CN107365767A - 一种从酱油中提取dna的方法 - Google Patents

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束文圣
张传伦
李猛
徐卓菲
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor

Abstract

本发明公开了一种从酱油中提取DNA的方法，包括加入乙醇沉淀多糖和DNA并除去其它杂质，再加入CTAB沉淀糖类物质，最后得到纯净的DNA。本发明提取方法专门针对深加工食品酱油设计，与传统提取方法相比具有提取效率高、纯度高等优点，可用于下游QPCR等实验，具有一定的应用前景。

Description

一种从酱油中提取DNA的方法
技术领域
本发明属于DNA分离技术领域，更具体地说，涉及一种从酱油中提取DNA 的方法。
背景技术
原料酱油是以大豆、小麦等为原料，经过微生物天然发酵而形成的。市场上的酱油在原料酱油的基础上，加入甜味剂、色素、增稠剂、鲜味剂等添加物后经过工艺加工而成。
目前，食品安全备受国际关注，像酱油一样的深加工食品在检测方面很难鉴定是否添加了违法的转基因食品原料。在转基因方面，先通过提取出酱油里面所含有的DNA，通过实时荧光定量PCR检测是否含有转基因原料，但酱油在深加工过程中把DNA严重的打断，加入大量焦糖色素以及其他添加剂，导致 DNA提取不出，进而无法满足荧光定量PCR的检测的要求，传统的手工法提取以及试剂盒都不足以真正满足对酱油DNA提取鉴定的要求。
发明内容
本发明的目的在于：克服现有DNA提取方法不适用于酱油中的DNA提取的问题，提供一种能有效提取酱油里面含有的植物DNA的方法。
为了实现上述发明目的，本发明提供一种从酱油中提取DNA的方法，其包括如下步骤：
(1)在酱油样品中加入其1～3倍体积的无水乙醇，置于-20℃下沉淀，然后离心弃上清，所得沉淀备用；
(2)在步骤(1)所得沉淀中加入CTAB提取缓冲液，水浴、离心，取上清；
(3)在步骤(2)所得上清中加入等体积的体积比为24:1的氯仿：异戊醇，混匀后离心、取上清，再加入等体积的体积比为24:1的氯仿：异戊醇抽提，得到的上清备用；
(4)在步骤(3)所得上清中加入2倍体积的溴代十六烷基三甲胺沉淀液，静置后离心弃上清，所得沉淀备用；
(5)在步骤(4)所得沉淀中加入NaCl溶液溶解沉淀，静置后加入等体积的体积比为24:1的氯仿：异戊醇混合、离心，取上清；
(6)在步骤(5)所得上清中加入1/10体积的醋酸钠和等体积的异丙醇混合、静置、离心弃上清，所得沉淀备用；
(7)用乙醇洗涤步骤(6)所得沉淀，除去残留的乙醇后干燥沉淀，得到 DNA。
本发明在高离子强度的溶液中，利用CTAB能与多糖和蛋白质结合形成复合物从而沉淀下来，能与溶液中的DNA分离的特点，然后加入氯化钠可提供一个高盐环境，使DNA更容易分离出来。
作为本发明从酱油中提取DNA的方法的一种优选技术方案，步骤(1)中，所述无水乙醇的加入量为酱油样品的3倍体积；所述沉淀的时间为30min；所述离心的条件为12000rpm，10min。
作为本发明从酱油中提取DNA的方法的一种优选技术方案，步骤(2)中，所述CTAB提取缓冲液预先经65℃预热，所述水浴为65℃水浴1h；所述离心的条件为12000rpm，12min。
作为本发明从酱油中提取DNA的方法的一种优选技术方案，步骤(3)中，所述离心的条件为12000rpm，10min。
作为本发明从酱油中提取DNA的方法的一种优选技术方案，步骤(4)中，所述静置为室温静置1h，所述离心的条件为12000rpm，10min。
作为本发明从酱油中提取DNA的方法的一种优选技术方案，步骤(5)中，所述NaCl溶液的浓度为1.2mol/L，所述静置为室温静置5min，所述离心的条件为12000rpm，10min。
作为本发明从酱油中提取DNA的方法的一种优选技术方案，步骤(6)中，所述静置是4℃下静置过夜，所述离心的条件为12000rpm，15min。
作为本发明从酱油中提取DNA的方法的一种优选技术方案，步骤(7)中，所述乙醇为70％乙醇。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
由于酱油中的DNA大都已经被片段化，常规的加入tris盐酸再用三氯甲烷抽提并不适用酱油的DNA提取。三氯甲烷只能萃取大部分盐酸，并不能完全除去盐酸，因此会引入盐酸杂质，使提取得到的DNA不纯净。另外由于加入盐酸会使溶液pH值下降，不利于DNA在有机溶剂中的抽提分离，导致提取得到的 DNA量少且不纯净。本发明提取方法是专门针对深加工食品酱油设计的，通过加入无水乙醇沉淀多糖以及DNA，除去其它杂质，再加入CTAB沉淀糖类物质，最终得到纯净的DNA。本发明方法无需使用tris盐酸和三氯甲烷，避免引入杂质，还可得到更多的DNA，优于现有技术。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式，对本发明及有益效果进行详细说明。
图1是本发明方法与现有技术和试剂盒方法提取酱油DNA的结果，其中，1和2为本发明方法提取的DNA，3为试剂盒法提取的DNA，4为现有技术手提法提取的DNA。
具体实施方式
为了使本发明的发明目的、技术方案和有益技术效果更加清晰，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的实施例仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明，实施例的配方、比例等可因地制宜做出选择而对结果并无实质性影响。
实施例1
1.取酱油样品10mL，用3倍酱油样品体积的无水乙醇，放置在-20℃沉淀30分钟，12000rpm离心10min，弃上清，取沉淀。
2.加入20mL经65℃预热的CTAB提取缓冲液，混匀，65℃水浴1小时，期间每隔10分钟上下颠倒混匀一次，12000rpm离心12分钟，取上清。
3.加入等体积的体积比为24∶1的氯仿∶异戊醇，缓慢颠倒摇匀5分钟， 12000rpm，离心10分钟，取上清，再加入等体积24∶1的氯仿∶异戊醇抽提一次，取上清。
4.加入2倍体积的溴代十六烷基三甲胺沉淀液，摇匀，室温静置1小时， 12000rpm离心10分钟，弃上清，留沉淀
5.沉淀加入1.2mol/LNaCl溶液1mL，溶解沉淀，室温静置5分钟，加入等体积24∶1的氯仿∶异戊醇，颠倒摇匀1分钟，12000rpm离心10分钟，取上清
6.加入所取上清液1/10体积的3mol/L醋酸钠和等体积的4℃预冷异丙醇，缓慢混匀，4℃静置过夜，12000rpm离心15分钟，弃上清，留沉淀
7.用70％乙醇洗涤沉淀，除去残留的乙醇，干燥沉淀，得到DNA沉淀。
对比例1
采用天根的深加工食品DNA提取试剂盒，严格按照试剂盒说明书操作提取 DNA。
对比例2
普通提取方法提取酱油DNA，参考：《食品科学》2009,30(22):240-243 《酱油、烤鳗酱油DNA提取及原料成分的荧光PCR检测》。
实施例1、对比例1和对比例2提取得到的DNA的电泳结果如图1所示。由图1可以看出，本发明方法能收集到较为完整且收集的DNA量较多，能满足后续的QPCR以及其他的分析实验，试剂盒法和普通的方法存在着一定的不稳定性和差异性，并不能完全的收集酱油中的比较完整的DNA片段。
上列详细说明是针对本发明之一可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明所为的等效实施或变更，均应包含于本案的专利范围中。

Claims (8)

1.一种从酱油中提取DNA的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)在酱油样品中加入其1～3倍体积的无水乙醇，置于-20℃下沉淀，然后离心弃上清，所得沉淀备用；
(2)在步骤(1)所得沉淀中加入CTAB提取缓冲液，水浴、离心，取上清；
(3)在步骤(2)所得上清中加入等体积的体积比为24:1的氯仿：异戊醇，混匀后离心、取上清，再加入等体积的体积比为24:1的氯仿：异戊醇抽提，得到的上清备用；
(4)在步骤(3)所得上清中加入2倍体积的溴代十六烷基三甲胺沉淀液，静置后离心弃上清，所得沉淀备用；
(5)在步骤(4)所得沉淀中加入NaCl溶液溶解沉淀，静置后加入等体积的体积比为24:1的氯仿：异戊醇混合、离心，取上清；
(6)在步骤(5)所得上清中加入1/10体积的醋酸钠和等体积的异丙醇混合、静置、离心弃上清，所得沉淀备用；
(7)用乙醇洗涤步骤(6)所得沉淀，除去残留的乙醇后干燥沉淀，得到DNA。
2.根据权利要求1所述从酱油中提取DNA的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述无水乙醇的加入量为酱油样品的3倍体积；所述沉淀的时间为30min；所述离心的条件为12000rpm，10min。
3.根据权利要求1所述从酱油中提取DNA的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述CTAB提取缓冲液预先经65℃预热，所述水浴为65℃水浴1h；所述离心的条件为12000rpm，12min。
4.根据权利要求1所述从酱油中提取DNA的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述离心的条件为12000rpm，10min。
5.根据权利要求1所述从酱油中提取DNA的方法，其特征在于，步骤(4)中，所述静置为室温静置1h，所述离心的条件为12000rpm，10min。
6.根据权利要求1所述从酱油中提取DNA的方法，其特征在于，步骤(5)中，所述NaCl溶液的浓度为1.2mol/L，所述静置为室温静置5min，所述离心的条件为12000rpm，10min。
7.根据权利要求1所述从酱油中提取DNA的方法，其特征在于，步骤(6)中，所述静置是4℃下静置过夜，所述离心的条件为12000rpm，15min。
8.根据权利要求1所述从酱油中提取DNA的方法，其特征在于，步骤(7)中，所述乙醇为70％乙醇。
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