CN101029341A - 筛选高繁殖力山羊的方法及其专用引物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种筛选高繁殖力山羊的方法及其专用引物。该引物是由序列表中序列3和序列4的核苷酸序列组成的引物对。该方法是以待测山羊的基因组DNA为模板，在由序列表中序列3和序列4的核苷酸序列组成的引物对的引导下进行PCR扩增，检测扩增片段自5’端第259位碱基为A、G还是N，N为A和G的杂合体；所述扩增片段自5’端第259位碱基为A时，其纯合体的基因型为AA；所述扩增片段自5’端第259位碱基为G时，其纯合体的基因型为BB；它们的杂合体基因型为AB；所述AA基因型山羊的繁殖能力高于AB和BB基因型山羊，AB基因型山羊的繁殖能力又高于BB基因型山羊。本发明的方法及其专用引物将在高繁殖能力山羊的筛选中发挥重要作用，应用前景广阔。

Description

筛选高繁殖力山羊的方法及其专用引物

技术领域

本发明涉及筛选高繁殖力山羊的方法及其专用引物，特别是涉及一种利用山羊抑制素β_B亚基基因的单核苷酸多态性筛选高繁殖力山羊的方法及其专用引物。

背景技术

抑制素(Inhibin，INH)是一种主要由雌性动物卵巢颗粒细胞和雄性动物睾丸支持细胞分泌的糖蛋白激素，对垂体FSH的合成和分泌进行负反馈调节(Mason A J，Hayflick J S，Ling N，Esch F，Ueno N，Ying S Y，Guillemin R，Niall H，SeeburgP H.Complementary DNA sequences of ovarian follicular fluid inhibin showprecursor structure and homology with transforming growthfactor-beta.Nature，1985，318(6047)：659～663.)。抑制素是一种由不同亚基(包括α、β_A、β_B)组成的二聚体，把α亚基和β_A亚基构成的抑制素称为抑制素A(inhibinA，INHBA)；α亚基和β_B亚基构成的抑制素称为抑制素B(inhibin B，INHBB)。研究表明，对于成年男性，INHBB是唯一能被检测到的抑制素，血液中INHBB的水平反映了睾丸支持细胞的数量和功能。血清INHBB水平能较灵敏地反映睾丸疾病或精子发生障碍(王国洪.抑制素测定的临床意义.标记免疫分析与临床.2004，11(4)238～239.)；对于女性，INHBB与卵巢储备有关，它可反映与年龄有关的卵子质量下降，且与受精后胚胎评分显著相关(Chang C L，Wang T H，Horng S G.The concentrationof inhibin B in follicular fluid：relation to oocyte maturation and embryodevelopment.Human Reproduction，2002，17(17)：1724～1728.)。此外，抑制素免疫能显著提高山羊的受精率和产羔数。山羊抑制素B基因已被定位到染色体2q31→q33(Hiendleder S，Dodds K G，Wassmuth R.Linkage mapping of the ovine α-inhibin(INHA)，β_A-inhibin/activin(INHBA)and β_B-inhibin/activin(INHBB)genes.J Hered，2000，91(4)：343～345.)。目前，已发现绵羊INHBB基因具有遗传多态性(Hiendleder S，Dodds K G，Wassmuth R.Linkage mapping of the ovineα-inhibin(INHA)，β_A-inhibin/activin(INHBA)and β_B-inhibin/activin(INHBB)genes.J Hered，2000，91(4)：343～345.)，但有关山羊INHBB基因的多态性研究国内外还未见报道。

据《中国羊品种志》记载，济宁青山羊是我国繁殖力最高的山羊品种，平均产活羔数为2.94，内蒙古绒山羊平均产活羔数为1.04，安哥拉山羊基本产单羔(《中国羊品种志》编写组.中国羊品种志.上海：上海科学技术出版社，1988，88～90，98～100.)。

单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。SNP检测方法常采用一些已有的成熟技术，如DNA测序、限制性酶切片段长度多态性(RFLP)、单链构象多态性(SSCP)及等位基因特异的寡聚核苷酸杂交(ASO)等。具体采用哪一种方法，需要结合靶序列的特点和实验条件来确定。

日本Orita等研究发现，单链DNA片段呈复杂的空间折叠构象，这种立体结构主要是由其内部碱基配对等分子内相互作用力来维持的，当有一个碱基发生改变时，会或多或少地影响其空间构象，使构象发生改变，空间构象有差异的单链DNA分子在聚丙烯酰胺凝胶中受排阻大小不同，因此，通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，可以非常敏锐地将构象上有差异的分子分离开。将SSCP用于检测PCR扩增产物的基因突变而建立的PCR-SSCP技术，进一步提高了基因突变检测方法的便捷性和灵敏性。

PCR-SSCP技术(Orita M，Iwahana H，Kanazawa H.Detection of polymorphismsof human DNA by gel electrophoresis as single-strand conformationalpolymorphisms.Proc Natl Acad Sci USA.1989，86：2766-2770.；Orita M，SuzukiY，Sekiya T，et al.A rapid and sensitive detetion of point mutation and geneticpolymorphism using polymerase chain reaction.Genomics.1989，5：874-879.)是检测DNA突变最为直观而精确的实验技术手段之一，该方法对长度在100-300bp之间的DNA片段突变检测的灵敏度可达100％，结合序列分析，可做到对大批量样品的目的DNA片段的“全扫描”分析，不仅成本低，而且自动化程度较高，因此，在进行基因诊断和多态性分析，包括单核苷酸多态(SNP)的检测中，PCR-SSCP技术不失为一种准确、快速、简便、经济的技术手段。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用山羊抑制素β_B亚基基因的单核苷酸多态性筛选高繁殖力山羊的方法及其专用引物。

本发明所提供的用于筛选高繁殖力山羊的引物，是由序列表中序列3和序列4的核苷酸序列组成的引物对。

序列表中的序列3由20个碱基组成，序列表中的序列4由18个碱基组成。

本发明的第二个目的是提供一种筛选高繁殖力山羊的方法。

本发明所提供的筛选高繁殖力山羊的方法，是以待测山羊的基因组DNA为模板，在由序列表中序列3和序列4的核苷酸序列组成的引物对的引导下进行PCR扩增，检测扩增片段自5’端第259位碱基(即INHBB基因自外显子2(exon 2)第259位碱基，INHBB基因组基因自5’端第840位碱基)为A、G还是N，N为A和G的杂合体；所述扩增片段自5’端第259位碱基为A时，其纯合体的基因型为AA；所述扩增片段自5’端第259位碱基为G时，其纯合体的基因型为BB；它们的杂合体基因型为AB；所述AA基因型山羊的繁殖能力高于AB和BB基因型山羊，AB基因型山羊的繁殖能力又高于BB基因型山羊。

所述待测山羊的基因组DNA的来源是广泛的，可以从血液(新鲜或冷冻)、精液(新鲜或冷冻)、组织样品(如耳组织等)或含有毛囊的羊毛样品中提取。

其中，以25μl总体积为例，PCR反应体系包括：50ng/μl模板DNA 3.0μL，TaqDNA聚合酶1.0U，10pmol/L上、下游引物各2.0μl，dNTPs终浓度为200μmol/L，10×PCR缓冲液2.5μl，20mmol/L Mg²⁺ 1.5μL，用超纯水补充反应体系至25μl。10×PCR缓冲液的组成是：Tris·HCl(pH8.3)100mM，KCl 500mM，MgCl₂ 15mM。PCR反应条件为：先95℃预变性5min，然后94℃变性30s，59.5℃退火30s，72℃延伸30s，共进行31个循环；最后72℃延伸8min。

所述检测PCR扩增产物的方法可为对扩增产物进行10％的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后银染显色。具体方法可为：取2μl PCR扩增产物，加入7μl上样缓冲液(98％甲酰胺，0.025％溴酚蓝，0.025％二甲苯氰，10mmol/L EDTA(pH8.0))，98℃变性10min后，冰浴8min，点样，用10％非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离，银染显色。结果发现存在3种不同基因型：AA型、AB型和BB型，基因分型结果如图2所示。经测序发现，AA基因型山羊的INHBB基因第2外显子(exon 2)第259位碱基为A，BB基因型山羊的INHBB基因第2外显子第259位碱基为G，AB基因型山羊的INHBB基因第2外显子第259位碱基为N，所述AA基因型山羊的繁殖能力高于AB和BB基因型山羊，AB基因型山羊的繁殖能力又高于BB基因型山羊。

上述筛选方法的适用范围是广阔的，包括济宁青山羊、内蒙古绒山羊、安哥拉山羊、波尔山羊和文登奶山羊等任意山羊品种。

本发明提供了一种筛选高繁殖力山羊的方法及其专用引物。通过PCR-SSCP技术发现在生殖中起重要作用的抑制素β_B亚基基因(inhibin β_B，INHBB)的编码区在高繁殖力山羊品种(济宁青山羊)和低繁殖力山羊品种(内蒙古绒山羊、安哥拉山羊)中存在单核苷酸多态性，同时以济宁青山羊为例，利用该基因的多态性研究了其对济宁青山羊高繁殖力的影响，结果发现引物对P2的扩增片段具有多态性，P2扩增片段在济宁青山羊中检测到AA、AB和BB 3种基因型，在内蒙古绒山羊和安哥拉山羊中检测到AB和BB两种基因型(原因可能是样本数量较少)，进一步的测序分析结果表明BB基因型与AA基因型扩增片段相比，在自5’端第840位碱基(即INHBB基因自外显子2(exon 2)第259位碱基)处由碱基A突变G，并使得编码的氨基酸残基由组氨酸变为精氨酸。其中，济宁青山羊AA、AB和BB基因型频率分别为0.0685、0.500和0.4315。AA基因型济宁青山羊产羔数的最小二乘均值比AB基因型的多0.73只(P＜0.05)，比BB基因型的多0.84只(P＜0.05)；AB基因型济宁青山羊产羔数的最小二乘均值比BB基因型的多0.11只(P＞0.05)。上述统计结果表明AA基因型山羊的繁殖能力显著高于AB和BB基因型山羊，AB基因型山羊的繁殖能力又高于BB基因型山羊，故可初步认为A等位基因可能具有增加山羊产羔数的作用，可利用山羊INHBB基因进行标记辅助选择来提高山羊的产羔数。本发明的方法及其专用引物将在高繁殖能力山羊的筛选中发挥重要作用，应用前景广阔。

下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。

附图说明

图1为分别在引物对P1和P2引导下的PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果

图2为引物对P2对不同山羊品种PCR扩增产物的SSCP分析结果

图3为AA和BB纯合基因型山羊个体的PCR扩增产物的序列比对结果

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《Molecular Cloning：A Laboratory Manual》(Sambrook，J.，Russell，David W.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，3^rd edition，2001，NY，Cold SpringHarbor)。所用引物合成及测序工作均由上海英骏生物技术有限公司完成。

实施例1、用于筛选高繁殖力山羊的引物设计及PCR-SSCP分析

一、引物设计

根据Thompson等(Thompson D A，Cronin C N，Martin F.Genomic cloning andsequence analyses of the bovine alpha-，beta A- and beta B-inhibin/activingenes.Identification of transcription factor AP-2-binding sites in the5’-flanking regions by DNase I footprinting.Eur J Biochem，1994，226(3)：751～764.)发表的牛抑制素β_B亚基(INHBB)基因的外显子2序列(GenBank登录号为U16241)设计2对引物P1和P2，以扩增INHBB基因外显子2部分序列，这2对引物扩增片段的预期大小分别为244bp、296bp，引物序列如下：

引物对P1：F1(上游引物)：5’-CGGGTCCGCCTGTACTTCTT-3’(序列表中序列1)；

          R1(下游引物)：5’-CCTGGATGGGTTCGGTGAG-3’(序列表中序列2)。

引物对P2：F2(上游引物)：5’-CACCGGCTACTATGGGAACT-3’(序列表中序列3)；

          R2(下游引物)：5’-ACTTGCCACACCCTGGTC-3’(序列表中序列4)。

二、PCR扩增

选择具有头3胎产羔数记录的济宁青山羊母羊，颈静脉采血，所采血样均为10mL/只，用柠檬酸葡萄糖抗凝，-20℃冻存。用酚氯仿抽提法提取血样的基因组DNA，溶于TE缓冲液(10mmol/L Tris·HCl(pH 8.0)，1mmol/L EDTA(pH 8.0))，4℃保存。然后以所提取的不同血样的基因组DNA为模板，分别在上述2对引物的引导下进行PCR扩增，25μl PCR反应体系为：50ng/μl模板DNA 3.0μL，Taq DNA聚合酶(北京鼎国生物技术有限公司)1.0U，10pmol/L上、下游引物各2.0μl，dNTPs(北京鼎国生物技术有限公司)终浓度为200μmol/L，10×PCR缓冲液(Tris·HCl(pH8.3)100mM，KCl 500mM，MgCl₂ 15mM)2.5μl，20mmol/L Mg²⁺ 1.5μL，用超纯水补充反应体系至25μl。PCR反应条件为：先95℃预变性5min，然后94℃变性30s，退火30s(引物对P1、P2的退火温度分别为60.0℃、59.5℃)，72℃延伸30s，共进行32个循环；最后72℃延伸8min，4℃保存。反应结束后，对2对引物的PCR扩增产物进行2％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图1所示(泳道7-10：引物对P1的PCR扩增产物；泳道1-6：引物对P2的PCR扩增产物；泳道M：SD002 Marker)，2对引物用于PCR扩增都获得了较好的效果，引物P1的PCR扩增产物的长度为244bp，引物P2的PCR扩增产物的长度为296bp，与预期结果一致，而且没有非特异扩增条带，引物对P1的扩增产物虽有拖尾带但对进行SSCP分析无影响，表明上述2对引物可以直接用于SSCP分析。

三、PCR-SSCP分析

1、基因型检测

取具有头3胎产羔数记录的146只济宁青山羊母羊血样(采自农业部济宁青山羊保种基地(山东省嘉祥县))，40只内蒙古绒山羊母羊血样(采自内蒙古白绒山羊种羊场(内蒙古鄂尔多斯市鄂托克旗))和38只安哥拉山羊母羊血样(采自山西省晋城市沁水示范牧场(山西省沁水县郑庄镇))，然后提取血样的基因组DNA，采血及DNA提取方法与步骤二相同，再分别在引物对P1和P2的引导下进行PCR扩增，PCR反应体系及反应条件与步骤二相同。反应结束后，对扩增产物进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，具体方法为：取2μl PCR扩增产物，加入7μl上样缓冲液(98％甲酰胺，0.025％溴酚蓝，0.025％二甲苯氰，10mmol/L EDTA(pH8.0))，98℃变性10min后，冰浴8min，点样，用非变性聚丙烯酰胺凝胶中4℃电泳分离，检测这2对引物扩增产物所用的聚丙烯酰胺凝胶浓度分别为8％(P1)、10％(P2)，聚丙烯酰胺凝胶交联度为29∶1，电压均为140V，电泳结束后银染显色，最后用AlphaImager^TM 2200 and 1220Documentation and Analysis Systems(Alpha Innotech Corporation，San Leandro，CA，USA)拍照并对图像进行分析。

SSCP分析结果表明2对引物中只有引物对P2的PCR扩增片段具有多态性，P1引物对的PCR扩增片段不存在多态性，其中引物对P2对不同山羊品种PCR扩增产物的SSCP分析结果如图2所示，发现存在3种不同基因型：纯合基因型AA(见图2中的泳道9)，纯合基因型BB(见图2中的泳道2，3，4，6，7)和杂合基因型AB(见图2中的泳道1，5，8，10)。

2、克隆测序

对步骤1经SSCP分析后的AA、BB 2种纯合基因型个体的PCR扩增产物用DNA片段快速纯化回收试剂盒(北京鼎国生物技术有限公司)回收并纯化，然后将回收后的DNA片段连接入载体pGEM-T Easy(北京鼎国生物技术有限公司)中，将连接产物转化大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，用质粒提取纯化试剂盒(北京鼎国生物技术有限公司)提质粒，经酶切鉴定后在3730(ABI)测序仪上测序。BB基因型扩增片段具有序列表中序列5的核苷酸序列，AA基因型扩增片段具有序列表中序列6的核苷酸序列，如图3所示(箭头指示突变碱基)，BB基因型扩增片段与AA基因型扩增片段相比，自外显子2第259位碱基(即INHBB基因组基因自5’端第840位碱基)由碱基A突变为G，并导致所编码的氨基酸残基由组氨酸残基变为精氨酸残基，即AA基因型山羊的INHBB基因第2外显子(exon 2)第259位碱基为A，BB基因型山羊的INHBB基因第2外显子第259位碱基为G，AB基因型山羊的INHBB基因第2外显子第259位碱基为N(N为A和G的杂合体)。

3、统计分析

1、3个山羊品种中INHBB基因的等位基因频率和基因型频率统计

根据步骤1和步骤2的检测结果对INHBB基因第2外显子在上述3个山羊品种(济宁青山羊、内蒙古绒山羊、安哥拉山羊)中的等位基因频率和基因型频率进行统计，结果如表1所示，表明山羊INHBB基因第2外显子具有遗传多态性，上述PCR-SSCP分析结果表明在济宁青山羊中检测到AA、AB、BB三种基因型，而在内蒙古绒山羊和安哥拉山羊中没有检测到AA基因型，产生这些结果的原因可能是所检测的样本数较少。B等位基因频率在济宁青山羊、安哥拉山羊和内蒙古绒山羊中较高，分别为0.6815、0.9500、0.7632。A等位基因频率在内蒙古绒山羊中较低，只有0.050。且经χ²适合性检验，引物对P2在三个不同品种山羊中的基因型χ²值都未达到显著水平，即这三个不同品种山羊在基因座INHBB上都达到了Hardy-Weinberg平衡状态(P＞0.05)，说明INHBB基因的P2这对引物的扩增片段不受选育措施的影响，在选育过程中它们的遗传仍然是随机的。

表1  3个山羊品种中INHBB基因的等位基因频率和基因型频率(括号内的数字是个体数)

品种Breed		济宁青山羊JiningGrey goat	内蒙古绒山羊InnerMongoliaCashmere goat	安哥拉山羊Angora goat
					数量N基因型频率Genotype frequency等位基因频率Allele frequency	AAABBBAB	1460.0685(10)0.5000(73)0.4315(63)0.31850.6815	400.0000(0)0.1000(4)0.9000(36)0.05000.9500	380.0000(0)0.2368(9)0.7632(29)0.23680.7632

2、济宁青山羊产羔数在INHBB各基因型之间的差异分析

配合下列模型对步骤1和步骤2的检测结果进行最小二乘方差分析，比较济宁青山羊产羔数在INHBB各基因型之间的差异：

y_ijklm＝μ+S_i+HYS_j+P_k+G_l+e_ijklm

其中：y_ijklm为产羔数的记录值；μ为群体平均值；S_i为第i头公畜的固定效应；HYS_j为第j个场年季的固定效应；P_k为第k个胎次的固定效应；G_l为INHBB基因第l种基因型的固定效应；e_ijklm为随机残差效应。统计分析用SAS(V8.12)软件的GLM(General Linear Model)过程完成。

不同INHBB基因型的146只济宁青山羊产羔数的最小二乘均值及标准误统计结果如表2所示，AA基因型济宁青山羊产羔数的最小二乘均值比AB基因型的多0.73只(P＜0.05)，比BB基因型的多0.84只(P＜0.05)；AB基因型济宁青山羊产羔数的最小二乘均值比BB基因型的多0.11只(P＞0.05)，即AA基因型山羊的繁殖能力高于AB和BB基因型山羊，AB基因型山羊的繁殖能力又高于BB基因型山羊。由上述结果可初步认为A等位基因可能具有增加山羊产羔数的作用，可利用山羊INHBB基因进行标记辅助选择来提高山羊的产羔数。

上述分析结果表明，本发明的方法及其专用引物可用于筛选繁殖能力高的山羊。

表2  INHBB基因不同基因型济宁青山羊产羔数的最小二乘均值及标准误(具有不同字母肩标的平均值之间差异显著(P＜0.05))

基因型	样本数	产羔数
			AAABBB	107363	2.76a±0.212.03b±0.131.92b±0.16

                                序列表

<160>6

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<230>

<400>1

cgggtccgcc tgtacttctt                                                  20

<210>2

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<230>

<400>2

cctggatggg ttcggtgag                                                   19

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<230>

<400>3

caccggctac tatgggaact                                                  20

<210>4

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<230>

<400>4

acttgccaca ccctggtc                                                    18

<210>5

<211>296

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<230>

<400>5

gtggccgatg atacccttga tgacgctccc gtcgacggga cggatggacc gcccccacgg    60

cccgagccgg aggaggaagg tgtgccggca ccatttggtc atggcgtacg cccccgactt    120

gggcccgtgg cacttgagga cgacataggg gtggttcgac tcgtggtaca ggtacgagat    180

gaagctgctg ctcatgttgt agcagttcgc cctgcacggg ttatactagc acctcctcac    240

gccgacgcgt actcccgtgc cgaggtagcc ccgtacccct ggtcccacac cgttca        296

<210>6

<211>296

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<230>

<400>6

gtggccgatg atacccttga tgacgctccc gtcgacggga cggatggacc gcccccacgg    60

cccgagccgg aggaggaagg tgtgccggca ccatttggtc atggcgtacg cccccgactt    120

gggcccgtgg cacttgagga cgacataggg gtggttcgac tcgtggtaca ggtacgagat    180

gaagctgctg ctcatgttgt agcagttcgc cctgcacggg ttatactagc acctcctcac    240

gccgacgcgt actcccgtac cgaggtagcc ccgtacccct ggtcccacac cgttca        296

Claims (5)

1、用于筛选高繁殖力山羊的引物，是由序列表中序列3和序列4的核苷酸序列组成的引物对。

2、一种筛选高繁殖力山羊的方法，是以待测山羊的基因组DNA为模板，在由序列表中序列3和序列4的核苷酸序列组成的引物对的引导下进行PCR扩增，检测扩增片段自5’端第259位碱基为A、G还是N，N为A和G的杂合体；所述扩增片段自5’端第259位碱基为A时，其纯合体的基因型为AA；所述扩增片段自5’端第259位碱基为G时，其纯合体的基因型为BB；它们的杂合体基因型为AB；所述AA基因型山羊的繁殖能力高于AB和BB基因型山羊，AB基因型山羊的繁殖能力又高于BB基因型山羊。

3、根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于：所述PCR反应体系包括：50ng/μl模板DNA 3.0μl，Taq DNA聚合酶1.0U，10pmol/L上、下游引物各2.0μl，dNTPs终浓度为200μmol/L，10×PCR缓冲液2.5μl，20mmol/L Mg²⁺1.5μl，用超纯水补充反应体系至25μl。

4、根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于：所述PCR反应条件为：先95℃预变性5min，然后94℃变性30s，59.5℃退火30s，72℃延伸30s，共进行31个循环；最后72℃延伸8min。

5、根据权利要求2或3或4所述的筛选方法，其特征在于：所述山羊品种包括济宁青山羊、内蒙古绒山羊、安哥拉山羊、波尔山羊和文登奶山羊。

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