CN101063132A - 花鲈白细胞介素8基因序列 - Google Patents
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Abstract
本发明以近源物种IL－8基因的CDS序列的保守区设计兼并引物，从花鲈鱼的脾脏中提取总RNA，用PCR法扩增，结合RACE技术克隆到花鲈白细胞介素8(IL－8)基因的全表达序列。该基因不仅为研究鱼类IL－8在炎症反应中的作用，进一步探讨鱼类炎症反应的发生机理奠定基础，而且通过氨基酸序列可以获得具有生物活性的纯化蛋白，为研究新型的抗病免疫佐剂提供理论基础。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学中的基因领域，特别是关于花鲈白细胞介素8基因序列。
背景技术
白细胞介素8(interleukin 8，IL-8)基因又称噬中性粒细胞激活因子或粒细胞趋化因子，属C-X-C型趋化性因子，是最早发现的趋化性因子。它由单核-巨噬细胞、血管内皮细胞、上皮细胞和肥大细胞等多种细胞经炎症刺激后产生，具有趋化和激活嗜中性粒细胞的能力，包括吸引噬中性粒细胞向炎症部位迁移，并诱导它们脱颗粒，释放溶菌酶，启动呼吸代谢爆发，增加细胞表面粘附分子的表达等多种功能，在炎症发生和发展过程中有重要的作用，是一种重要的免疫抗病基因。目前随着海水养殖业的发展，病害问题日趋严重，因此从鱼体自身入手，提高鱼体免疫力是当今病害防治的趋势。至今对花鲈免疫基因的研究还较少，尤其对IL-8的研究还属空白。
发明内容
本发明的目的是通过以近源物种IL-8基因的CDS序列的保守区设计的兼并引物，并用PCR法扩增，结合RACE技术克隆到花鲈白细胞介素8(IL-8)基因的全表达序列。其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所述；它的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所述。
本发明的目的通过以下技术措施实现：
1、总RNA的提取
解剖鱼体取出脾脏，使用Trizol进行匀浆，按照使用说明提取花鲈总RNA。
2、cDNA第一链的合成
花鲈总RNA与反转录引物(oligo-dT接头引物)混合，进行反转录。
3、引物设计依据，引物合成的方法
从GenBank中下载近源物种(如人、牛、虹鳟、牙鲆、鲤鱼等)IL-8同源基因CDS序列，利用Clustal W软件进行多序列比对，确定保守区，根据保守区序列设计兼并引物，扩增片段大小约为180bp。引物设计后采用β-乙睛亚磷酰胺化学法进行DNA合成。
引物序列为：
F：5’TGCCRCTGCATHGARAC 3’
R：5’ACTTGTTVATGACYHTCTTVACCCA 3’
4、IL-8基因cDNA全序列的克隆
以上述合成的第一链cDNA作为模板，用兼并引物进行PCR扩增，所扩增的PCR产物用1.2％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，从凝胶中纯化回收目的产物。然后将纯化的PCR产物克隆到pMD-18T载体中，转化大肠杆菌JM-109感受态细胞，挑取阳性克隆，提取质粒DNA。经简并引物PCR检测后，将具有插入片段的质粒DNA用M13通用引物进行双向测序。
根据已得到的cDNA片段序列设计特异性引物，利用cDNA末端快速扩增技术(RapidAmplification of cDNA ends，RACE)对目的基因的3′和5′末端进行PCR扩增。
在3′端RACE中，利用半巢式(semi-nested)PCR方法，首先由外侧引物和接头引物进行PCR反应，所得产物利用内侧和接头引物再进行PCR扩增。
基因外侧引物：5’CAGAGAATCGGCACAGACAG 3’
基因内侧引物：5’GGCACAGACAGCAGATAAGG 3’
接头引物：5’GGCCACGCGACTAGTAC 3’。
经过3′端RACE扩增后的序列再进行5′端RACE扩增，利用末端转移酶和dCTP在cDNA末端加上poly(C)尾后，以加尾后的cDNA作为模板，利用外侧特异性引物和oligodG进行第一次PCR扩增，所得PCR产物再利用内侧引物和oligodG进行第二次PCR扩增。
oligo-dG：5’GGGGGGGGGGGGGGGH 3’
基因外侧引物：5’CTGTCTGTGCCGATTCTCTG 3’
基因内侧引物：5’CACATCACCTGTCTTTTGGC 3’。
所得到的PCR产物在1.2％的琼脂糖凝胶电泳上进行分离检测后，将PCR产物纯化后，克隆到pMD-18T载体中，转化大肠杆菌JM-109感受态细胞，挑取阳性克隆，用M13引物对质粒DNA进行测序，测序所得序列再与兼并引物扩增所得的序列利用Clustal W软件进行拼接。
5、对花鲈白细胞介素8(IL-8)基因的测定
所得到的PCR产物在1.2％的琼脂糖凝胶电泳上进行分离检测后，将PCR产物纯化后，克隆到pMD-18T载体中，转化大肠杆菌JM-109感受态细胞，挑取阳性克隆，用3730测序仪对质粒DNA进行测序。测序结果用BLAST软件进行同源性测定，来确定为花鲈IL-8同源序列。
本发明的优点：随着海水养殖业的发展，病害问题日趋严重，一般的抗生素药物极易引起环境污染，因此从鱼体自身入手，提高鱼体免疫力是病害防治的趋势。因此该基因的获得，不仅为研究鱼类IL-8在炎症反应中的作用，进一步探讨鱼类炎症反应的发生机理奠定基础，而且通过氨基酸序列可以获得具有生物活性的纯化蛋白，为研究新型的抗病免疫佐剂提供理论基础。
附图说明
图1是注射LPS刺激前后体内的不同组织器官的花鲈白细胞介素8的表达量；
No Injected：注射LPS刺激前表达量；Injected with LPS：注射LPS刺激后表达量；RTC：未加入模板时PCR反应的结果；liver：肝脏；spleen：脾脏；gill：腮；brain：脑；HK：头肾；heart：心脏；IL-8：花鲈白细胞介素8；β-actin：β-肌动蛋白。
具体实施方式
1.总RNA的提取
取鲜活健康花鲈(体重约400g)在实验室内暂养2d后(水温约24℃，气泵充气)，从胸腔注射脂多糖(LPS，10μg/mL)200μL。刺激6h后，解剖鱼体取出脾脏约100mg，分别放入1mL Trizol(Gibco，Japan)中进行匀浆，按照试剂盒使用说明提取总RNA。
2.cDNA第一链的合成
取花鲈总RNA 5μg与反转录引物(oligo-dT接头引物)1μL(10pmol/L)混合，70℃加热5min后，立即放置冰上，然后加入5×buffer，2.5mmol/L dNTP混合液，RibonucleaseInhibitor，M-MLV反转录酶，反应体系为25μL。反应过程为42℃60min，70℃15min，最后放入-80℃保存备用。
3.引物设计依据，引物合成的方法
从GenBank中下载近源物种(如人、牛、虹鳟、牙鲆、鲤鱼等)IL-8同源基因CDS序列，利用Clustal W软件进行多序列比对，确定保守区，根据保守区序列设计兼并引物，扩增片段大小约为180bp。引物设计后采用β-乙睛亚磷酰胺化学法进行DNA合成。
引物序列为：
F：5’TGCCRCTGCATHGARAC 3’
R：5’ACTTGTTVATGACYHTCTTVACCCA 3’
4.IL-8基因cDNA全序列的克隆
以近源物种IL-8基因CDS序列的保守区设计的兼并引物，扩增片段大小约为180bp。
以上述合成的第一链cDNA作为模板，用兼并引物进行PCR扩增，反应体系为：10×PCR反应缓冲液5μL，25mmol/L MgCl2 3μL，2.5mmol/L dNTP 2μL，10nmol/L引物dTF和dTR各2μL，Taq酶1.25U，用PCR水将反应体系补充至50μL。反应条件为：1个循环，94℃变性5min；35个循环：94℃变性45s，56℃退火45s，72℃延伸45s；1个循环，72℃延伸10min；4℃保温。所扩增的PCR产物用1.2％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，从凝胶中纯化回收目的产物。然后将纯化的PCR产物克隆到pMD-18T载体中，转化大肠杆菌JM-109感受态细胞，挑取阳性克隆，提取质粒DNA。经简并引物PCR检测后，将具有插入片段的质粒DNA用M13通用引物进行双向测序。
根据已得到的cDNA片段序列设计特异性引物。利用cDNA末端快速扩增技术(Rapid Amplification of cDNA ends，RACE)对目的基因的3′和5′末端进行PCR扩增。
在3′端RACE中，利用半巢式(semi-nested)PCR方法，首先由外侧引物和接头引物进行PCR反应，所得产物稀释50倍后，取1μL作为模板，利用内侧和接头引物再进行PCR扩增。
反应体系为：10×PCR反应缓冲液5μL，25mmol/L MgCl2 3μL，2.5mmol/L dNTP2μL，10nmol/L正反向引物各2μL，Taq酶1.25U，用PCR水将反应体系补充至50μL。
反应条件为：1个循环，94℃变性5min；35个循环：94℃变性45s，59℃退火30s，72℃延伸50s；1个循环，72℃延伸10min；4℃保温。
基因外侧引物：5’CAGAGAATCGGCACAGACAG 3’
基因内侧引物：5’GGCACAGACAGCAGATAAGG 3’
接头引物：5’GGCCACGCGACTAGTAC 3’。
经过3′端RACE扩增后的序列再进行5′端RACE扩增，利用末端转移酶和dCTP在cDNA末端加上poly(C)尾后，以加尾后的cDNA作为模板，利用外侧特异性引物和oligodG进行第一次PCR扩增，所得PCR产物取1μL作为模板，再利用内侧引物和oligodG进行第二次PCR扩增。反应体系及反应条件同3′RACE。
oligo-dG：5’GGGGGGGGGGGGGGGH 3’
基因外侧引物：5’CTGTCTGTGCCGATTCTCTG 3’
基因内侧引物：5’CACATCACCTGTCTTTTGGC 3’。
所得到的PCR产物在1.2％的琼脂糖凝胶电泳上进行分离检测后，将PCR产物纯化后，克隆到pMD-18T载体中，转化大肠杆菌JM-109感受态细胞，挑取阳性克隆，用M13引物对质粒DNA进行测序，测序所得序列再与兼并引物扩增所得的序列利用Clustal W软件进行拼接。
5.对花鲈白细胞介素8(IL-8)基因的测定
所得到的PCR产物在1.2％的琼脂糖凝胶电泳上进行分离检测后，将PCR产物纯化后，克隆到pMD-18T载体中，转化大肠杆菌JM-109感受态细胞，挑取阳性克隆，用3730测序仪对质粒DNA进行测序。测序结果用BLAST软件进行同源性测定，来确定为花鲈IL-8同源序列。比对结果：
Score E
Sequences producing significant alignments： (Bits) Value
gi|74095881|ref|NP_001027759.1| inter leukin-8[Takifugu rubri...
159 2e-38
gi|62901686|gb|AAY18807.1| interleukin 8[Acanthopagrus schlegel
154 1e-36
gi|19911219|dbj|BAB86884.1| CXC chemokine[Paralichthys olivaceu
146 3e-34
gi|15667642|gb|AAL05442.1| inter leukine-8[Paralichthys olivaceu
144 8e-34
gi|52547128|gb|AAU81660.1| inter leukin-8[Gadus morhua]
141 9e-33
gi|77621310|emb|CAD59734.2| inter leukin 8[Gadus morhua]
138 7e-32
gi|91701717|gb|ABE47600.1| inter leukin 8[Cyprinus carpio]
130 2e-29
gi|31087942|gb|AAP42829.1| inter leukin 8X[Oncorhynchus mykis...
126 2e-28
6.花鲈IL-8基因在不同组织内的表达
按上述方法提取LPS(脂多糖)刺激前后体内的不同组织器官中的白细胞介素8来检测该基因在机体受到外界刺激应激反应时，是否直接发挥作用。
β-actin作为内参照物来调节各个阶段模板即cDNA的量，使其所含的模板数一致，从而进行PCR反应，将所得到的PCR产物在1.2％的琼脂糖凝胶电泳上进行分离检测基因的表达量的高低。所用的引物序列为：
β-actin：
F：5’ATCGTGGGGCGCCCCAGGCACC 3’
R：5’CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC 3’
基因特异性引物：
F：5’GTGGTGCTCCTGGCTTTCTT 3’
R：5’ATGGGTTTGCTCTCCGTCTC 3’
从图1所示的结果可以看出LPS刺激后，基因在体内组织内的表达量明显增加，尤其在免疫器官头肾、脾脏及肝脏中表现极为明显。
序列表
<110>中国水产科学研究院南海水产研究所
<120>花鲈白细胞介素8基因序列
<150>CN200610035460.3
<151>2006-05-15
<160>2
<210>1
<211>803
<212>RNA
<213>花鲈(Lateolabrax Japonicus)
<220>
<221>3’UTP
<222>(460)...(803)
<220>
<221>5’UTP
<222>(1)...(159)
<220>
<221>CDS
<222>(160)...(459)
<220>
<221>PolyA site
<222>(788)...(803)
<400>1
ccaagaaaag gaaaagtaga gagagtgaac tcagtgaaag aataaggaat acagaagaat 60
aaaaaacttc tttactttta tacaggcttc atcagacggc tttctgaagg gcattcatat 120
ccttagtgat aatttgttgc aaaatttgta aaaggcaaa atg aag agc agc aga 174
Met Lys Ser Ser Arg
1 5
gtg att gtc acc tct act gtg gtg ctc ctg gct ttc ttg gcc atc act 222
Val Ile Val Thr Ser Thr Val Val Leu Leu Ala Phe Leu Ala Ile Thr
6 12 18
gaa ggg atg agt ctg aga agc ctt gga gtg gag ctg cac tgc cgc tgc 270
Glu Gly Met Ser Leu Arg Ser Leu Gly Val Glu Leu His Cys Arg Cys
22 28 34
att gag acg gag agc aaa ccc atc ggc cgc cac att gag aag gtg gag 318
Ile Glu Thr Glu Ser Lys Pro Ile Gly Arg His Ile Glu Lys Val Glu
38 44 50
ctg att cct gcc aac tcc cac tgc gag gag act gag ctc att gcc act 366
Leu Ile Pro Ala Asn Ser His Cys Glu Glu Thr Glu Ile Ile Ala Thr
54 60 66
ctg aag aag aca ggc caa gaa gtt tgc ctg gac ccg gag gct ccc tgg 414
Leu Lys Lys Thr Gly Gln Glu Val Cys Leu Asp Pro Glu Ala Pro Trp
70 76 82
gtc aag aaa gtc atg aac aag ttc ctg tcc aac aga aca ccc tga 459
Val Lys Lys Val Met Asn Lys Phe Leu Ser Asn Arg Thr Pro
86 92 98
acagatcggg agagatgtgt ttcatgagtc tgaacaattt caaagtacta aaaagtattt 519
atttgatagt catcacactc aatttaatac aatcaactgt caatttgatc aactgttgaa 579
aatgacaaca gaatttacca agtaaggtta tgtttgtatc aaacatgtgt gttaacaagc 639
ctgtgcttgt ttgtatgtca cttgtgtgtg ttactgtgta ttcttatcta taacttattt 699
gcttaaaata tttattgata tatttatgat gtaaatgtca attgtttagc tctgctgaca 759
accaattgat ttattaaaaa agtttaccta aaaaaaaaaaa aaa 803
<210>2
<211>99
<212>PRT
<213>花鲈(Lateolabrax Japonicus)
<400>2
Met Lys Ser Ser Arg Val Ile Val Thr Ser Thr Val Val Leu Leu
1 7 13
Ala Phe Leu Ala Ile Thr Glu Gly Met Ser Leu Arg Ser Leu Gly
16 22 28
Val Glu Leu His Cys Arg Cys Ile Glu Thr Glu Ser Lys Pro Ile
31 37 43
Gly Arg His Ile Glu Lys Val Glu Leu Ile Pro Ala Asn Ser His
46 52 58
Cys Glu Glu Thr Glu Ile Ile Ala Thr Leu Lys Lys Thr Gly Gln
61 67 73
Glu Val Cys Leu Asp Pro Glu Ala Pro Trp Val Lys Lys Val Met
76 82 88
Asn Lys Phe Leu Ser Asn Arg Thr Pro
91 97
Claims (2)
1、一种花鲈白细胞介素8基因，它的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所述。
2、一种花鲈白细胞介素8基因，它的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所述。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 200710088884 CN101063132A (zh) | 2006-05-15 | 2007-04-05 | 花鲈白细胞介素8基因序列 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 200610035460 CN1869229A (zh) | 2006-05-15 | 2006-05-15 | 花鲈白细胞介素8基因序列 |
| CN200610035460.3 | 2006-05-15 | ||
| CN 200710088884 CN101063132A (zh) | 2006-05-15 | 2007-04-05 | 花鲈白细胞介素8基因序列 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN101063132A true CN101063132A (zh) | 2007-10-31 |
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|---|---|---|---|
| CN 200710088884 Pending CN101063132A (zh) | 2006-05-15 | 2007-04-05 | 花鲈白细胞介素8基因序列 |
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|---|---|
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108424916A (zh) * | 2018-03-29 | 2018-08-21 | 中国水产科学研究院南海水产研究所 | 花鲈白细胞介素IL-12p40基因及其用途 |
| CN114539376A (zh) * | 2022-01-17 | 2022-05-27 | 中国水产科学研究院南海水产研究所 | 拟穴青蟹生物标记物cyp2基因及其在制备病理检测试剂中的应用 |
-
2007
- 2007-04-05 CN CN 200710088884 patent/CN101063132A/zh active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| CN108424916A (zh) * | 2018-03-29 | 2018-08-21 | 中国水产科学研究院南海水产研究所 | 花鲈白细胞介素IL-12p40基因及其用途 |
| CN108424916B (zh) * | 2018-03-29 | 2021-04-30 | 中国水产科学研究院南海水产研究所 | 花鲈白细胞介素IL-12p40基因及其用途 |
| CN114539376A (zh) * | 2022-01-17 | 2022-05-27 | 中国水产科学研究院南海水产研究所 | 拟穴青蟹生物标记物cyp2基因及其在制备病理检测试剂中的应用 |
| CN114539376B (zh) * | 2022-01-17 | 2023-06-13 | 中国水产科学研究院南海水产研究所 | 拟穴青蟹生物标记物cyp2基因及其在制备病理检测试剂中的应用 |
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