CN111996263A - 基于Taqman-MGB实时荧光PCR技术的亚洲型舞毒蛾检测方法及其引物和探针 - Google Patents

基于Taqman-MGB实时荧光PCR技术的亚洲型舞毒蛾检测方法及其引物和探针 Download PDF

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Abstract

基于Taqman‑MGB实时荧光PCR技术的亚洲型舞毒蛾检测方法及其引物和探针，属于林业和植物检疫技术领域。本发明引物包括上游引物LDND2‑F，下游引物LDND2‑R，LDND2‑F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1，LDND2‑R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2。探针为LDP，LDP的核苷酸序列如SEQ ID NO.3。本发明可快速准确实现舞毒蛾包括毒蛾属其他昆虫卵块、幼虫等的鉴定，避免形态鉴定可能产生的混淆。与常规的TaqMan荧光PCR相比，荧光光谱分辨率和探针杂交的稳定性更高；与基于普通PCR技术的舞毒蛾快速鉴定方法相比，检测时间缩短，可以在5小时内完成检测。

Description

基于Taqman-MGB实时荧光PCR技术的亚洲型舞毒蛾检测方法 及其引物和探针
技术领域
本发明属于林业和植物检疫技术领域，具体涉及基于Taqman-MGB实时荧光PCR技术的亚洲型舞毒蛾检测方法及其引物和探针。
背景技术
舞毒蛾隶属鳞翅目Lepidoptera裳蛾科Erebidae毒蛾亚科Lymantriinae毒蛾族Lymantriini毒蛾属Lymantria，是我国口岸进出境检验检疫中的重要检疫害虫。毒蛾属包括多种昆虫，舞毒蛾、木毒蛾、栎毒蛾、枫毒蛾、雪松毒蛾等形态相近，尤其是幼虫形态。
现有针对舞毒蛾的检验方案即使用定量PCR技术对亚洲型舞毒蛾、欧洲型舞毒蛾、北美型舞毒蛾进行区分（公开号CN102534024A、CN102534025A）。只针对舞毒蛾类群进行鉴定，舞毒蛾同一属的其他毒蛾比如木毒蛾、栎毒蛾、雪松毒蛾等在外形非常相似，在进出境检验检疫中经常出现混淆，但目前尚无针对舞毒蛾与毒蛾属其他昆虫的实时荧光定量PCR检测方法。
发明内容
针对上述现有技术中存在的问题，本发明的目的在于设计提供基于Taqman-MGB实时荧光PCR技术的亚洲型舞毒蛾检测方法及其引物和探针。
本发明利用Taqman-MGB实时荧光定量PCR技术，基于舞毒蛾mtDNA部分基因设计特异性引物和探针，有效区分舞毒蛾与毒蛾属其他昆虫。
为了实现上述目的，采用以下技术方案：
基于Taqman-MGB实时荧光PCR技术的检测用引物，其特征在于所述引物包括上游引物LDND2-F，下游引物LDND2-R，LDND2-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1，LDND2-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2。
所述的引物在采用Taqman-MGB实时荧光PCR技术检测舞毒蛾中的应用。
基于Taqman-MGB实时荧光PCR技术的检测用探针，其特征在于所述探针为LDP，LDP的核苷酸序列如SEQ ID NO.3。
所述的探针在采用Taqman-MGB实时荧光PCR技术检测舞毒蛾中的应用。
基于Taqman-MGB实时荧光PCR技术的亚洲型舞毒蛾检测方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）对不同地理种群的舞毒娥成虫的足进行DNA提取，对其中mtDNA部分基因的序列进行测序分析，选择突变率高的序列片段作为扩增的目的片段；
（2）设计特异性引物和探针，上游引物为LDND2-F，下游引物为LDND2-R，LDND2-F/LDND2-R的扩增产物长度为71bp，特异性探针为LDP，该探针的5’端以FAM报告荧光基团标记，3’端以MGB淬灭基团标记；
（3）进行实时荧光PCR扩增检测；
（4）建立标准曲线，以步骤（1）得到的DNA为标准品，进行10倍递减梯度稀释成5个浓度，每一浓度取2μL作为模板进行实时荧光定量PCR检测，以不同浓度的靶标DNA片段拷贝数的对数值作为横坐标，DNA相应的临界循环次数C t 值作为纵坐标，绘制标准曲线以进行相关性分析，用于舞毒蛾的定量快速检测分析。
所述的基于Taqman-MGB实时荧光PCR技术的亚洲型舞毒蛾检测方法，其特征在于所述步骤（3）和（4）中PCR扩增体系为20μL：2×TaqMan probe Real-time PCR MasterMixture 6μL，10μM上下游引物分别0.5μL，DNA模板2μL，10PM 的探针LDP0.8μL，加ddH2O至20μL。
所述的基于Taqman-MGB实时荧光PCR技术的亚洲型舞毒蛾检测方法，其特征在于所述步骤（3）和（4）中PCR扩增反应程序为：预变性95℃10min；然后95℃ 30sec，63℃ 30sec循环40次。
所述的基于Taqman-MGB实时荧光PCR技术的亚洲型舞毒蛾检测方法，其特征在于所述步骤（4）中标准曲线关系式为Y=-2.85x+36.705，R 2=0.9965。
本发明利用Taqman-MGB实时荧光定量PCR技术，基于舞毒蛾mtDNA部分基因，设计特异性引物和探针，有效区分舞毒蛾与毒蛾属其他昆虫。可快速准确实现舞毒蛾包括毒蛾属其他昆虫卵块、幼虫等的鉴定，避免形态鉴定可能产生的混淆。与常规的TaqMan荧光PCR相比，荧光光谱分辨率和探针杂交的稳定性更高；与基于普通PCR技术的舞毒蛾快速鉴定方法相比，检测时间缩短，可以在5小时内完成检测。
附图说明
图1为引物LDND2-F/LDND2-R和探针LDP在亚洲型舞毒蛾上的位置示意图；
图2为舞毒蛾靶标DNA片段标准曲线；
图3为荧光引物和探针的种特异性检验。
具体实施方式
以下将通过附图和实施例对本发明作进一步说明。
实施例1：Taqman-MGB实时荧光PCR技术的亚洲型舞毒蛾检测方法
依据目前研究成果，舞毒蛾在我国不同地区出现了种群分化，为保证所设计引物的覆盖性，我们选择了黑龙江（LD-HLJ）、内蒙（LD-NM）、吉林(LD-JL)、沈阳(LD-SY)、河北(LD-HB)、连云港(LD-LYG)六个舞毒蛾种群以及木毒蛾(LX)、栎毒蛾(LM)、枫毒蛾(LSI)、雪松毒蛾(LSU)，基于舞毒蛾线粒体基因组的部分基因序列使用primer5设计引物LDND2-F/LDND2-R后，再根据扩增出来的特异性片段使用Primer Exprss设计探针LDP，可特异性扩增舞毒蛾种群，引物和探针均由杭州擎科生物公司合成。
（1）DNA提取：使用以上十种毒蛾成虫的足进行DNA提取，提取DNA采用德国QIAGEN公司的DNeasy®Tissue Kit提取试剂盒。
目标序列选取：对舞毒蛾不同对地理种群的mtDNA中部分基因的序列进行分析，选择突变率较高的序列片段作为扩增的目的片段。
（2）特异性引物和探针设计。针对所做类群，设计上游引物为LDND2-F:5’-TGGAGCAGGAACAGGATGAAC-3’,下游引物为LDND2-R:5’-CAACAGATCTACCTCCATGAGCA-3’，LDND2-F/ LDND2-R的扩增产物长度为71bp；特异性探针为LDP：5’-ACCCTCCTCTATCTTC-3’，探针的5’端以FAM报告荧光基团标记，3’端以MGB淬灭基团标记。引物LDND2-F/LDND2-R和探针LDP在亚洲型舞毒蛾上的位置如图1所示。LDND2-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1，LDND2-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2，探针LDP的核苷酸序列如SEQ ID NO.3。
（3）实时荧光PCR检测：实时荧光定量PCR扩增体系为20μL：2×TaqMan probeReal-time PCR Master Mixture 6μL (大连宝生物公司 Takara Premix Ex Tag)，上下游引物（10μM）分别0.5μL，DNA模板2μL，TaqMan探针（10PM）0.8μL，加ddH2O至20μL。实时荧光PCR扩增在7500Real-Time PCR System定量PCR扩增仪上进行。打开“7500 FastSystemSoftware”，设置PCR反应条件，两步法扩增反应程序:预变性95℃10min；然后95℃30sec,63℃ 30sec循环40次。点击运行，进行PCR反应，1.5h左右反应结束，保存文件，打开分析软件。
（4）标准曲线建立。以舞毒蛾质粒DNA为标准品，进行10倍递减梯度稀释成5个浓度，每一浓度取2μL作为模板进行实时荧光定量PCR检测。以不同浓度的靶标DNA片段拷贝数的对数值作为横坐标，DNA相应的临界循环次数（C t 值）作为纵坐标，绘制标准曲线以进行相关性分析。分析结果显示，目标DNA片段的拷贝数与C t 值显著相关，其关系式为Y=-2.85x+36.705（R 2=0.9965）（如图2所示），可用于舞毒蛾的定量快速检测分析。
实施例2：本发明荧光引物和探针的种特异性检验
以毒蛾DNA为模板，质粒DNA为阳性对照、ddH2O为阴性对照，进行qPCR检测，每种毒蛾设六个重复。结果显示舞毒蛾的六种地理种群均发出明显的荧光信号（如图3），C t 值在16至18之间，而其余毒蛾的C t 值在30至36之间，差别较大，此检测体系可用于舞毒蛾的检测鉴定分析。图3中：数字1-2：质粒DNA；3-38：样品编号为LD-HLJ、LD-NM、LD-JL、LD-SY、LD-HB和LD-LYG的亚洲型舞毒蛾样品；39-62：样品编号为LX、LM、LSI和LSU。
实施例3：本发明荧光引物和探针的灵敏性检测
将舞毒蛾DNA按照10倍递减梯度稀释，从初始DNA浓度为14ng/μL开始稀释至1.4×10-8 ng/μL，以这些DNA作为模板，质粒DNA为阳性对照，ddH2O为阴性对照，进行qPCR检测，每个浓度的DNA重复三次。结果如表1所示，这些数据表明本项研究建立的舞毒蛾定量检测体系具有较高的灵敏性。
表1 舞毒蛾荧光定量检测体系所用荧光引物和探针的灵敏性检测
Figure DEST_PATH_IMAGE001
实施例4：本发明荧光引物和探针的重复性与稳定性测定
以浓度分别为3.2×1010、3.2×109、3.2×108、3.2×107、3.2×106（拷贝数/μL）的质粒DNA为模板进行重复性和稳定性检测，结果如表2所示，5种浓度质粒的Ct值的变异系数分别为3.2%、1.1%、2.8%、1.2%、0.6%，均低于5%。这些数据表明本项研究建立的舞毒蛾定量检测体系具有良好的稳定性和重复性。
表2 舞毒蛾定量检测体系的重复性与稳定性检测
Figure 427456DEST_PATH_IMAGE002
序列表
<110> 浙江省检验检疫科学技术研究院
佛山海关综合技术中心（佛山国际旅行卫生保健中心、佛山海关口岸门诊部）
<120> 基于Taqman-MGB实时荧光PCR技术的亚洲型舞毒蛾检测方法及其引物和探针
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 上游引物LDND2-F(upstream primer LDND2-F)
<400> 1
tggagcagga acaggatgaa c 21
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 下游引物LDND2-R(downstream primer LDND2-R)
<400> 2
caacagatct acctccatga gca 23
<210> 3
<211> 16
<212> DNA
<213> 探针LDP(Probe the LDP)
<400> 3
accctcctct atcttc 16

Claims (8)

1. 基于Taqman-MGB实时荧光PCR技术的检测用引物，其特征在于所述引物包括上游引物LDND2-F，下游引物LDND2-R，LDND2-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1，LDND2-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2。
2.如权利要求1所述的引物在采用Taqman-MGB实时荧光PCR技术检测舞毒蛾中的应用。
3. 基于Taqman-MGB实时荧光PCR技术的检测用探针，其特征在于所述探针为LDP，LDP的核苷酸序列如SEQ ID NO.3。
4.如权利要求3所述的探针在采用Taqman-MGB实时荧光PCR技术检测舞毒蛾中的应用。
5.基于Taqman-MGB实时荧光PCR技术的亚洲型舞毒蛾检测方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）对不同地理种群的舞毒娥成虫的足进行DNA提取，对其中mtDNA部分基因的序列进行测序分析，选择突变率高的序列片段作为扩增的目的片段；
（2）设计特异性引物和探针，上游引物为LDND2-F，下游引物为LDND2-R，LDND2-F/LDND2-R的扩增产物长度为71bp，特异性探针为LDP，该探针的5’端以FAM报告荧光基团标记，3’端以MGB淬灭基团标记；
（3）进行实时荧光PCR扩增检测；
（4）建立标准曲线，以步骤（1）得到的DNA为标准品，进行10倍递减梯度稀释成5个浓度，每一浓度取2μL作为模板进行实时荧光定量PCR检测，以不同浓度的靶标DNA片段拷贝数的对数值作为横坐标，DNA相应的临界循环次数C t 值作为纵坐标，绘制标准曲线以进行相关性分析，用于舞毒蛾的定量快速检测分析。
6. 如权利要求5所述的基于Taqman-MGB实时荧光PCR技术的亚洲型舞毒蛾检测方法，其特征在于所述步骤（3）和（4）中PCR扩增体系为20μL：2×TaqMan probe Real-time PCRMaster Mixture 6μL，10μM上下游引物分别0.5μL，DNA模板2μL，10PM 的探针LDP0.8μL，加ddH2O至20μL。
7. 如权利要求5所述的基于Taqman-MGB实时荧光PCR技术的亚洲型舞毒蛾检测方法，其特征在于所述步骤（3）和（4）中PCR扩增反应程序为：预变性95℃10min；然后95℃ 30sec，63℃ 30sec循环40次。
8.如权利要求5所述的基于Taqman-MGB实时荧光PCR技术的亚洲型舞毒蛾检测方法，其特征在于所述步骤（4）中标准曲线关系式为Y=-2.85x+36.705，R 2=0.9965。
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