道的方法相比，不仅简单、快速，而且准确、灵敏、检出限低，该方法能快速、准确测定患病鱼体组织中的病毒含量，所用试剂简单、微量，设备简单，操作简便、快速。

Description

一种鲤疱疹病毒II型实时荧光PCR检测方法
技术领域
本发明是一种鲤疱疹病毒II型实时荧光PCR检测方法，具体涉及能实时、快速实现鲤疱疹病毒II型荧光PCE定量检测的方法，属于水产养殖动物病原检测领域。
背景技术
鲤疱疹病毒II型 （Cyprinid herpesvirus 2，CyHV-2）感染引起的鲫鱼疱疹病毒病是目前发现的唯一感染异育银鲫的病毒性疾病，其死亡率极高，危害巨大，传染性强，可通过水平和垂直传播，生产实践表明，目前该病尚无有效的预防和控制措施，给养殖户带来了巨大经济损失，因此该病已成为我国鲫鱼养殖的主要威胁。
电子显微镜观察和分子生物学诊断方法是目前对于CyHV-2病毒的主要检测方法。由于缺少适合培养CyHV-2的细胞系，因此CyHV-2诊断大多数依靠对发病鱼组织进行组织学检查后再经电子显微镜观察到疱疹病毒粒子进行确证。PCR法由于其可以检测到组织中极微量的病毒 DNA，是目前较为精确检测CyHV-2感染的分子生物学方法，但需经过凝胶电泳才能观察结果，操作繁琐、极容易交叉污染，且只能定性检测。实时荧光定量PCR（fluorescent quantitative real-time PCR，qPCR）是在PCR反应体系中加入荧光结合染料（如SYBR® green I）或特异性探针（如TaqMan®Probes)，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过Ct（Cq）值和标准曲线对起始模板进行定量分析。由于qPCR灵敏度和准确性高、重复性好、成本低、操作便捷，被广泛应用于病毒感染和肿瘤癌基因等的定量分析中。例如：《锦鲤疱疹病毒TaqMan荧光定量PCR快速检测方法的建立及应用》（吉林农业大学学报，2012,34(3)：339-342,354）和《锦鲤疱疹病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用》（中国海洋大学，2007年9月，第37卷第5期）。
《锦鲤疱疹病毒TaqMan荧光定量PCR快速检测方法的建立及应用》公开了一种有效的检测锦鲤疱疹病毒病（KHV）检疫方法，需要根据KHV聚合酶基因（Sph）的保守序列设计1对引物和相应的TaqMan探针，然后建立荧光PCR方法对KHV进行快速检测，能检出的最低拷贝数为116@102/LL，所建立的荧光PCR检测方法在4h内可报告检测结果，适用于KHV的快速检疫。
《锦鲤疱疹病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用》通过选取KHV病毒TK基因的保守序列，利用PRIMEREXPRESS2.0设计引物和探针，其中Taqman探针的5ˊ端标记FAM，3ˊ端标记TAMRA，然后利用梯度稀释的阳性样品克隆质粒进行定量PCR反应，检测得到实时荧光定量PCR对KHV的灵敏度为32个病毒核酸拷贝数。
发明内容
为克服现有电子显微镜观察和分子生物学诊断方法用于鲤疱疹病毒II型检测时存在的操作繁琐、完成度差等缺陷，本发明提供了一种鲤疱疹病毒II型实时荧光PCR检测方法，所选取的上游引物F、下游引物R和探针P根据鲤疱疹病毒II型特有的保守基因序列而设计，特异性的识别CyHV-2病毒，特异性强，灵敏度高，可实现CyHV-2病毒的实时监测，完成度高。
本发明通过下述技术方案实现：一种鲤疱疹病毒II型实时荧光PCR检测方法，包括提取病毒样品中CyHV-2病毒的DNA，进行实时荧光PCR扩增检测，其中，上游引物F：5ˊ- CTGGGTACTGTCTGTCCATGTTG -3ˊ，下游引物R：5ˊ- CAAAACGGGCTGGCAGTCT-3ˊ，探针P：5ˊFAM- TTG TAC CAG CAC TCG CCA ATG AGC A -BHQ 3ˊ。
经扩增后的基因片段为：
CAAAACGGGCTGGCAGTCTCCCATGCTCATTGGCGAGTGCTGGTACAAGTGGAGGGCCTGCAACATGGACAGACAGTACCCAG。
鲤科疱疹病毒不同型病毒之间基因序列同源性较高，容易产生非特异性扩增，本方法选择鲤科疱疹病毒II型特有的保守序列，根据CyHV-2 ORF6基因序列（登录号：JQ815364.1）用软件（Primer Express 3.0）设计并合成基因特异性引物及Taqman探针，表现出了较好的特异性。
用磁珠法病毒DNA/RNA提取试剂盒提取所述病毒样品中CyHV-2病毒的DNA，并置于-80～-20℃的温度下保存备用。
在所述实时荧光PCR扩增检测中，扩增片段为83bp，扩增体系为20～50 μL，进一步的，扩增体系为20～25μL。
在上述过程中，选择这一扩增片段和扩增体系的目的是：引物采用Primer Express 3.0软件进行设计，该对引物探针软件评分最高，理论扩增效率最高；该扩增片段为鲤科疱疹病毒II型特有的保守基因序列，且在ORF6和ORF24中均含有一个拷贝，理论上比仅有一个拷贝的基因敏感性高50%，扩增体系选择20~50μL体系，可适用于不同的荧光定量仪检测，适用范围广。
所述实时荧光PCR的扩增反应条件包括：94～95℃ 1～3min，95℃ 5～15 s、56～58℃ 30～40 s、72℃ 20～30 s，循环35～45次，检测设立阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为阳性质粒标准品。
进一步的，可选择：95℃ 3 min；95℃ 10 s、56℃ 40 s、72℃ 30 s，循环40次。
在实际操作时，取50 μL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收目的片段并与PMD19-T克隆载体16℃连接过夜后转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞；在含氨苄青霉素的培养板上37℃培养12 h后挑取单个菌落增菌后用小量质粒抽提试剂盒提取质粒，进行PCR分析鉴定；将筛选的阳性重组质粒进行测序。测序结果在NCBI上进行BLAST分析，序列正确的阳性质粒即为CyHV-2荧光定量PCR的标准品，即阳性对照。阳性标准品利用implen超微量分光光度计进行定量读数，计算出拷贝数后进行10倍连续梯度稀释，-20℃保存备用；阴性对照为ddH2O。反应结束后，利用荧光PCR仪器的分析软件，依据Ct值和扩增动力学曲线进行分析测定。
本发明与现有技术相比，具有以下优点及有益效果：
（1）本发明是利用实时荧光PCR方法对鲤科疱疹病毒II型进行的快速检测，上游引物F、下游引物R和探针P均根据鲤疱疹病毒II型特有的保守基因序列进行选择，特异性的识别鲤疱疹病毒II型病毒，特异性强，适用于患病鱼体组织中鲤疱疹病毒II型病毒的快速、准确测定。
（2）本发明涉及的上游引物F、下游引物R和探针P选择该病毒具有两个拷贝的基因序列（在病毒基因组ORF6和ORF24基因各含有一个拷贝的保守序列）进行设计，较现有基于单拷贝基因设计的引物探针方法，其敏感性可直接提高50%。
（3）本发明以阳性质粒标准品为阳性对照，构建了以质粒标准品进行的敏感度测定，该方法能够最低检测到32个拷贝的核酸标准分子，具有灵敏度强、检出限低的优点。
（4）本发明涉及的检测方法所用试剂简单、微量，设备简单，操作简便、快速，涉及的试剂可设计为商品化试剂盒，每孔只需25～50μL体系，磁珠法核酸提取过程较快，用时约为30～40min，荧光定量运行过程约为40～50min，整个操作过程可在2h内完成，满足口岸、进出口等检验检疫的要求。
附图说明
图1为本发明方法中上游引物F、下游引物R和探针P的不同配比终浓度时的扩增曲线。
图2为本发明方法中不同退火温度时的扩增曲线。
图3为本发明方法中目的片段PCR产物的琼脂糖凝胶电泳。
图4为本发明方法中TaqMan荧光定量PCR检测疱疹病毒2型的标准曲线。
图5为本发明方法中敏感性试验对照图。
图6为本发明方法中特异性试验对照图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步地详细说明，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1：
本实施例涉及一种鲤疱疹病毒II型实时荧光PCR检测方法，该方法包括提取病毒样品中CyHV-2病毒的DNA，进行实时荧光PCR扩增检测，其中，上游引物F：5ˊ- CTGGGTACTGTCTGTCCATGTTG -3ˊ，下游引物R：5ˊ- CAAAACGGGCTGGCAGTCT-3ˊ，探针P：5ˊFAM- TTG TAC CAG CAC TCG CCA ATG AGC A -BHQ 3ˊ。
实施例2：
本实施例在实施例1的基础上，进一步提出了用磁珠法病毒DNA/RNA提取试剂盒提取病毒样品中CyHV-2病毒的DNA，并置于-80℃的温度下保存备用。
实施例3：
本实施例在实施例2的基础上， 进一步提出了在实时荧光PCR扩增检测中，扩增片段为83bp，扩增体系为20μL。
实施例4：
本实施例在实施例3的基础上，进一步提出了实时荧光PCR的扩增反应条件包括：94℃ 1 min；95 ℃ 5 s、56 ℃ 30 s、72 ℃ 20 s，循环35次；检测设立阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为阳性质粒标准品。
实施例5：
本实施例涉及的鲤疱疹病毒II型实时荧光PCR检测方法包括以下步骤：
1）根据CyHV-2 ORF6基因序列（登录号：JQ815364.1）用软件（Primer Express 3.0）设计并合成基因特异性引物及Taqman探针，如下所示：
上游引物F：5ˊ- CTGGGTACTGTCTGTCCATGTTG -3ˊ；
下游引物R：5ˊ- CAAAACGGGCTGGCAGTCT-3ˊ；
探针P：5ˊFAM- TTG TAC CAG CAC TCG CCA ATG AGC A -BHQ 3ˊ。
2）用磁珠法病毒DNA/RNA提取试剂盒提取病毒样品中CyHV-2病毒的DNA，并置于-20℃的温度下保存备用。
3）进行实时荧光PCR扩增检测，扩增片段为83bp，扩增体系为50μL，扩增反应条件包括：95℃ 3 min；95℃ 15 s、56℃ 40 s、72℃ 30 s，循环45次；检测设立阳性对照和阴性对照，阳性对照为阳性质粒标准品，阴性对照为ddH2O。
实施例6：
本实施例涉及的鲤疱疹病毒II型实时荧光PCR检测方法包括以下步骤：
1）根据CyHV-2 ORF6和ORF24基因序列（登录号：JQ815364.1）用软件（Primer Express 3.0）设计并合成基因特异性引物及Taqman探针，如下所示：
上游引物F：5ˊ- CTGGGTACTGTCTGTCCATGTTG -3ˊ；
下游引物R：5ˊ- CAAAACGGGCTGGCAGTCT-3ˊ；
探针P：5ˊFAM- TTG TAC CAG CAC TCG CCA ATG AGC A -BHQ 3ˊ。
2）用磁珠法病毒DNA/RNA提取试剂盒提取病毒样品中CyHV-2病毒的DNA，并置于-30℃的温度下保存备用。
3）进行实时荧光PCR扩增检测，扩增片段为83bp，扩增体系为25μL，扩增反应条件包括：95℃ 3 min；95℃ 10 s、56℃ 40 s、72℃ 30 s，循环40次；检测设立阳性对照和阴性对照，阳性对照为阳性质粒标准品，阴性对照为ddH2O。
实施例7：
本实施例涉及的鲤疱疹病毒II型实时荧光PCR检测方法包括以下步骤：
1）根据CyHV-2 ORF6和ORF24基因序列（登录号：JQ815364.1）用软件（Primer Express 3.0）设计并合成基因特异性引物及Taqman探针，如下所示：
上游引物F：5ˊ- CTGGGTACTGTCTGTCCATGTTG -3ˊ；
下游引物R：5ˊ- CAAAACGGGCTGGCAGTCT-3ˊ；
探针P：5ˊFAM- TTG TAC CAG CAC TCG CCA ATG AGC A -BHQ 3ˊ。
2）用磁珠法病毒DNA/RNA提取试剂盒提取病毒样品中CyHV-2病毒的DNA，并置于-20℃的温度下保存备用。
3）进行实时荧光PCR扩增检测，扩增片段为83bp，扩增体系为20μL，扩增反应条件包括：95℃ 1min；95℃ 5s、58℃ 30s、72℃ 25s，循环45次；检测设立阳性对照和阴性对照，阳性对照为阳性质粒标准品，阴性对照为ddH2O。
实施例8：
本实施例涉及的鲤疱疹病毒II型实时荧光PCR检测方法包括以下步骤：
1）根据CyHV-2 ORF6和ORF24基因序列（登录号：JQ815364.1）用软件（Primer Express 3.0）设计并合成基因特异性引物及Taqman探针，如下所示：
上游引物F：5ˊ- CTGGGTACTGTCTGTCCATGTTG -3ˊ；
下游引物R：5ˊ- CAAAACGGGCTGGCAGTCT-3ˊ；
探针P：5ˊFAM- TTG TAC CAG CAC TCG CCA ATG AGC A -BHQ 3ˊ。
2）用磁珠法病毒DNA/RNA提取试剂盒提取病毒样品中CyHV-2病毒的DNA，并置于-50℃的温度下保存备用。
3）进行实时荧光PCR扩增检测，扩增片段为83bp，扩增体系为25μL，扩增反应条件包括：95℃ 2 min；95℃ 8s、56℃ 35s、72℃ 25s，循环42次；检测设立阳性对照和阴性对照，阳性对照为阳性质粒标准品，阴性对照为ddH2O。
实施例9：
本实施例涉及的鲤疱疹病毒II型实时荧光PCR检测方法包括以下步骤：
1）根据CyHV-2 ORF6和ORF24基因序列（登录号：JQ815364.1）用软件（Primer Express 3.0）设计并合成基因特异性引物及Taqman探针，如下所示：
上游引物F：5ˊ- CTGGGTACTGTCTGTCCATGTTG -3ˊ；
下游引物R：5ˊ- CAAAACGGGCTGGCAGTCT-3ˊ；
探针P：5ˊFAM- TTG TAC CAG CAC TCG CCA ATG AGC A -BHQ 3ˊ。
2）用磁珠法病毒DNA/RNA提取试剂盒提取病毒样品中CyHV-2病毒的DNA，并置于-60℃的温度下保存备用。
3）进行实时荧光PCR扩增检测，扩增片段为83bp，扩增体系为22μL，扩增反应条件包括：95℃ 3 min；95℃ 10 s、56℃ 40 s、72℃ 30 s，循环40次；检测设立阳性对照和阴性对照，阳性对照为阳性质粒标准品，阴性对照为ddH2O。
实施例10：
本实施例涉及的鲤疱疹病毒II型实时荧光PCR检测方法包括以下步骤：
1）根据CyHV-2 ORF6和ORF24基因序列（登录号：JQ815364.1）用软件（Primer Express 3.0）设计并合成基因特异性引物及Taqman探针，如下所示：
上游引物F：5ˊ- CTGGGTACTGTCTGTCCATGTTG -3ˊ；
下游引物R：5ˊ- CAAAACGGGCTGGCAGTCT-3ˊ；
探针P：5ˊFAM- TTG TAC CAG CAC TCG CCA ATG AGC A -BHQ 3ˊ。
2）用磁珠法病毒DNA/RNA提取试剂盒提取病毒样品中CyHV-2病毒的DNA，并置于-20℃的温度下保存备用。
3）进行实时荧光PCR扩增检测，扩增片段为83bp，扩增体系为25μL，扩增反应条件包括：95℃ 3 min；95℃ 15s、56℃ 35s、72℃ 30 s，循环35次；检测设立阳性对照和阴性对照，阳性对照为阳性质粒标准品，阴性对照为ddH2O。
在上述实施例5～10中，待实时荧光PCR扩增反应结束后，利用荧光PCR仪器的分析软件，依据Ct值和扩增动力学曲线进行分析测定：
（Ⅰ）TaqMan荧光定量PCR的反应条件，采用2×Premix Ex Taq(Probe qPCR)试剂推荐的25 μL体系，以相同浓度的阳性质粒为模板，选用不同浓度的引物和探针，通过矩阵法对引物和探针的最佳浓度进行优化，同时优化最佳退火温度，获得反应的最低Ct值和最高荧光强度增加值(△Rn)，为提高反应扩增效率与敏感度，增设NTC（空白）对照。
（Ⅱ）TaqMan荧光PCR的标准曲线，以10倍连续梯度稀释(10-3~10-9)的阳性标准品为模板，以（1）中的反应条件进行TaqMan荧光定量PCR，以模板浓度(拷贝数/μL)为横坐标，以Ct值为纵坐标绘制标准曲线。
（Ⅲ）TaqMan荧光定量PCR检测方法的评价：
敏感性试验：将常规PCR与10倍连续梯度稀释好的阳性标准品分别进行TaqMan荧光定量PCR，方法参照（Ⅰ），比较两种检测方法的敏感性。
特异性试验：用（Ⅰ）中建立的TaqMan荧光定量PCR方法分别检测CyHV-2、ISAV、IHNV、KHV和SVCV，评价建立的TaqMan荧光定量PCR的特异性，。
重复性试验：批间重复性试验：分别选取4个稀释度的阳性标准品为模板，同一反应条件下进行3次独立的TaqMan荧光定量PCR试验，每次试验间隔7天；批内重复性试验：分别选取5个稀释度的阳性标准品为模板，每个稀释度设3个重复，同一条件下进行TaqMan荧光定量PCR试验。
（Ⅳ）临床样品的检测，利用上述实施例涉及的方法分别对江苏大丰地区某鱼塘采集的异育银鲫样品进行检测，同时设立阴阳性对照。
以实施例7为例，对该实施例中TaqMan荧光定量PCR反应条件进行优化，如下所示：
荧光 PCR反应条件优化选用终浓度为 0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 μmol/L 的引物（上游引物F、下游引物R）浓度和0.4，0.6 μmol/L 的探针P浓度，采用矩阵法检测筛选引物和探针P的最佳反应浓度。试验结果表明，采用 0.4μmol/L的引物和 0.6 μmol/L 的探针终浓度，检测获得的 Ct值最小、荧光扩增曲线最典型而△Rn 值较大，从而确定其为最佳引物和探针浓度，如图1所示。优化后的反应程序： 95 ℃ 1 min；95℃ 5 s，58 ℃ 30 s，45个循环，在退火阶段收集荧光信号，如图2所示。
图1中，1. c（引物）= 0.4 μmol/L，c（探针）= 0.6 μmol/L；2. c（引物）= 0.4 μmol/L，c（探针）=0.4 μmol/L；3. c（引物）= 0.6 μmol/L，c（探针）=0.6 μmol/L；4. c（引物）= 0.6 μmol/L，c（探针）= 0.4 μmol/L；5. c（引物）= 0.8 μmol/L，c（探针）= 0.6 μmol/L；6. c（引物）= 0.8 μmol/L， c（探针）= 0.4 μmol/L；7. c（引物）= 1.0 μmol/L，c（探针）= 0.4 μmol/L；8. c（引物）= 1.0 μmol/L，c（探针）=0.6 μmol/L；9. c（引物）= 0.2 μmol/L， c（探针）= 0.6 μmol/L；8. c（引物）= 0.2 μmol/L，c（探针）=0.4 μmol/L。
图2中，1：58.2℃；2：56.6℃；3：60.1℃；4：55℃；5：61.7℃；6：60.1℃；7：63℃；8：62.6℃；9：NTC。
该实施例中，基因片段的扩增及重组质粒标准品的制备情况如下：采用荧光定量PCR的上游引物F、下游引物R进行常规PCR，得到大约83 bp的目的片段，如图3所示，构建的重组质粒标准品核苷酸测序结果经BLAST比对，显示其插入的基因片段与参考片段同源性达100%，说明成功构建了阳性标准品。标准品经implen超微量分光光度计测浓度，换算成拷贝数为3.77×1011拷贝/μL。
图3中，1：无模板对照；2：PCR产物；M：DL 2000 DNA Marker，1: NTC； 2:PCR product；M:DL 2000 DNA Marker。
该实施例中，TaqMan荧光定量PCR的反应条件：优化后的TaqMan荧光定量PCR反应体系（25 μL）：2×Premix Ex Taq(Probe qPCR) 12.5 μL，上下游引物（10 μmol/L）各1.0 μL，探针（10 μmol/L）1.5 μL，质粒标准品2 μL，补水至终体积25 μL。优化后的反应条件：95 ℃ 1 min；95 ℃ 5 s，58 ℃ 30 s，45个循环。
该实施例中，TaqMan荧光定量PCR的标准曲线制作：以10倍连续梯度稀释(10-3~10-9)的阳性标准品为模板进行TaqMan荧光定量PCR，得到检测异育银鲫疱疹病毒2型的标准曲线，如图4所示。结果显示TaqMan荧光定量PCR在3.77×108拷贝/μL~3.77×102拷贝/μL范围内，扩增效率为96%，标准曲线的线性回归方程为y=-2.931x+1.542，r 2=0.995，具有良好的线性关系。
对该实施例中TaqMan荧光定量PCR检测方法进行评价：
敏感性试验：将10倍连续梯度稀释好的阳性标准品，3.77×108拷贝/μL~3.77×102拷贝/μL进行TaqMan荧光定量PCR，3.77×108拷贝/μL~3.77×102拷贝/μL进行常规PCR，结果见图5，TaqMan荧光定量PCR检测的最低灵敏度37.7拷贝/μL，常规PCR检测的最低灵敏度3.77×103拷贝/μL。TaqMan荧光定量PCR的灵敏度是常规PCR的100倍。
图5中，A：CyHV-2 TaqMan荧光定量PCR；B：常规PCR；1~7：标准品的基因拷贝数分别为，3.77×108拷贝/μL~3.77×102拷贝/μL；8：阴性对照。A：CyHV-2 TaqMan fluorescent quantitative PCR；B：PCR；1~7：The plasmid concentrations of 1~7 were 3.77×107copies/μL~3.77×10 copies /μL； 8:Negative control。
特异性试验：分别检测CyHV-2、ISAV、IHNV、KHV和SVCV，共5种病毒，结果显示，只有检测CyHV-2时出现扩增曲线，如图6所示。
重复性试验：取37.7/4拷贝/μL~3.77×106拷贝/μL之间梯度稀释的标准品质粒，分别进行3次批内及批间重复性试验，结果见表1和表2，批内及批间的变异系数（CV）均小于1%。
表1批内重复性试验
表2批间重复性试验
对临床样品的检测：利用本实施例的方法和PCR方法分别对32份异育银鲫样品进行检测，其中荧光定量PCR检测时，样品的Ct值大于其敏感度试验中最大的Ct值时视为检测阴性。PCR检出阳性样品28份，TaqMan荧光定量PCR检出阳性样品32份， PCR检出的阳性样品用荧光定量PCR检测时均为阳性，具体检测结果见表3。
表3分别用TaqMan荧光定量PCR和PCR对临床病料进行检测
综上所述，本发明建立的荧光定量PCR方法灵敏度高，特异性强，能快速检测到极低含量的病毒，为病毒检测和定量提供了一种切实可行的方法。与已报道的方法相比，该方法不仅简单、快速，而且准确、灵敏、检出限低。该方法能快速、准确测定患病鱼体组织中的病毒含量。方法所用试剂简单、微量，设备简单，操作简便、快速。
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<211> 23
<212> DNA
<213> 上游引物
<400> 1
ctgggtactg tctgtccatg ttg 23
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 下游引物
<400> 2
caaaacgggc tggcagtct 19
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 探针
<400> 3
ttgtaccagc actcgccaat gagca 25
<210> 4
<211> 83
<212> DNA
<213> 鲤疱疹病毒II型基因片段
<400> 4
caaaacgggc tggcagtctc ccatgctcat tggcgagtgc tggtacaagt ggagggcctg 60
caacatggac agacagtacc cag 83

Claims (4)

1.一种鲤疱疹病毒II型实时荧光PCR检测方法，其特征在于：包括提取病毒样品中CyHV-2病毒的DNA，进行实时荧光PCR扩增检测，其中，上游引物F：5ˊ- CTGGGTACTGTCTGTCCATGTTG -3ˊ，下游引物R：5ˊ- CAAAACGGGCTGGCAGTCT-3ˊ，探针P：5ˊFAM- TTG TAC CAG CAC TCG CCA ATG AGC A -BHQ 3ˊ。
2.根据权利要求1所述的一种鲤疱疹病毒II型实时荧光PCR检测方法，其特征在于：用磁珠法病毒DNA/RNA提取试剂盒提取所述病毒样品中CyHV-2病毒的DNA，并置于-80～-20℃的温度下保存备用。
3.根据权利要求1所述的一种鲤疱疹病毒II型实时荧光PCR检测方法，其特征在于：在所述实时荧光PCR扩增检测中，扩增片段为83bp，扩增体系为20～50μL。
4.根据权利要求1所述的一种鲤疱疹病毒II型实时荧光PCR检测方法，其特征在于：所述实时荧光PCR的扩增反应条件包括：94～95℃ 1～3min，95 ℃ 5～15 s、56～58℃ 30～40 s、72℃ 20～30 s，循环35～45次，检测设立阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为阳性质粒标准品。
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