CN1597981A - 从番茄酱中提取用于转基因成分检测的dna的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明的内容是从番茄酱中提取DNA，用于转基因成分的检测。与常规方法相比，本方法的特点是：在DNA提取过程中增加了样品的预处理过程，从而使番茄酱沉淀物的pH值能满足后续提取过程的要求；通过增加三氯甲烷+异戊醇抽提的次数和溴代十六烷基三甲胺沉淀的时间，有效地去除蛋白质和多糖等杂质；将所提取的DNA溶解在30μL体积的去离子水中，取15μL用作一次PCR反应，以增加反应体系中DNA模板的浓度。此方法快速、简便、特异性强，效率高，适合番茄酱等深度加工食品中转基因成分的定性检测。
Description
技术领域
本方法涉及深度加工食品中转基因成分的检测技术，尤其是从番茄酱中提取用于转基因成分检测的模板DNA的方法。
背景技术
随着基因工程技术的快速发展，大量以转基因作物为加工原料的转基因食品进入商品化生产和销售，据国际权威机构统计，全球由转基因作物加工生产的转基因食品和食品成分达4000余种(参见：U.S.Food and Drug Administration，Office of Food Additive Safety.Listof Completed Consultations on Bioengineering Food[DB/OL].http：//www.fda-cfsan/biotechnology.2002-10.)。目前对转基因食品的安全性尚有争议。
转基因食品的潜在的风险引起世界各国政府极大关注，因此纷纷出台转基因食品的标签管理制度和出入境产品报告制度。联合国和欧盟的要求更为严格，规定转基因食品从研究、生产、运输、贮存、销售到进出口等所有环节都需要检测监控，因此转基因产品的检测鉴定成为各主要贸易国检验的一项重要工作，并建立相关的标准化检测体系，以适应于各种转基因食品的检测(参见：朱光富，世界各国对转基因食品的态度和管理，粮油食品科技，2001，3：1-5)。
使用PCR方法检测深加工食品中的转基因成分，所面临的最大挑战是如何有效地从众多深度加工产品中提取到用作PCR反应模板的DNA成分，其DNA提取的难度不仅在于加工过程中DNA遭到严重破坏，而且加工过程中产生的物理、化学或生物等因子还会影响到DNA质量。不同的加工程序产生的各类不同的深加工制品，其DNA的降解程度和产品中DNA的残余量大不相同，因此开发针对不同产品转基因检测的模板DNA提取技术，是深加工食品转基因成分检测的关键。
发明内容
本方法旨在建立从以转基因番茄加工而成的番茄酱中提取模板DNA，用于转基因成分的PCR检测。
本发明的目的是克服现有技术中的不足，提供一种从番茄酱中提取用于转基因成分检测的DNA的方法，它可以快速、简便、可靠、高效率地从番茄酱类深加工食品中将模板DNA提取出来，用于转基因成分的定性检测，以确保检测的可靠性。
本方法针对番茄酱的pH值较低(2.0-3.0)的特点，在正式进行DNA提取之前，必须将沉淀下来的番茄酱的pH值提高到近中性。为此在加入样品的预处理过程中，利用0.1mol/L Tris(pH8.0)缓冲溶液反复洗涤番茄酱沉淀，使番茄酱沉淀的pH值提高到7.0以上，这样在加入溴代十六烷基三甲胺提取液时，可使整个提取缓冲体系的pH值保持在8.0左右，这是DNA提取所必须的。
本发明的技术方案概述如下：
从番茄酱中提取用于转基因成分检测的DNA的方法，它由下述步骤组成：
1.将番茄酱离心，沉淀，取2-4g沉淀，用1-3倍番茄酱体积的pH＝8.0的0.1mol/LTris-HCl的溶液洗涤3-5次。
2.将步骤1获得的沉淀2-4g，加入10-15mL经65℃预热的溴代十六烷基三甲胺提取缓冲液，混匀，65℃水浴1-1.5小时，期间每隔10分钟轻轻颠倒混匀一次。
3.取出静置冷却至20-25℃，于12000转/分钟，离心12分钟，取上清。
4.加入与步骤3所得到的上清液等体积的体积比为24∶1的三氯甲烷∶异戊醇，缓慢颠倒摇匀5分钟，10000转/分钟，离心10分钟，取上清，再加入等体积的体积比为24∶1的三氯甲烷∶异戊醇抽提一次，取上清。
5.加入2倍体积的溴代十六烷基三甲胺沉淀液，摇匀，20-25℃静置50-90分钟，12000转/分钟，离心10分钟，弃上清。
6.沉淀加入1.2mol/L NaCl溶液1mL，溶解沉淀，20-25℃静置5分钟，加入等体积的体积比为24∶1的三氯甲烷∶异戊醇，颠倒摇匀1分钟，12000转/分钟，离心10分钟，取上清。
7.加入所取上清液1/10体积的3mol/L乙酸钠和等体积的4℃预冷异丙醇，缓慢混匀，4℃静置过夜，14000转/分钟，离心15分钟，弃上清。
8.用4℃预冷400μL体积百分比为70％的乙醇洗涤沉淀，除去残留的乙醇，干燥沉淀，得到DNA沉淀。
9.加入25-35μL经灭菌的去离子水，溶解从番茄酱中提取的DNA沉淀。
本发明的有益效果是：有效地使番茄酱沉淀的pH值提高到7.0以上，满足了转基因成分检测的要求，此方法快速、简便、特异性强，效率高，适合番茄酱类制品中转基因成分的PCR检测。
附图说明
图1番茄酱DNA的内源特异参照PG34基因的PCR扩增结果(1.DNA Marker；2.鲜番茄；3.番茄种子；4.番茄酱)
具体实施方式
1.材料和试剂
1)材料：番茄酱样品购自超级市场，对照为鲜番茄和番茄种子。
2)提取试剂：
DNA提取缓冲液(1L)：1000ml水中溶解溴代十六烷基三甲胺20g，Tris 12.114g，NaCl 81.816g，Na2EDTA 7.444g，PVP[聚乙烯吡咯烷酮]20g，高压灭菌。
溴代十六烷基三甲胺沉淀液(1L)：1000ml水中溶解溴代十六烷基三甲胺5g，NaCl 2.34g，高压灭菌。
氯化钠溶液(1.2mol/L)：1000ml水中溶解NaCl 70g，高压灭菌。
乙酸钠溶液(3mol/L)：800ml水中溶解408.1g三水乙酸钠，用冰乙酸调pH至5.2，加水定容至1L，高压灭菌。
Tris-HCl溶液(0.1mol/L，pH8.0)：用800ml水溶解12.114g Tris，冷却至室温，用浓盐酸调pH至8.0，定容至1L。
TE缓冲液：Tris 0.01mol/L，Na2EDTA 1.0mmol/L，用盐酸调pH至8.0，高压灭菌。
三氯甲烷∶异戊醇(24∶1)；70％乙醇；异丙醇；去离子无菌水。
2.DNA提取的流程：
1)样品预处理
取番茄酱等液态加工样品30mL，室温，10000转/分钟，离心15分钟，弃上清，取沉淀2-4g转入预冷的研钵中，置于冰上研磨，全部转入50mL离心管中，用0.1mol/LTris-HCl溶液反复洗涤样品3-5次，方法为加入30mL 0.1mol/L Tris-HCl溶液，反复摇匀，于4℃，10000转/分钟，离心15分钟弃上清，使沉淀的pH值达到接近中性。该沉淀用于DNA提取。
2)取经预处理的样品加入10mL经65℃预热的溴代十六烷基三甲胺提取缓冲液，混匀。65℃水浴1小时，期间每隔10分钟轻轻颠倒混匀一次。
3)静置冷却至室温，12000转/分钟，离心12分钟，取上清。
4)加入等体积的三氯甲烷+异戊醇缓慢颠倒摇匀5分钟，于10000转/分钟，离心10分钟，取上清，加入等体积的三氯甲烷+异戊醇重复抽提一次，取上清。
5)加入2倍体积的溴代十六烷基三甲胺沉淀液，摇匀，室温静置1小时，12000转/分钟，离心10分钟，弃上清。
6)沉淀加入1.2mol/L NaCl溶液1mL溶解沉淀，室温静置5分钟，加入等体积三氯甲烷+异戊醇颠倒摇匀1分钟，于12000转/分钟，离心10分钟，取上清。
7)加入1/10体积的3mol/L乙酸钠和等体积的冷异丙醇，缓慢混匀，4℃静置过夜，14000转/分钟，离心15分钟，弃上清。
8)加入400μL 70％冷乙醇洗涤沉淀，除去残留的乙醇，干燥沉淀。
9)加入30μL灭菌的去离子水溶解番茄酱中提取的DNA沉淀，取15μL用作PCR反应的模板；用作对照的鲜番茄或番茄种子的DNA提取物用100μL TE溶解，置-20℃保存备用。
10)是否提取到可用于PCR检测的DNA，采用特异内源参照基因PCR定性扩增法进行鉴定。实验方法和条件如下：
(1)特异内源参照基因的PCR引物序列(见表1)
表1 特异内源参照基因的PCR引物序列
检测基因 引物序列 扩增片断长度 原料作物
正：5’-gga tcc tta gaa gca tct agt-3’
PG34 383 bp 番茄
反：5’-cgt tgg tgc atc cct gca tgg-3’
(2)特异内源参照基因的PCR反应体系组成(见表2)
反应体系中各试剂的量根据反应体系的总体积进行适当调整，每个反应体系应该设置两个平行管。番茄酱DNA质量检测采用的反应体系相同。
表2 PCR检测参考反应体系(25μL体系)
试剂名称 加入PCR反应体系的量
10×PCR反应缓冲液(含Mg2+) 2.5μL
DNTP溶液(每种为10mmol/L) 0.5μL
正向引物(10pmol/μL) 2.5μL
反向引物(10pmol/μL) 2.5μL
Taq酶(2U/μL) 2.0μL
*模板DNA 10～15μL
水 补足反应体系，使总体积为25μL
*：表中阳性对照样品的DNA模板用量为1μL。
(3)特异内源参照基因的PCR反应条件(见表3)
表3 特异内源参照基因的PCR检测参考反应条件
被扩增的基因 变性 扩增 循环次数 最后延伸
94℃，30s
PG34 94℃，3min 60℃，30s 35 72℃，5min
72℃，45s
(4)电泳条件
用1×TAE电泳缓冲液制备2％的琼脂糖凝胶(凝胶融化后室温放置到60℃左右时加入溴化乙锭，含量为0.5g/mL)。按比例将10μL的PCR产物与上样缓冲液均匀混合，然后加入到凝胶孔中，选择合适的电压(3V/cm～5V/cm)进行电泳，电泳时间为40min～60min。将琼脂糖凝胶置于凝胶成像仪上或紫外透射仪上观察并照相。
下面结合具体实施例对本发明作进一步地说明。
实施例1：
以天津市通茂工贸有限公司生产的金水牌番茄酱为材料，采用本方法提取番茄酱DNA，
(1)将番茄酱离心，沉淀，取3g沉淀，用1倍番茄酱体积的pH＝8.0的0.1mol/LTris-HCl的溶液洗涤3次，使沉淀的pH值接近中性。
(2)将步骤(1)获得的沉淀3g，加入10-15mL经65℃预热的溴代十六烷基三甲胺提取缓冲液，混匀，65℃水浴1-1.5小时，期间每隔10分钟轻轻颠倒混匀一次。
(3)取出静置冷却至20-25℃，于12000转/分钟，离心12分钟，取上清。
(4)加入等体积的体积比为24∶1的三氯甲烷∶异戊醇，缓慢颠倒摇匀5分钟，10000转/分钟，离心10分钟，取上清，再加入等体积的体积比为24∶1的三氯甲烷∶异戊醇抽提一次，取上清。
(5)加入2倍体积的溴代十六烷基三甲胺沉淀液，摇匀，20-25℃静置60分钟，12000转/分钟，离心10分钟，弃上清。
(6)沉淀加入1.2mol/L NaCl溶液1mL溶解沉淀，20-25℃静置5分钟，加入等体积的体积比为24∶1的三氯甲烷∶异戊醇，颠倒摇匀1分钟，12000转/分钟，离心10分钟，取上清。
(7)加入10％的3mol/L乙酸钠和等体积的4℃预冷异丙醇，缓慢混匀，4℃静置过夜，14000转/分钟，离心15分钟，弃上清。
(8)用400μL 4℃预冷，体积百分比为70％的乙醇洗涤沉淀，除去残留的乙醇，干燥沉淀，得到DNA沉淀。
(9)加入30μL经灭菌的去离子水，溶解从番茄酱中提取的DNA沉淀。
实施例2
(1)将番茄酱离心，沉淀，取2g沉淀，用1倍番茄酱体积的pH＝8.0的0.1mol/LTris-HCl的溶液洗涤5次。
(2)-(4)步同实施例1。
(5)加入2倍体积的溴代十六烷基三甲胺沉淀液，摇匀，20-25℃静置90分钟，12000转/分钟，离心10分钟，弃上清。
(6)-(8)步同实施例1。
(9)加入25μL经灭菌的去离子水，溶解从番茄酱中提取的DNA沉淀。
实施例3
(1)将番茄酱离心，沉淀，取2g沉淀，用1倍番茄酱体积的pH＝8.0的0.1mol/LTris-HCl的溶液洗涤5次。
(2)-(4)步骤同实施例1。
(5)加入2倍体积的溴代十六烷基三甲胺沉淀液，摇匀，20-25℃静置90分钟，12000转/分钟，离心10分钟，弃上清。
(6)-(8)步骤同实施例1。
(9)加入25μL经灭菌的去离子水，溶解从番茄酱中提取的DNA沉淀。
实施例4
(1)将番茄酱离心，沉淀，取2g沉淀，用3倍番茄酱体积的pH＝8.0的0.1mol/LTris-HCl的溶液洗涤5次，
(2)-(4)步骤同实施例1。
(5)加入2倍体积的溴代十六烷基三甲胺沉淀液，摇匀，20-25℃静置70分钟，12000转/分钟，离心10分钟，弃上清。
(6)-(8)步骤同实施例1。
(9)加入25μL经灭菌的去离子水，溶解从番茄酱中提取的DNA沉淀。
实施例5
(1)将番茄酱离心，沉淀，取4g沉淀，用1倍番茄酱体积的pH＝8.0的0.1mol/LTris-HCl的溶液洗涤3次。
(2)-(4)步骤同实施例1。
(5)加入2倍体积的溴代十六烷基三甲胺沉淀液，摇匀，20-25℃静置60分钟，12000转/分钟，离心10分钟，弃上清；
(6)-(8)步骤同实施例1。
(9)加入25μL经灭菌的去离子水，溶解从番茄酱中提取的DNA沉淀。
实施例6
(1)将番茄酱离心，沉淀，取3g沉淀，用2倍番茄酱体积的pH＝8.0的0.1mol/LTris-HCl的溶液洗涤5次，
(2)-(4)步骤同实施例1。
(5)加入2倍体积的溴代十六烷基三甲胺沉淀液，摇匀，20-25℃静置75分钟，12000转/分钟，离心10分钟，弃上清。
(6)-(8)步骤同实施例1。
(9)加入35μL经灭菌的去离子水，溶解从番茄酱中提取的DNA沉淀。
实施例7
(1)将番茄酱离心，沉淀，取3g沉淀，用2倍番茄酱体积的pH＝8.0的0.1mol/LTris-HCl的溶液洗涤3次。
(2)-(4)步骤同实施例1。
(5)加入2倍体积的溴代十六烷基三甲胺沉淀液，摇匀，20-25℃静置80分钟，12000转/分钟，离心10分钟，弃上清。
(6)-(8)步骤同实施例1。
(9)加入35μL经灭菌的去离子水，溶解从番茄酱中提取的DNA沉淀。
实施例8
(1)将番茄酱离心，沉淀，取2.5g沉淀，用1倍番茄酱体积的pH＝8.0的0.1mol/LTris-HCl溶液洗涤4次。
(2)-(4)步骤同实施例1。
(5)加入2倍体积的溴代十六烷基三甲胺沉淀液，摇匀，20-25℃静置90分钟，12000转/分钟，离心10分钟，弃上清。
(6)-(8)步骤同实施例1。
(9)加入25μL经灭菌的去离子水，溶解从番茄酱中提取的DNA沉淀。
Claims (6)
1.从番茄酱中提取用于转基因成分检测的DNA的方法，它由下述步骤组成：
(1)将番茄酱离心，沉淀，取2-4g沉淀，用1-3倍番茄酱体积的pH＝8.0的0.1mol/L Tris-HCl的溶液洗涤3-5次；
(2)将步骤(1)获得的沉淀2-4g，加入10-15mL经65℃预热的溴代十六烷基三甲胺提取缓冲液，混匀，65℃水浴1-1.5小时，期间每隔10分钟轻轻颠倒混匀一次；
(3)取出静置冷却至20-25℃，于12000转/分钟，离心12分钟，取上清；
(4)加入与步骤(3)所得到的上清液等体积的体积比为24∶1的三氯甲烷∶异戊醇，缓慢颠倒摇匀5分钟，10000转/分钟，离心10分钟，取上清，再加入等体积的体积比为24∶1的三氯甲烷∶异戊醇抽提一次，取上清；
(5)加入2倍体积的溴代十六烷基三甲胺沉淀液，摇匀，20-25℃静置50-90分钟，12000转/分钟，离心10分钟，弃上清；
(6)沉淀加入1.2mol/LNaCl溶液1mL，溶解沉淀，20-25℃静置5分钟，加入等体积的体积比为24∶1的三氯甲烷∶异戊醇，颠倒摇匀1分钟，12000转/分钟，离心10分钟，取上清；
(7)加入所取上清液1/10体积的3mol/L乙酸钠和等体积的4℃预冷异丙醇，缓慢混匀，4℃静置过夜，14000转/分钟，离心15分钟，弃上清；
(8)用4℃预冷400μL体积百分比为70％的乙醇洗涤沉淀，除去残留的乙醇，干燥沉淀，得到DNA沉淀；
(9)加入25-35μL经灭菌的去离子水，溶解从番茄酱中提取的DNA沉淀。
2.根据权利要求1所述的从番茄酱中提取用于转基因成分检测的DNA的方法，其特征在于：所述步骤(1)中Tris-HCl溶液为1倍番茄酱体积。
3.根据权利要求1所述的从番茄酱中提取用于转基因成分检测的DNA的方法，其特征在于：所述步骤(1)中用Tris-HCl溶液洗涤的次数为3次。
4.根据权利要求1所述的从番茄酱中提取用于转基因成分检测的DNA的方法，其特征在于：所述步骤(1)所得到的沉淀的pH值为7.0。
5.根据权利要求1所述的从番茄酱中提取用于转基因成分检测的DNA的方法，其特征在于：所述步骤(5)中的静置时间为60分钟。
6.根据权利要求1所述的从番茄酱中提取用于转基因成分检测的DNA的方法，其特征在于：所述步骤(9)中灭菌去离子水的体积为30μL。
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| CN 200410020100 CN1597981A (zh) | 2004-07-23 | 2004-07-23 | 从番茄酱中提取用于转基因成分检测的dna的方法 |
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| CN107365767A (zh) * | 2017-09-15 | 2017-11-21 | 广东美格基因科技有限公司 | 一种从酱油中提取dna的方法 |
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2004
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