DE102014103107B4

DE102014103107B4 - Verfahren und kit zur extraktion von nukleinsäuren

Info

Publication number: DE102014103107B4
Application number: DE102014103107.5A
Authority: DE
Inventors: Dr. Weber Wolfgang; Christine Werner
Original assignee: IFP Privates Institut fuer Produktqualitet GmbH
Current assignee: IFP Privates Institut fuer Produktqualitet GmbH
Priority date: 2014-03-07
Filing date: 2014-03-07
Publication date: 2016-09-01
Anticipated expiration: 2034-03-08
Also published as: DE102014103107A1

Abstract

Zusammensetzung zur Verwendung beim Extrahieren und Aufreinigen von Nukleinsäuren aus Nahrungsmittelproben dadurch gekennzeichnet, dass die Zusammensetzung ein Feststoffgemisch ist, das Folgendes umfasst:
10 bis 40 Gewichtsprozent Teilchen, die aus wasserunlöslichem hydriertem Magnesiumsilikat bestehen und eine mittlere Teilchengröße von 0,8 bis 2,5 μm aufweisen; sowie
20 bis 70 Gewichtsprozent kristalline phosphatgepufferte Saline, die leicht wasserlöslich ist, wodurch eine Lösung hergestellt wird, die einen pH-Wert von 5,5 bis 7,0 bei 70 bis 95 Grad Celsius aufweist.

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolation und Aufreinigung von Nukleinsäuren aus Nahrungsmittelproben zur anschließenden Analyse, insbesondere durch PCR und eine chemische Zusammensetzung und einen Kit zur Verwendung bei der Isolation von Nukleinsäuren.
STAND DER TECHNIK
Nahrungsmittelsicherheits- und Kennzeichnungsverordnungen steigern sich mit dem Handelsvolumen. Dies stellt auch eine herausfordernde Situation für Nahrungsmittelversorgungsketten dar. Die industrielle Nahrungsmittelverarbeitung erhöht die Risiken der Verunreinigung mit Mikroorganismen und unbeabsichtigten Allergenen zusätzlich. Da Verbraucher und Regulierungsbehörden Sicherheit hinsichtlich der Produkte fordern, wird eine korrekte Angabe und Kennzeichnung der Bestandteile erforderlich, beispielsweise im Hinblick auf Spezies in verarbeiteten Gemischen von Fleisch- und Pflanzenmaterialien. Dies betrifft auch biologische Produkte wie etwa Kleidungsstücke, Textilien und Pelze, z. B. möchten viele westliche Verbraucher keine Katzenfelle tragen aufgrund von Allergien oder aus ethischen Gründen.
Die Isolierung und PCR Analyse von Nukleinsäuren ist ein gängiges Verfahren zum Nachweis und zur Identifizierung von Spezies oder unerwünschten Organismen. Gemeinhin wird die Probe biologischen Materials mechanisch aufgebrochen und durch chemische Behandlung lysiert, gefolgt von der anschließenden Aufreinigung der isolierten Nukleinsäuren. Jedoch weisen die rohen und verarbeiteten Proben sehr unterschiedliche Zusammensetzungen auf und benötigen demgemäß eine unterschiedliche Behandlung und Probenverarbeitung. Es ist schwierig im Voraus zu wissen, welche Art von Probenverarbeitung erforderlich ist, um genügend und ausreichend reine Nukleinsäuren zur weiteren PCR Analyse zu erhalten.
EP 2 634 254 B1 (QIAGEN GmbH) offenbart ein Verfahren zur Isolierung bakterieller DNA aus angereicherten Kulturen, bei dem die Probe mit einer mit Wasser nicht mischbaren Substanz gemischt wird. WO 2013/010674 A1 beschreibt ein DNA-Isolationsverfahren unter Verwendung einer Filtervorrichtung, die Bentonit zur Entfernung von Proteinen enthält. US 5 998 031 A offenbart eine gefriergetrocknete chemische Zusammensetzung als Beads, die Reagenzien enthält. Das am weitesten verbreitete Verfahren zur Isolierung genomischer DNA verwendet das kationische Tensid Hexadecyltrimethylammoniumbromid (CTAB) zum Denaturieren und zur Entfernung von Proteinen (Drábková LZ et al., DNA extraction from herbarium specimens, Methods Mol. Biol. 2014; 1115:69–84). Dieses Verfahren macht die Verwendung einer teuren und gefährlichen Chemikalie erforderlich und ist ebenfalls arbeitsaufwendig und zeitraubend. Der Stand der Technik stellt somit ein Problem dar.
KURZDARSTELLUNG DER ERFINDUNG
Die Aufgabe wird gelöst durch eine Zusammensetzung und ein Verfahren wie in den Ansprüchen 1 und 8 beschrieben. Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung werden in den abhängigen Ansprüchen 2 bis 7 und 9 bis 13 offenbart.
Die Zusammensetzung zur Verwendung beim Extrahieren und Aufreinigen von Nukleinsäuren besteht aus einem Feststoffgemisch, das 10 bis 40 Gewichtsprozent Teilchen umfasst, die aus wasserunlöslichem hydriertem Magnesiumsilikat bestehen und eine mittlere Teilchengröße von 0,8 bis 2,5 μm aufweisen; sowie 20 bis 70 Gewichtsprozent kristalliner phosphatgepufferter Saline, die leicht wasserlöslich ist, wodurch eine Lösung hergestellt wird, die einen pH-Wert von 5,5 bis 7,0 bei 70 bis 95 Grad Celsius aufweist. In einer bevorzugten Ausführungsform wurde die Zusammensetzung und das Feststoffgemisch als Tablette oder Kapsel portioniert, die ein bekanntes vorbestimmtes Gewicht aufweist, so dass es nur noch erforderlich ist, die Menge der Probe zu wiegen und nicht die Menge des Aufreinigungs- und Freisetzungsmittels. Die Zusammensetzung umfasst vorzugsweise 20 bis 35 Gewichtsprozent eines hydrophilen Kolloids, das zum Dispergieren der Feststoffe in Wasser wirksam ist. Die hydrierten Magnesiumsilikatteilchen weisen vorzugsweise eine mittlere Teilchengröße von 1,0 bis 2,0 μm, besonders bevorzugt von 1,2 bis 1,5 μm auf.
In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Offenbarung eine Tablette oder Kapsel, die im Wesentlichen eine Zusammensetzung umfasst, welche 10 bis 25 Gewichtsprozent wasserunlösliche hydrierte Magnesiumsilikatteilchen umfasst; 45 bis 70 Gewichtsprozent phosphatgepufferte Saline und 20 bis 30 Gewichtsprozent eines hydrophilen Kolloids, das zum Dispergieren des Feststoffgemischs in Wasser wirksam ist. Die Zusammensetzung kann ferner ein oder mehrere nicht-chaotropische zelllysierende Mittel umfassen. Das hydrophile Kolloid kann ausgewählt werden aus einem oder mehreren von Cellulose, Carboxymethlycellulose, Cellulosederivaten, Alginat, Stärke, Xanthankautschuk, Gummi arabicum, Guarkautschuk oder Gemischen davon.
Das offenbarte Standardverfahren zum Isolieren von DNA aus einer Vielzahl von Futter- und Nahrungsmittelproben, einschließlich von Getränken, zur anschließenden PCR Analyse, umfasst die folgenden Schritte: (i) Erhalten einer Menge der Probe von vorbestimmtem Gewicht oder Volumen, vorzugsweise als kleine Teilchen, Lösung oder Dispersion und Überführen der Probe in ein Gefäß; (ii) Zugeben einer vorbestimmten Menge des oben beschriebenen Feststoffgemischs, um ein Gewichtsverhältnis von Feststoffen zu Probe in dem Gefäß von 1:5 bis 5:1 zu erhalten; (iii) ferner Zugeben einer Menge von Wasser, um die Pufferkomponenten des Feststoffgemischs zu lösen, um eine wässrige phosphatgepufferte Salinelösung zu erhalten, die einen pH-Wert von 5,5 bis 7,0 aufweist und eine Salzkonzentration von 0,6 bis 1,2 Mol/l, (iv) Erhalten einer Dispersion der Probe und des Feststoffgemischs in phosphatgepufferter Saline und Erhitzen der Lösung oder Dispersion für 1 Minute bis 30 Minuten auf eine Temperatur von bis zu 70 bis 95 Grad Celsius, vorzugsweise für etwa 5 Minuten bis 20 Minuten, um die Nukleinsäuren aus den zellulären Materialien und anderen wasserunlöslichen Komponenten der Probe freizusetzen; (v) Trennen der wasserunlöslichen Komponenten der Probe und des Feststoffgemischs von der wässrigen Phase, vorzugsweise durch Zentrifugation oder Filtration, gemeinsam mit den auf den Magnesiumsilikatteilchen des Feststoffgemischs adsorbierten Komponenten; (vi) Entfernung des wässrigen Überstands oder Filtrats, das die löslichen Nukleinsäuren enthält, gefolgt von einem Entsalzungsschritt, um eine Lösung der Proben-DNA zu erhalten, die zur PCR-Analyse geeignet ist. Ein Fachmann wird verstehen, dass einer oder mehrere Schritte in diesem Verfahren austauschbar sind ohne vom offenbarten Aufreinigungsprinzip abzuweichen.
Eine weitere Ausführungsform betrifft einen Kit zum Extrahieren und Aufreinigen von Nukleinsäuren aus Proben, der portionierte Mengen der offenbarten Zusammensetzung und des Feststoffgemischs umfasst. Die Zusammensetzung, das Verfahren und der Kit können zum Isolieren und Charakterisieren der Art von Nukleinsäure aus rohen und/oder verarbeiteten Tier- und Pflanzenmaterialien und verarbeiteten Produkten davon verwendet werden. Sie sind insbesondere nützlich zum Isolieren von Nukleinsäuren, die für potenzielle Allergene charakteristisch sind, welche in Getreiden und deren Produkten vorkommen, Kichererbse und deren Produkten, Casein, Mandel und deren Produkten, Cashew und deren Produkten, Erdnuss und deren Produkten, Haselnuss und deren Produkten, Macadamia und deren Produkten, Senf und dessen Produkten, Soja und dessen Produkten, Sesam und dessen Produkten, Walnuss und deren Produkten, Pistazie und deren Produkten, Lupine und deren Produkten, Sellerie und dessen Produkten, Fisch und dessen Produkten, Krebstieren und deren Produkten. Sie sind ferner nützlich zum Isolieren von Nukleinsäuren, die für genetisch modifizierte Organismen, Krankheitserreger, Salmonella spp., Listeria spp., Shigella spp., Campylobacter spp., Cronobacter spp., Clostridium spp., Legionella spp., Enterobacteriaceae, Escherichia spp. charakteristisch sind.
In einer weiteren Ausführungsform können die Zusammensetzung, das Verfahren und der Kit zur Isolierung von Nukleinsäuren aus Fäkalproben verwendet werden, vorzugsweise menschlichen und tierischen Fäkalproben.
Die Zusammensetzung zum Extrahieren und Aufreinigen von Nukleinsäuren aus Nahrungsmittelproben kann 10 bis 40 Gewichtsprozent wasserunlösliche hydrierte Magnesiumsilikatteilchen umfassen; 20 bis 70 Gewichtsprozent kristalline phosphatgepufferte Saline, die in Wasser löslich ist, wodurch effektiv eine Lösung hergestellt wird, die einen pH-Wert von 5,5 bis 7,0 aufweist; sowie 20 bis 35 Gewichtsprozent eines hydrophilen Kolloids, das in Kontakt mit Wasser anschwillt und zum Dispergieren des Feststoffgemischs in Wasser wirksam ist. Das verwendete hydrierte Magnesiumsilikat kann eine mittlere Teilchengröße von 1,2 μm und eine Dichte von 2,8 g/cm³ aufweisen. In einer bevorzugten Ausführungsform kann das Feststoffgemisch eine Tablette oder Kapsel sein, so dass das Lösen des Feststoffgemischs in einer wässrigen Lösung zu einer 5- bis 7-fach phosphatgepufferten Saline führt, die einen pH-Wert von 5,5 bis 7 bei etwa 70 bis etwa 95 Grad Celsius aufweist.
Ein Aspekt der vorliegenden Offenbarung betrifft ein Verfahren zum Aufreinigen von genomischer DNA aus Nahrungsmittelproben, das die folgenden Schritte umfasst: i) Erhalten einer vorbestimmten Menge einer Nahrungsmittelprobe; ii) Überführen der Nahrungsmittelprobe in ein Reaktionsgefäß; ii) Hinzufügen des Feststoffgemischs der vorliegenden Offenbarung zu der Nahrungsmittelprobe, wobei das Feststoffgemisch phosphatgepufferte Saline umfasst, die in Wasser löslich ist, wodurch effektiv eine Lösung hergestellt wird, die einen pH-Wert von 5,5 bis 7,0 aufweist; iv) Hinzufügen einer vorbestimmten Menge von Wasser; v) Mischen der Probe und des Feststoffgemischs, wobei der Inhalt der Tablette freigesetzt wird, wodurch eine Lösung hergestellt wird, die eine Konzentration von 5 bis 7 X phosphatgepufferter Saline aufweist; vi) Erhitzen des Reaktionsgefäßes auf eine Temperatur zwischen 70 und 95 Grad Celsius; und vii) Extrahieren von Nukleinsäuren aus der Nahrungsmittelmatrix gefolgt von einer Wiedergewinnung der extrahierten Nukleinsäuren; wobei die Nahrungsmittelmatrix mit der die Nukleinsäuren extrahierenden Zusammensetzung in Schritt vi) über einen Zeitraum inkubiert wird, der genügt, um die Nukleinsäuren zu extrahieren.
Die Offenbarung betrifft ferner ein Verfahren zum Herstellen einer Nukleinsäureextraktionszusammensetzung, das die folgenden Schritte umfasst: i) Bereitstellen eines teilchenförmigen Feststoffgemischs von 10 bis 40 Gewichtsprozent wasserunlöslichen hydrierten Magnesiumsilikatteilchen; und von 20 bis 70 Gewichtsprozent kristalliner phosphatgepufferter Saline; ii) Hinzufügen von 20 bis 35 Gewichtsprozent eines hydrophilen Kolloids zu dem teilchenförmigen Gemisch; iii) Pressen des teilchenförmigen Gemischs zusammen mit dem hydrophilen Kolloid zu einer Tablette oder Kapsel; und wahlweise Beschichten der Tablette oder Kapsel mit einem Film.
In einem weiteren Aspekt stellt die Offenbarung einen Kit bereit zum Extrahieren und Aufreinigen von Nukleinsäuren aus Nahrungsmittelproben, der Folgendes umfasst: i) eine Tablette oder Kapsel, welche die erfindungsgemäße Zusammensetzung aufweist; und wahlweise ein oder mehrere Reaktionsgefäße mit festen oder flüssigen Reagenzien.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform können das Verfahren und der Kit verwendet werden, um Nukleinsäuren aus Allergenen zu extrahieren ausgewählt aus Getreiden und deren Produkten, Kichererbse und deren Produkten, Casein, Mandel und deren Produkten, Cashew und deren Produkten, Erdnuss und deren Produkten, Haselnuss und deren Produkten, Macadamia und deren Produkten, Senf und dessen Produkten, Soja und dessen Produkten, Sesam und dessen Produkten, Walnuss und deren Produkten, Pistazie und deren Produkten, Lupine und deren Produkten, Sellerie und dessen Produkten, Fisch und dessen Produkten, Krebstieren und deren Produkten. In einer weiteren Ausführungsform können das Verfahren und der Kit zum Extrahieren von Nukleinsäuren aus genetisch modifizierten Organismen verwendet werden.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform betrifft die Verwendung der Zusammensetzung der vorliegenden Offenbarung zur Analyse von Nukleinsäuren durch Polymerasekettenreaktion.
Durch Zugabe einer einzelnen Tablette, die das Feststoffgemisch der vorliegenden Offenbarung umfasst und von 70 bis 95°C heißem Wasser besteht kein weiterer Bedarf für zusätzliche Enzyme, organische Lösemittel, Tenside, etc., um einen Bruch der Probenmatrix zu erhalten. Die Tablette oder Kapsel der Zusammensetzung kann mit sämtlichen getesteten Nahrungsmittelmatrices verwendet werden, da die hohe osmotische Kraft aufgrund der großen Menge von Salz in Kombination mit hohen Temperaturen, zu einer Freisetzung von Nukleinsäuren aus allen biologischen Matrices führt. Der leicht saure Phosphatpuffer stabilisiert andererseits die Nukleinsäureketten selbst in wässrigen Lösungen von bis zu 95 Grad Celsius. Besonders bedeutsam ist, dass ein Verfahren mit allen Arten von biologischen Matrices verwendet werden kann, die so unterschiedlich sein können wie Leder, Pelze, Textilien, Schokolade, Getreide, Nuss enthaltende Materialien, Fleisch, etc. Dies ist besonders für die vielen verarbeiteten Nahrungsmittel- und Schokoladeriegel von Bedeutung.
Ein bedeutender Vorteil ist die Etablierung einer Routineprozedur bei der Analyse von Proben mit unterschiedlichen physikalisch-chemischen Eigenschaften, wie etwa Nahrungsmitteln, die reich an Lipiden (Schokolade/Nusscremes), Proteinen (Fleisch), Polysacchariden (Getreide) sind und insbesondere Gemischen davon. Es ist nicht mehr erforderlich, das Verfahren der Nahrungsmittelmatrix anzupassen, was wiederum Laborerfahrung und zusätzliche Ausrüstung erfordert. Mittels der vorliegenden Offenbarung ist somit jedermann ohne Laborerfahrung in der Lage, eine Extraktion von Nukleinsäuren aus einer beliebigen biologischen Probe durchzuführen, selbst wenn die Proben unterschiedlichen Ursprungs sind. Eine vollständige Standardisierung der Nukleinsäureextraktion aus nahezu jeder beliebigen biologischen oder Nahrungsmittelmatrix wird mit der offenbarten Zusammensetzung (Tablette) und dem offenbarten Verfahren erzielt.
Die herkömmliche CTAB- oder organische Lösemittelextraktion geht ferner einher mit Gesundheitsrisiken aufgrund der organischen Lösemittel und Tenside. Darüber hinaus erfordern die herkömmlichen Verfahren eine vollständige Entfernung von hinzugefügten Lösemitteln, Reagenzien und Tensiden, um eine Wechselwirkung mit der Polymerasekettenreaktion zu vermeiden. Diese umfassen ionische Detergenzien wie etwa Natriumdeoxycholat, Sarkosyl und SDS, Ethanol und Isopropanol, Phenol und weitere. Arten biologischer Proben, die dafür bekannt sind, Inhibitoren zu enthalten, umfassen Blut, Stoffe, Gewebe und Erde. Typische PCR-Inhibitoren, die in biologischen Proben endogen vorkommen, sind Gallensalze (Faeces), komplexe und andere Polysaccharide (Faeces, Pflanzenmaterialien), Kollagen, Myoglobin, Hämoglobin, Immunglobuline und Häm (Fleisch und Blut), Huminsäure (Erde, Pflanzenmaterialien), Melanin und Eumelanin (Haar, Haut), Calciumionen und Proteinasen (Milch, Knochen). Die vorliegende Offenbarung überwindet die gemeinhin mit diesen endogenen und zugesetzten PCR-Inhibitoren verknüpften Probleme erstens dadurch, dass kein organisches Lösemittel oder Tensid erforderlich ist und zweitens durch Entfernung dieser Inhibitoren gemeinsam mit den hydrierten Magnesiumsilikatteilchen. Ohne darauf festgelegt sein zu wollen, wird angenommen, dass der offenbarte Hitzeschritt zu einer vollständigen Denaturierung von proteinartigen Polymeraseinhibitoren führt, wohingegen hydrophobe, lipophile und saure Inhibitoren auf den Magnesiumsilikatteilchen adsorbiert werden. Das Silikatpulver wirkt als Stabilisator für genomische DNA und bindet mindestens einen Teil von Lipiden, Proteinen, Polysacchariden und Salzen, die in der Matrix enthalten sind, wodurch diese präzipitiert und aus der die genomische DNA enthaltenden Fraktion entfernt werden.
Die Auswertung des Nukleinsäuregehalts und/oder des Vorkommens von Inhibitoren in einer Probe wird auf Basis des Ct-Werts vorgenommen, der durch quantitative Echtzeit-Polymerasekettenreaktion erhalten wird. Niedrigere Ct-Werte zeigen an, dass die DNA-Polymerase weniger Zyklen benötigt, um die Ziel-DNA in der Probe zu amplifizieren. Das Verfahren und der Kit der Offenbarung erlauben eine schnelle, sichere und wirtschaftlich vorteilhafte Nukleinsäureextraktion aus Nahrungsmittelmatrices ohne die Nachteile herkömmlicher Vorgehensweisen.
Wie erwähnt ist das Puffermittel für das Erzeugen eines osmotischen Schocks verantwortlich, der das Cytoplasma und insbesondere den Zellkern zwingt, seinen Inhalt in das Extraktionsmedium freizusetzen, wodurch die Unversehrtheit für eine anschließende Analyse beibehalten wird. Ein Entsalzungsschritt wird daher vor der PCR-Analyse empfohlen, um die Salzkonzentration in der Reaktion zu senken. Dies kann durch Größenausschlusschromatographie, Ultrafiltration oder herkömmliche DNA-bindende Chromatographie vorgenommen werden. Alternativ kann die PCR-Probe auch einfach verdünnt werden, um die Salzkonzentration auf akzeptable Niveaus zu senken.
Weitere Vorteile, Ziele und Ausführungsformen der Erfindung werden aus den angefügten Zeichnungen, stellvertretenden Beispielen und Ansprüchen deutlich. Die Erfindung soll jedoch nicht auf die Beispiele begrenzt werden, sondern wurde in den Ansprüchen definiert.
KURZDARSTELLUNG DER ZEICHNUNGEN
In den Zeichnungen ist:
1 ein Diagramm, das einen Vergleich des Schwellenwerts des Zyklus zum Nachweis von Senf durch PCR in Proben mit bekannten Mengen von Senf zeigt (log ppm).
2 ein Diagramm, das den Vergleich des Schwellenwerts des Zyklus zum Nachweis von gelbem Senf durch PCR in Proben mit bekannten Mengen von gelbem Senf zeigt (log ppm).
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die Zusammensetzung zur Verwendung bei der Extraktion und Aufreinigung von Nukleinsäuren aus Nahrungsmittelproben ist ein Feststoffgemisch, das 10 bis 40 Gewichtsprozent wasserunlösliche hydrierte Magnesiumsilikatteilchen umfasst, die eine mittlere Teilchengröße von 0,8 bis 2,5 μm aufweisen sowie 20 bis 70 Gewichtsprozent kristallines Salz, welches leicht wasserlöslich ist, wodurch ein Salinephosphatpuffer gebildet wird, der einen pH-Wert von 5,5 bis 7,0 bei 70 bis 95 Grad Celsius aufweist. Ein Feststoffgemisch ist eine Kombination von Feststoffsubstanzen in Form von Pulver, Granula, Teilchen oder Kristallen ohne ein flüssiges Lösemittel. Das wasserunlösliche hydrierte Magnesiumsilikat ist vorzugsweise ein hydriertes Magnesiumsilikat oder Feintalkum in der Form eines feinen Talkumpulvers oder fein granuliert. Das hydrierte Magnesiumsilikatpulver kann eine mittlere Teilchengröße im Bereich von 1,0 bis 2,0 μm aufweisen, vorzugsweise von 1,2 bis 1,5 μm; einen mittleren Durchmesser D₅₀ im Bereich von 0,8 bis 2,5 μm; und eine Dichte von 2,6 bis 2,8 g/cm³. Das unlösliche Silikatpulver weist somit eine große Oberfläche zur Adsorption von Lipiden, komplexen Zuckern und weiteren potentiellen Polymeraseinhibitoren auf.
Das Phosphatpuffersalz kann im Feststoffgemisch als feine Kristalle oder in granulierter Form vorliegen und seine Zusammensetzung ist vorzugsweise wie folgt: NaCl 137 mmol/l, Na₂HPO₄·2H₂O 10 mmol/l, KCl 2,7 mmol/l, KH₂PO₄ 2 mmol/l. Das Phosphatpuffersalz ergibt nach dem Lösen eine hypertonische Lösung, so dass die Nukleinsäuren aus der biologischen Probe auch durch den resultierenden osmotischen Schock freigesetzt werden. Die Zusammensetzung der phosphatgepufferten Saline ist vorzugsweise dergestalt, dass sie einen pH-Wert von 5,5 bis 7 bei einer Wassertemperatur von 70 bis 95 Grad Celsius ergibt.
Die Teilchen des Feststoffgemischs können gepresst oder komprimiert und portioniert werden, um eine Tablette zu erhalten. Eine Tablette besteht nur aus dem Feststoffgemisch. Eine Kapsel kann aus Gelatine hergestellt und mit dem Feststoffgemisch gefüllt werden, ohne gepresst zu werden. Das Komprimieren der Zusammensetzung kann durch jede herkömmliche, dem Fachmann bekannte Vorrichtung zur Tablettenkomprimierung durchgeführt werden.
Das quellbare hydrophile Kolloid kann in dem Gemisch in granulierter oder mikrokristalliner Form vorliegen. Geeignetes quellbares Material zum schnellen Lösen des Tabletten- oder Kapselpulvers kann ausgewählt werden aus Cellulose, Carboxymethylcellulose, Cellulosederivaten, Alginat, Stärke, Xanthankautschuk, Gummi arabicum, Guarkautschuk oder Gemischen davon. Das quellbare hydrophile Kolloid kann sowohl das Komprimieren der Zusammensetzung erleichtern als auch das Dispergieren des Feststoffgemischs bei Kontakt mit Wasser. Das quellbare Material muss frei von Verunreinigungen sein, insbesondere tierischen Nukleinsäuren, genetisch modifizierten Organismen und Allergenen. Darüber hinaus kann die Tablette ein oder mehrere nichtchaotropische Detergenzien und hitzestabile Enzyme enthalten. Die Tablette kann wahlweise mit einem Film beschichtet sein, der vorzugsweise aus Cellulose hergestellt ist, vorzugsweise Cellulosederivaten, besonders bevorzugt Hydroxypropylmethylcellulose (HPMC), um keine Feuchtigkeit eindringen zu lassen und Tablettenbruch zu vermeiden.
Die Tablette oder Kapsel kann ein Feststoffgemisch umfassen, das aus 10 bis 25 Gewichtsprozent wasserunlöslichen hydrierten Magnesiumsilikatteilchen besteht; 45 bis 70 Gewichtsprozent phosphatgepufferter Saline und 20 bis 30 Gewichtsprozent eines quellbaren hydrophilen Kolloids, das zum Fördern des Dispergierens des Feststoffgemischs in Wasser wirksam ist.
Das Standardverfahren der Isolierung von DNA aus einer Vielfalt von Proben zur anschließenden PCR-Analyse kann die folgenden Schritte umfassen: es wird eine vorbestimmte Gewichts- oder Volumenmenge von 10 bis 100 g (ml) der Probe unter Verwendung einer Waage oder Pipette vorbereitet. Die Probe kann vorzugsweise aufgetrennt werden unter Verwendung einer Mühle oder eines Mixers, was zu kleinen Teilchen, einer Lösung oder Suspension führt. Ein Anteil von 50 mg bis 5 g der aufgetrennten Probe kann unter Verwendung einer Waage abgewogen und mit einem Spatel in ein Gefäß überführt werden, der einen sicheren Verschluss aufweist, um Kontamination und Verschütten zu vermeiden. Eine vorbestimmte Menge des Feststoffgemischs von 50 mg bis 1 g kann der Probe hinzugefügt werden, um ein Gewichtsverhältnis von Feststoffen im Gefäß von 1:5 bis 5:1 von Feststoffgemisch zu Probe zu erhalten. Daraufhin kann eine Menge von Wasser hinzugefügt werden, die zuvor auf eine Temperatur von 70 bis 95 Grad Celsius in einem Kocher erhitzt wurde, um die Pufferbestandteile des Feststoffgemischs zu lösen, damit eine wässrige phosphatgepufferte Salinelösung erhalten wird, die einen pH-Wert von 5,5 bis 7,0 und eine Salzkonzentration von 0,6 bis 1,2 Mol/l aufweist. Die Dispersion der Probe und des Feststoffgemischs in phosphatgepufferter Saline kann durch vortexen oder schütteln der Probe von 1 Sekunde bis 120 Sekunden erhalten werden. Alternativ kann ein Mixer verwendet werden, vorzugsweise ein Kolbenmixer. Die Lösung oder Dispersion kann auf eine Temperatur von 70 bis 95 Grad Celsius erhitzt werden unter Verwendung eines Wasserbads, eines Thermoblocks, eines Ofens oder jeder beliebigen anderen Heizeinheit wie etwa einer Mikrowelle. Die Temperaturbehandlung kann 1 Minute bis 30 Minuten lang dauern, vorzugsweise etwa 5 Minuten bis 20 Minuten, um die Nukleinsäuren aus dem Zellmaterial und anderen wasserunlöslichen Bestandteilen der Probe freizusetzen. Aufgrund des Salz- und Phosphatüberschusses zeigte selbst eine ausgedehnte Behandlung der Nukleinsäuren bei 95 Grad Celsius keine merkliche unerwünschte Auswirkung auf die Stabilität der DNA, wenn sie anschließend durch PCR getestet wurde. Eine Freisetzung von Nukleinsäuren wird als geschehen erachtet, wenn Zellstrukturen (Membranen, Organellen, etc.) so zerstört sind, dass eine Wechselwirkung von Nukleinsäuren mit Strukturproteinen, Lipiden und Polysacchariden nicht länger auftritt. Der durch die hypertonische Lösung erzeugte osmotische Unterschied fördert ebenfalls die Freisetzung der Nukleinsäuren aus den Zellkernen. Die hohen Temperaturen zerstören nicht nur Zellwände und führen zu einer Denaturierung von Proteinen, sie verursachen auch eine höhere Löslichkeit von Lipiden und Polysacchariden, die jedoch in einem bindenden Zustand auf den wasserunlöslichen Magnesiumsilikatteilchen adsorbiert und präzipitiert werden. Zumindest werden sie vornehmlich von den wasserunlöslichen hydrierten Magesiumsilikatteilchen gebunden und weniger von Innenwänden des Gefäßes. Eine Trennung des Feststoffgemischs von der wässrigen Phase gemeinsam mit den wasserunlöslichen Komponenten kann vorzugsweise mittels Zentrifugation durchgeführt werden (z. B. Tischzentrifuge) oder durch Filtration (z. B. Cellulosefilter). Der wässrige Überstand oder Filtrat, das die von DNA-Polymeraseinhibitoren freien Nukleinsäuren enthält, kann in ein sauberes Gefäß pipettiert oder dekantiert werden.
Dem Standardverfahren der Nukleinsäureisolierung folgt dann gewöhnlich ein Entsalzungsschritt, der unter Verwendung von Größenausschlusschromatographie, Ultrafiltration oder Affinitätschromatographie vorgenommen werden kann, wie etwa einer im Handel erhältlichen Nukleinsäureextraktionssäule auf Kieselerdebasis. Alternativ kann die Nukleinsäureprobe verdünnt werden, so dass die Salzkonzentration auf vertretbare Niveaus gesenkt wird und die Probe für eine PCR-Analyse geeignet ist.
Ein weiterer Aspekt betrifft einen Kit zur Extraktion und zum Nachweis von Nukleinsäuren aus einer Nahrungsmittelprobe und dieser kann eine Tablette umfassen, die eine bekannte Menge einer gebrauchsfertigen Zusammensetzung (Feststoffgemisch) zum Extrahieren von Nukleinsäuren gemäß der vorliegenden Offenbarung umfasst sowie wahlweise ein oder mehrere Reaktionsgefäße mit festen oder flüssigen Reagenzien.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Offenbarung können die Zusammensetzung, das Verfahren und der Kit für die Nukleinsäureextraktion zum Isolieren und Charakterisieren von Nukleinsäuren aus rohen und/oder verarbeiteten Tier- und Pflanzenmaterialien und verarbeiteten Produkten davon verwendet werden. Rohes Tier- und Pflanzenmaterial bedeutet Teile oder Fragmente der Organismen von denen sie stammen, ohne zuvor eine mechanische Zerlegung, chemische oder thermische Behandlung zu erfahren. Verarbeitetes Tier- und Pflanzenmaterial und Produkte davon bedeutet Material, das mechanisch zerlegt und/oder chemisch oder thermisch behandelt wurde, so dass seine ursprüngliche Form und physikalischen Eigenschaften verändert wurden.
In einer weiteren Ausführungsform können die Zusammensetzung, das Verfahren und der Kit für die Nukleinsäureextraktion zum Isolieren von Nukleinsäuren verwendet werden, die charakteristisch sind für potentielle Allergene, welche vorkommen in Getreiden und deren Produkten, Kichererbse und deren Produkten, Casein, Mandel und deren Produkten, Cashew und deren Produkten, Erdnuss und deren Produkten, Haselnuss und deren Produkten, Macadamia und deren Produkten, Senf und dessen Produkten, Soja und dessen Produkten, Sesam und dessen Produkten, Walnuss und deren Produkten, Pistazie und deren Produkten, Lupine und deren Produkten, Sellerie und dessen Produkten, Fisch und dessen Produkten, Krebstieren und deren Produkten. Tiere, Pflanzen oder Mikroorganismen sind Quellen für biologische Allergene. Die Zusammensetzung, das Verfahren und der Kit können ferner zum Isolieren von Nukleinsäuren verwendet werden, die für genetisch modifizierte Organismen, Krankheitserreger, Salmonella spp., Listeria spp., Shigella spp., Campylobacter spp., Cronobacter spp., Clostridium spp., Legionella spp., Enterobacteriaceae, Escherichia spp. charakteristisch sind. Ein genetisch modifizierter Organismus (GMO) ist ein Organismus wie etwa Bakterien, Hefe, Pflanzen, Fisch und Säugetiere, dessen genetisches Material unter Verwendung gentechnologischer Techniken verändert wurde. Ein Krankheitserreger ist jeder Organismus wie etwa Bakterien, Pilze oder Protozoen, der eine Krankheit in seinem Wirtsorganismus verursachen kann.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform können die Zusammensetzung, das Verfahren und der Kit für die Nukleinsäureextraktion zur Isolierung von Nukleinsäuren aus Fäkalproben verwendet werden, vorzugsweise menschliche und tierische Fäkalproben.
Der Nachweis und die Quantifizierung fremden Materials in Nahrungsmittelproben durch Polymerasekettenreaktion ist dem Fachmann bekannt. Die Aufreinigung von Nukleinsäuren aus komplexen Matrices erforderte jedoch die Zugabe zahlreicher störender Enzyme, organischer Lösemittel und Tenside. Ausreichend reine DNA bedeutet hier ”frei von DNA-Polymerase spezifischen Inhibitoren”, so dass eine Amplifikation der extrahierten DNA erhalten wird. Die DNA Extraktions- und Aufreinigungsleistung kann durch den sogenannten Zyklusschwellenwert (Ct) beschrieben werden, welcher die Anzahl der zum Amplifizieren einer Matrizen-DNA in der Probe auf Detektionsniveau benötigten Polymerasereaktionen darstellt. Niedrigere Ct-Werte bedeuten weniger benötigte Zyklen zum Amplifizieren der Matrizen-DNA und somit eine höhere Nachweisempfindlichkeit.
Über die Analyse von Nahrungsmittelproben hinaus, ist ein Nachweis von Haustierfellen (d. h. Katzen, Hunde) in falsch ausgezeichneten Bekleidungsprodukten ebenfalls möglich. Auch weitere feste Materialien (z. B. Textilien, Wischgewebe) können wirkungsvoll einer beschriebenen Nukleinsäureextraktion unterzogen werden. Die Zusammensetzung, das Verfahren und der Kit der Offenbarung können durchweg auf alle Arten von Nahrungsmittelproben angewendet werden, wodurch die Schritte der Nukleinsäureextraktion beträchtlich verringert als auch Pipettierfehler und Verunreinigungen minimiert werden. Am allerwichtigsten ist, dass sie somit bei unbekannten Probenmatrices angewendet werden können und es nicht länger erforderlich ist, unterschiedliche Nukleinsäureaufreinigungsverfahren für die Vielfalt von Proben zu verwenden. Mit anderen Worten muss das Verfahren nicht mehr im Vorfeld bei einer Probe getestet werden. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung ist empfindlich und reproduzierbar für unterschiedliche Laboratorien und Proben als auch unterschiedliche PCR-Reaktionen, was das Aufstellen von Standardkurven zur Nukleinsäurebestimmung von Tieren, Pflanzen, Bakterien, genetisch modifizierten Organismen und Allergenen in einer Probe gestattet.
Weitere Ausführungsformen, Gegenstände und Vorteile der Erfindung werden beim Studium der unten angeführten Beispiele ersichtlich.
BEISPIELE
Beispiel 1 – Zusammensetzung zur DNA Extraktion und Salz-/Talkumtablette
Talkum in Pulverform von Arzneimittelqualität wurde bei der Herstellung der DNA-Extraktionstabletten verwendet. Das Talkum wies eine mittlere Teilchengröße von 1,2 μm, einen mittleren Durchmesser D₅₀ von 0,65 μm und eine Dichte von 2,8 g/cm³ auf. Das Talkumpulver (hydriertes Magnesiumsilikat) wies die folgende Zusammensetzung auf: SiO₂ (61,5%), MgO (31,0%), CaO (0,4%), Fe₂O₃ (0,6%), Al₂O₃ (0,5%) mit einem pH-Wert von 8,8. Die zweite Komponente war phosphatgepufferte Saline nach Dulbecco (1 × PBS = NaCl 137 mmol/l, Na₂HPO₄·2H₂O 10 mmol/l, KCl 2,7 mmol/l, KH₂PO₄ 2 mmol/l) und als mikrokristallines Salz hinzugefügt. Quellbare mikrokristalline Cellulose von Arzneimittelqualität frei von Verunreinigungen wurde als Zerfallsmittel verwendet. Alle drei Komponenten wurden zu einer Tablette gepresst unter Verwendung einer Stempelpresse. Die ”Salz” tablette wies ein Gesamteinheitsgewicht von 117 mg auf und bestand aus Talkumteilchen: 20 mg (17,1%); kristallinem PBS Salz; 68 mg (58,1%); quellbarer Cellulose: 29 mg (24,8%). Die Tablette wurde abgemessen zur Extraktion von Nahrungsmittelproben, die etwa 200 mg aufweisen.
Beispiel 2 – DNA-Extraktion aus komplexen Nahrungsmittelproben (”Salzprotokoll”)
DNA-Extraktion: 10 g Probe (Bockwurst mit Hülle, Farmerfrühstück (Art von Schinken), rote Wurst, Pizza Salami, Bolognese Soße, geräucherte Wurst, Hühner Cordon Bleu, Hühnernudelsuppe und Tiernahrung) wurden erhalten und mechanisch unter Verwendung eines Mahlwerks (Mixer) mit rotierenden Messern homogenisiert. Als die zermahlene Probe flüssig wurde, wurde sie weiter homogenisiert unter Verwendung eines Glashomogenisators mit einem Kolben. 200 mg homogene Probe wurden in ein 2 ml Eppendorf-Gefäß unter Verwendung einer Pipette oder eines Spatels überführt. Eine (1) Probenextraktionstablette aus Beispiel 1 wurde gemeinsam mit 1 ml destilliertem Wasser hinzugefügt. Die PBS-Konzentration in der resultierenden Probenlösung war etwa 5-fach. Das Gefäß wurde 5 Sekunden lang gevortext und 20 Minuten lang in ein Wasserbad bei 95 Grad Celsius gestellt. Nach einer Zentrifugation von 5 min. bei RT und 14000 UPM wurde das Pellet mit dem Präzipitat verworfen und der klare Überstand für weitere Analysen verwendet.
Entsalzen: Der Überstand wurde unter Verwendung einer DNA-Affinitätssäule (Centrispin, Genaxxon) gemäß der Anleitungen des Herstellers entsalzt. Kurz gesagt wurden 100 μl Überstand 500 μl Bindungspuffer hinzugefügt und das Volumen (600 μl) auf eine äquilibrierte DNA Spinsäule geladen, gefolgt von 14000 UPM bei RT für 2 Minuten. Der Durchlauf wurde verworfen, die Säule mit 700 μl gewaschen und die Proben-DNA mit 50 μl Elutionspuffer eluiert.
Beispiel 3 – Herkömmliche CTAB DNA-Extraktion
Zu Vergleichszwecken wurden dieselben homogenisierten Proben auch einer DNA-Extraktion unter Verwendung des CTAB DNA-Extraktionsprotokolls unterzogen. Hierzu wurden 100 ml CTAB Lysepuffer hergestellt durch Mischen von 2,0 g CTAB (Hexadecyltrimethlyammoniumbromid), 10,0 ml 1M Tris pH 8,0, 4,0 ml 0,5M EDTA pH 8,0, 28,0 ml 5M NaCl, 40,0 ml H₂O. Der pH-Wert wurde mit HCl auf pH 8,0 eingestellt und destilliertes Wasser bis zu einem Volumen von 100 ml hinzugefügt. 2 g homogenisierte Probe wurden mit 10 ml CTAB Lysepuffer und 25 μl Proteinase K (20 mg/ml) gemischt und über Nacht bei 60 Grad Celsius unter leichtem Schütteln inkubiert. Nach einer Zentrifugation bei 4000 g, RT für 5 Minuten wurde das erste Pellet verworfen und der Überstand erneut bei 14000 g, RT 10 Minuten lang zentrifugiert. Der Überstand wurde daraufhin mit dem gleichen Volumen Chloroform extrahiert. 600 μl wässrige Phase wurden mit 1,2 ml CTAB Präzipitationspuffer (5 g/l CTAB, 0,04 mol/l NaCl) gemischt, die DNA bei RT 60 Minuten lang gefällt, gefolgt von einer Zentrifugation bei 14000 g, bei Umgebungstemperatur für 10 Minuten. Der Überstand wurde verworfen und das DNA-Pellet in 350 μl 1,3 mol/l NaCl Lösung aufgenommen. Nach einer weiteren Extraktion mit 350 μl Chloroform wurde die DNA in der wässrigen Phase erneut mit Isopropanol bei Raumtemperatur 20 Minuten lang gefällt. Nach einer Zentrifugation wurde der Überstand verworfen und das DNA-Pellet Spin-gewaschen mit 500 μl kaltem 70% Ethanol und bei Umgebungstemperatur getrocknet. Das getrocknete DNA Pellet wurde in 100 μl 0,1 × TE gelöst. RT-PCR und Ct-Wert Bestimmung wurden wie in Beispiel 2 beschrieben durchgeführt.
Beispiel 4 – Echtzeit-PCR, Ct-Wert und Messung der PCR-Inhibition
RT-PCR wurde unter Verwendung des RotorGene Instruments (Qiagen) gemäß der Anleitungen des Herstellers durchgeführt. Die PCR wurde in einem 20 μl Volumen durchgeführt, das 10 μl 2 × SensiFast^TM Multiplex Master Mix (Bioline GmbH, Luckenwalde, DE), 200 nM Referenz-DNA, 400 nM Primer und 10 μl DNA-Extrakt umfasst. Der SensiFast^TM Multiplex Master Mix besteht aus einem Puffersystem, Mg²⁺, allen vier dNTPs und DNA-Polymerase. Der PCR-Thermocycler wurde derart programmiert, dass er einen anfänglichen Inkubationsschritt bei 95°C für 5 Min. aufweist, gefolgt von 45 Zyklen Inkubation bei 95°C für 15 Sek., 60°C für 15 Sek. und 72°C für 10 Sek. Die PCR wurde in Duplikaten durchgeführt. Der Ct-Wert wurde mit der RotorGene Software unter Verwendung eines Schwellenwerts von 0.02 bestimmt.
Zum Messen der PCR-Inhibition (Inhibitionskontrolle) wurden 2 ng DNA, die gemäß Beispiel 2 (”Salz”) oder dem herkömmlichen Beispiel 3 (CTAB) aus Schwein, Rind, Huhn, Truthahn, Wiederkäuer, etc. extrahiert und präpariert wurden, in ein Volumen von 10 μl ohne Primer gegeben. Ansonsten wurden spezifische Primer zum Nachweis der Ziel-DNA aus Schwein, Rind, Huhn, Truthahn, Wiederkäuer hinzugefügt.

Die relative PCR-Inhibition durch die Probe kann dann den Ct-Werten der Referenz-DNA Amplifikation (Inhibitionskontrolle) entnommen werden. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt. TABELLE 1

		Testsystem	Testsystem	Inhibitionskontrolle	Inhibitionskontrolle
Matrix	Spezies	Ct Salz	Ct CTAB	Ct Salz	Ct CTAB
Bockwurst in Hülle	Schwein	18,13	22,20	30,35	29,55
Farmerfrühstück	Schwein	18,93	23,04	29,49	29,39
Rote Wurst	Schwein	20,86	24,99	31,76	29,75
Pizza Salami	Schwein	19,83	22,01	28,32	28,23
Bolognesesoße	Rind	31,32	34,97	30,61	30,80
Geräucherte Wurst	Rind	22,65	25,84	30,41	30,95
Hühner Cordon Bleu	Huhn	20,71	21,73	28,52	29,70
Hühnersuppe (Hühnernudelsuppe)	Huhn	20,00	22,12	28,81	28,57
Hühner Cordon Bleu	Truthahn	20,09	21,84	28,83	28,85
Tierfleisch	Wiederkäuer	32,79	32,26	31,36	31,49

Die Inhibitionskontrollexperimente zeigen sehr ähnliche Ct-Werte unabhängig von der Probenmatrix, aus der die Probe präpariert wurde und unabhängig von dem Aufreinigungsverfahren (Beispiel 2 ”Salz” oder Beispiel 3 ”CTAB”).
Die Ergebnisse legen nahe, dass die hier offenbarten DNA-Aufreinigungsverfahren (Talkum/PBS Salz und CTAB Protokoll) äquivalent sind und für viele unterschiedliche Nahrungsmittelmatrices verwendet werden können, da sie zu DNA-Proben führen, die in ihren Amplifikationseigenschaften (”keine DNA-Polymeraseinhibition”) äquivalent sind. Dies bestätigt die hohe Leistungsfähigkeit und Durchführbarkeit des Talkum/PBS Salz Extraktionsprotokolls, während es schneller (Extraktion und RT-PCR können am selben Tag ausgeführt werden), weniger arbeitsaufwendig ist und die Verwendung von teuren und unangenehmen Chemikalien nicht erforderlich macht. Es werden keine chaotropischen Chemikalien wie CTAB oder Harnstoff benötigt und es müssen keine Extraktionen mit organischen Lösemitteln wie etwa Chloroform durchgeführt werden, welche die Verwendung eines Laborabzugs aus Gesundheitsgründen erforderlich machen.
Das Wichtigste ist, dass die Qualität der Ziel-DNA (getestet für Schwein, Huhn, Truthahn, Rind oder Wiederkäuer) regelmäßig besser war, unabhängig von der ursprünglichen Nahrungsmittelmatrix, wenn das Talkum/PBS Protokoll verwendet wurde. Während die Probenlösungen hinsichtlich der Menge von PCR-Inhibitoren äquivalent waren, legen die niedrigeren Ct-Werte für die Ziel-DNA nahe, dass die gemäß Beispiel 2 isolierte Ziel-DNA eine bessere Qualität aufgewiesen haben könnte als DNA, welche nach dem CTAB Protokoll extrahiert und aufgereinigt wurde.
Beispiel 5 – Wirkungen von Talkum
Sojamehl, Sojalecithin und ein handelsübliches Gewürz wurden wie beschrieben homogenisiert und Proben-DNA extrahiert und isoliert gemäß dem Verfahren nach Beispiel 2. Zum Vergleich wurden nur Cellulose und PBS Salz (ohne Talkum) vor der Extraktion hinzugefügt. Nach einer Zentrifugation wurden zwei genau definierte Phasen in den DNA-Präparaten mit hinzugefügtem Talkum/PBS beobachtet, etwa ein klarer Überstand und ein definiertes Präzipitatpellet, wohingegen der Überstand im Präparat ohne Talkum noch trüb war. Der Überstand wurde in jedem Fall zur DNA-Aufreinigung wie beschrieben verwendet. Es wurden die Echtzeit-PCR und Ct-Werte für Soja- und Sellerie-DNA wie oben beschrieben bestimmt. Siehe die Ergebnisse in Tabelle 2. TABELLE 2

Matrix PCR-Parameter ohne Talkum mit Talkum

Sojamehl Soja 21,7 21,1

Sojalecithin Soja 33,5 30,7

Gewürz Sellerie 25,5 25,1
In jedem Fall hatte das hinzugefügte Talkum in der Lecithinmatrix oder dem Gewürz vorhandene DNA Polymeraseinhibitoren adsorbiert und gefällt, was durch die niedrigeren Ct-Werte gezeigt wird. Die Zugabe von Talkum erleichtert ferner die Handhabung der Proben, die viele Phospholipide, Fettsäuren und Triglyceride enthalten.
Beispiel 6 – DNA-Extraktion aus Sojalecithin
Sojalecithin wurde homogenisiert und DNA wurde extrahiert und aufgereinigt wie in Beispiel 2 (Talkum/PBS Salz) oder Vergleichsbeispiel 3 (CTAB) beschrieben. Die DNA-Ausbeuten wurden durch Messung der OD bei 280 nm und des OD-Verhältnisses bei 260 nm/280 nm analysiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 dargestellt. TABELLE 3

Salz/Talkum CTAB

OD Wert 260 nm 0,017 0,118

Verhältnis 260 nm/280 nm –3,2 1,67

DNA-Konzentration 0,9 ng/μl 5,9 ng/μl
Das CTAB-Protokoll ergab eine höhere DNA-Ausbeute und Reinheit (Protein/DNA). Jedoch galten diese Vorteile nicht, wenn die DNA einer PCR-Analyse unterworfen wurde.

Echtzeit-PCR wurde wie in Beispiel 4 beschrieben durchgeführt. Die Ziel-DNA war eine Verunreinigung mit genetisch modifiziertem Roundup Ready^TM Soja, etwa wurden Primerpaare hinzugefügt zum Nachweis von 35S (35S Promotor, stammt vom Blumenkohlmosaikvirus), nos (Nopalinsynthase Terminator, abgeleitet von Agrobacterium tumefaciens), RRS (5-enolypyruvylshikimat-3-phosphat Synthase, erhalten von A. tumefaciens Stamm CP4). Die PCR-Inhibitionskontrollbedingungen wurden wie in Beispiel 4 beschrieben ausgeführt. Siehe die Ergebnisse in Tabelle 4. TABELLE 4

	Testsystem	Testsystem	Inhibitionskontrolle	Inhibitionskontrolle
Testgen	Ct-Wert SALZ	Ct-Wert CTAB	Ct-Wert SALZ	Ct-Wert CTAB
Soja	28,67	31,64	29,5	31,2
35S	36,78	37,85	29,42	32,19
NOS	39,53	39,09	29,83	31,6
RRS	39,54	34,93	30,32	30,36

Die Inhibitionskontrollexperimente resultierten erneut in ähnlichen Ct-Werten. Während keine bedeutenden Unterschiede gefunden wurden, so legt die leicht stärkere Inhibierung in Proben, die gemäß des CTAB-Protokolls präpariert wurden nahe, dass Spuren von zugefügtem CTAB, das ebenfalls DNA-Polymerase inhibierende Aktivität aufweist, in diesen Proben vorgekommen sein könnten, wohingegen Talkum und PBS Salz leichter und zuverlässiger entfernt werden können.
Das Talkum/PBS-Protokoll resultierte in im Allgemeinen niedrigeren Ct-Werten als das CTAB-Protokoll. Trotz der geringeren DNA-Ausbeuten durch das Talkum/PBS-Protokoll (vgl. Tabelle 2), waren die Ct-Werte für die analysierten Transgene bei beiden DNA-Extraktionsverfahren äquivalent. Die Ct-Werte waren unterschiedlich für die verschiedenen untersuchten Gene, was auf unterschiedliche Mengen von Kontamination hindeutet.
Beispiel 7 – Nachweis von genetisch modifizierten Organismen in Getreiden und Pflanzen

Maiskörner, Sojaproteinisolat, Sojabohnen, Vielkorntoastbrot, Senfmehl, Rapssamen und Tiernahrung wurden wie oben beschrieben analysiert. Hinzugefügte Primer dienten zum Nachweis von 35S, RRS, FMV (Promotor vom Braunwurz-Mosaikvirus), nos, Ctp2 (CTP2-CP4EPSPS, Übergang von Chloroplasten Transitpeptid und 5-Enolpyruvyl-shikimat-3-phosphat Synthase; aus Arabidopsis thaliana und Agrobacterium sp., Resistenz gegenüber dem Herbizid Roundup Ready) und CAMV (CaMV, 35S Promotor aus dem Blumenkohl-Mosaikvirus). Ergebnisse siehe Tabelle 5. TABELLE 5

		Testsystem	Testsystem	Inhibitionskontrolle	Inhibitionskontrolle
Matrix	Gen	Ct Salz	Ct CTAB	Ct Salz	Ct CTAB
Mais	35S	29,27	30,59	29,61	29,48
Sojaproteinisolat	RRS	31,36	34,69	31,46	31,34
Soja	FMV	36,98	38,21	31.44	33,24
Vielkorntoast	nos	27,40	26,91	30,70	29,58
Senfmehl	Ctp2	33,40	34,10	30,27	31,42
Rapssamen	35S	33,28	37,44	30,02	29,10
Tiernahrung	CAMV	30,19	30,48	29,99	30,53

Die Inhibitionskontrollen ergaben erneut ähnliche Ct-Werte für die DNA-Referenz, so dass beide DNA-Extraktionsverfahren bei allen getesteten Probenmatrices verwendet werden konnten. Jedoch legen die für die Ziel-DNA erhaltenen Ct-Werte nahe, dass die unter Verwendung von Talkum/PBS Salz aufgereinigte DNA im Allgemeinen intakter ist (”Ausbeute von DNA besserer Qualität”) als DNA, die aus einer Probenmatrix unter Verwendung des CTAB-Extraktionsprotokolls präpariert wurde.
Beispiel 8 – DNA-Extraktion aus komplexen Gemüse-/Pflanzenproben

Rohe Mandelpaste, Keks (ohne Geschmacksstoffe), Reis Crispies, Mohnsamenmischung und dunkle Haselnusspaste wurden untersucht. Die Proben-DNA wurde wie beschrieben extrahiert und aufgereinigt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 dargestellt. TABELLE 6

		Testsystem	Testsystem	Inhibitionskontrolle	Inhibitionskontrolle
Matrix	Spezies	Ct Salz	Ct CTAB	Ct Salz	Ct CTAB
Rohe Mandelpaste	Mandel	21,94	22,20	28,94	30,80
Keks (ohne Geschmacksstoffe)	Mandel	25,94	27,03	32,17	32,79
Reis Crispies	Mais	20,62	21,34	27,71	28,23
Mohnsamenmix	Mais	29,16	27,79	30,78	31,74
Dunkle Haselnusspaste	Soja	38,36	Kein Ct	31,55	33,23

Die Ct-Werte für die Referenz-DNA waren erneut bei allen Probenpräparaten und Nahrungsmittelmatrices ähnlich, während wir erneut eine geringere Inhibition in den Proben feststellten, die gemäß dem Talkum/Salz-Protokoll präpariert wurden. Die Resultate legen ferner Ausbeuten von DNA besserer Qualität bei dem Talkum/PBS Salz-Protokoll nahe als mit dem CTAB-Protokoll, da Spuren von Soja in der getesteten ”dunklen Haselnusspaste” nachweisbar waren, die nicht im DNA-Vergleichspräparat unter Verwendung des CTAB-Protokolls gefunden werden konnten.
Beispiel 9 – DNA-basierter Nachweis von Allergenen in Nahrungsmittelproben

Brotaufstrich auf Milchbasis, der Schokolade/Haselnussflocken umfasst, ein Sprühmittel für geräuchertes Schwein, Haselnussmark (wärmebehandelt bei 166°C), Abstrich, Mandel (gemahlen, Stückgrößen 1–2 mm), Petersilie (gemahlen), Gewürzmischung und gratinierter Lachs wurden auf DNA aus typischen Allergenquellen getestet (Haselnuss, Senf, Pecannuss, Fisch, Erdnuss und Sellerie). Die DNA Extraktion, RT-PCR und Ct-Werte waren analog wie in Beispielen 2, 3 und 4. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 dargestellt. TABELLE 7

		Testsystem	Testsystem	Inhibitionskontrolle	Inhibitionskontrolle
Matrix	Allergen	Ct Salz	Ct CTAB	Ct Salz	Ct CTAB
Milchaufstrich mit Schokolade-Haselnuss Flocken	Haselnuss	29,95	28,07	31,72	32,48
Sprühmittel für geräuchertes Schwein	Senf	38,19	38,78	32,44	31,85
Haselnussmark (wärmebehandelt bei 166°C)	Pecan	37,73	40,71	32,35	32,69
Abstrich	Fisch	31,91	32,89	26,74	32,11
Mandel (gemahlen, 1–2 mm Größe)	Erdnuss	31,47	34,04	34,59	37,31
Petersilie (gemahlen)	Sellerie	27,02	24,65	32,09	31,78
Gewürzmischung	Senf	24,49	Kein Ct	32,80	Kein Ct
Gratinierter Lachs	Fisch	26,74	32,11	31,91	32,89

Die Ct-Wert für die interne DNA-Referenz (Inhibitionskontrolle) waren über sämtliche Nahrungsmittelmatrices ähnlich, außer der Gewürzmischung. Die Resultate legen erneut Ausbeuten qualitativ besserer DNA beim Talkum/PBS-Protokoll nahe, da weder Senf-DNA noch Referenz-DNA in der Gewürzmischung nachweisbar war, wenn sie unter Verwendung des CTAB-Protokolls extrahiert wurde.
Beispiel 10 – Empfindlichkeit und Linearität

Proben von Maismehl mit bekannten Mengen von Senf (1, 10, 10², 10³ und 10⁴ ppm) wurden wie in Beispiel 2 beschrieben verarbeitet und die Ct-Werte für DNA aus a) normalem und b) gelbem Senf wie beschrieben bestimmt (siehe 1). Dasselbe wurde ebenfalls bei Proben von Mayonnaise mit bekannten Mengen von Senf (1, 10, 10², 10³ und 10⁴ ppm) ausgeführt. Sämtliche Ct-Messungen wurden in Duplikaten ausgeführt und der Durchschnittswert wurde verwendet, um die Linearität und Empfindlichkeit des Nachweises zu berechnen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 dargestellt. TABELLE 8

Parameter Matrix	Senf		Gelber Senf		log ppm
Parameter Matrix	Ct-Wert CTAB	Ct-Wert SALT	Ct-Wert CTAB	Ct-Wert SALT	log ppm
Senf in Maismehl 10000 ppm	12,62	15,55	23,97	25,96	4
Senf in Maismehl 1000 ppm	16,14	18,04	27,22	28,74	3
Senf in Maismehl 100 ppm	19,26	21,53	30,06	33,1	2
Senf in Maismehl 10 ppm	21,46	25,09	32,76	35,11	1
Senf in Maismehl 1 ppm	25,22	28,88			0

Senf in Mayonnaise 10000 ppm	8,33	12,08	20,1	23,23	4
Senf in Mayonnaise 1000 ppm	11,6	14,92	23,23	26,05	3
Senf in Mayonnaise 100 ppm	15,08	18,04	26,42	29,41	2
Senf in Mayonnaise 10 ppm	18,44	20,42	29,97	32,23	1
Senf in Mayonnaise 1 ppm	21,03	24,10	32,51	36,38	0

Die Ct-Werte für das Vorkommen von entweder Senf oder gelbem Senf in Maismehl und Mayonnaise wurden in den 1 und 2 graphisch dargestellt. Die Ergebnisse zeigen ein lineares Verhalten des DNA-Nachweises durch Echtzeit-PCR, wenn die DNA gemäß dem Talkum/Salz-Protokoll extrahiert und aufgereinigt wurde. Die Linearität war vergleichbar mit den mit CTAB extrahierten Proben. Zudem wurde dies für zwei sehr unterschiedliche Nahrungsmittelmatrices gezeigt, nämlich für Maismehl, das reich an Polysacchariden ist und Mayonnaise, die einen hohen Gehalt an Lipiden, Fettsäuren und Öl aufweist. Die Extraktion mit Talkum/Salz-Tabletten gestattete ferner einen Nachweis extrem niedriger Mengen von Kontaminierung, bis auf 1 ppm. Während die Nachweisempfindlichkeit etwas niedriger war, war sie mit jener von CTAB vergleichbar. Das lineare Verhalten gestattet daher die Einrichtung von Standardkurven, was eine Abschätzung der absoluten Menge von Kontaminierung in einer Nahrungsmittelmatrix mit hoher Zuverlässigkeit möglich macht.
Beispiel 11 – Quantitative Bestimmung von fremdem Material in Nahrungsmittelproben

DNA aus Fleischklößchen, Rapssamen, Pastete, Würstchen, Durumweizengrieß und Durumweizenmehl wurde wie in den Beispielen 2 und 3 beschrieben erhalten. Fremde Materialien wurden unter Verwendung spezifischer Primer für Büffel, GT73 (Marker für genetisch veränderten Rapssamen), RRS, Schwein und Weizen identifiziert. Entsprechend wurde ein Haushaltsgen ausgewählt und es wurden unter jeder Bedingung spezifische Primer verwendet. Der relative Prozentsatz der fremden DNA in der gesamten DNA-Probe wurde somit für verschiedene Nahrungsmittelmatrices bestimmt, unter Verwendung eines herkömmlichen DNA-Präparats und des hierin offenbarten. Die Ergebnisse sind in Tabelle 9 dargestellt. TABELLE 9

Matrix	PCR Parameter	SALZ	CTAB
Fleischklößchen	Büffel	0,02%	0,02%
Rapssamen	GT73	0,03%	0,03%
Rapssamen	GT73	0,77%	0,61%
Pastete	RRS	0,18%	0,19%
Wurst	Schwein	1,88%	1,97%
Wurst	Schwein	0,15%	0,33%
Durumweizengrieß	Weizen	19%	12%
Durumweizenmehl	Weizen	5,10%	5,20%

Die Ergebnisse in Tabelle 9 bestätigen einen empfindlichen, quantitativen Nachweis von fremdem Material, wenn die Probenmatrices gemäß dem Talkum/Salz-Protokoll verarbeitet und aufbereitet wurden. Die erhaltenen Werte sind sehr ähnlich für beide Extraktions- und Aufreinigungsprotokolle. Eine beständige Nachweisempfindlichkeit wird für die gegebenen Probenmatrices beobachtet.
Beispiel 12 – Quantitative Bestimmung von GMO-DNA in Tiernahrungen

Proben von 12 verschiedenen im Handel erhältlichen Tiernahrungen wurden wie oben beschrieben auf DNA analysiert. Es wurden Primer für genetisch modifizierte Sojabohne und das RRS-Gen verwendet. Primer für ein Haushaltsgen wurden zur Quantifizierung der Gesamt-DNA gewählt. Die Ergebnisse sind unten in Tabelle 10 dargestellt. TABELLE 10

Matrix	PCR-Parameter	SALZ	CTAB
Tiernahrung 1	MON89788	0,16%	0,10%
Tiernahrung 1	RRS	0,14	0,1
Tiernahrung 2	RRS	42%	54%
Tiernahrung 3	RRS	0,10%	0,13%
Tiernahrung 4	RRS	0,11%	0,09%
Tiernahrung 5	RRS	0,35%	0,46%
Tiernahrung 6	RRS	0,04%	0,07%
Tiernahrung 7	RRS	0,73%	0,85%
Tiernahrung 8	RRS	49%	47%
Tiernahrung 9	RRS	49%	57%
Tiernahrung 10	RRS	62%	58%
Tiernahrung 11	RRS	43%	47%

Die Ergebnisse bestätigen, dass das auf Talkum/Salz basierende DNA-Extraktionsverfahren Proben bereitstellt, die verlässlich zum Bestimmen des relativen Gehalts biologischen Materials bei in hohem Maße verarbeiteten Nahrungsmittelmatrices verwendet werden kann.
Beispiel 13 – Extraktion und Nachweis bakterieller DNA aus Nahrungsmittelanreicherungskulturen
Voranreicherungskulturen wurden hergestellt durch Inokulieren von 225 ml gepuffertem Peptonwasser-(BPW)Bouillon (Verhältnis 1:9), bei 37°C gewärmt, mit einer Sonde. Die getesteten Proben waren ein Wischtuch/Stofftuch (Kleenex^TM Taschentuch), Wasser aus einem Kühlkreislauf, Schokolade, dunkler Schokoladenüberzug, Trinkwasser, Rind (Ringversuch 01-03), Sesam, Zwiebelmettwurst, Milchprodukte, Entenfleisch in Streifen, Truthahnbrust, mariniertes Entenfleisch, Vollmilch und Truthahnschenkelfleisch. Die Anreicherungskultur wurde 18 Stunden lang unter Schütteln bei 37°C inkubiert. 900 μl Anreicherungskultur wurden mit 100 μl einer Verdünnung einer Übernachtkultur von Salmonella spp., Listeria monocytogenes, Cronobacter spp. und Campylobacter spp. gemischt, so dass sie 103 koloniebildende Einheiten (cfu) pro experimenteller Bedingung enthielten. 200 μl Kultur nach dem Mischen (200 cfu) wurden einer DNA-Extraktion gemäß den Beispielen 2 oder 3 unterzogen. Wenn gemäß dem Talkum/Salz-Protokoll extrahiert wurde, wurde dem Verfahren wie beschrieben bis zum ersten Zentrifugationsschritt gefolgt. Eine Verdünnung (1:20) des Überstands wurde jedoch unmittelbar einer PCR-Analyse unterzogen. RT-PCR und Cf-Werte wurden wie in Beispiel 4 bestimmt. Es wurden spezifische Primer für den Nachweis von Salmonella spp., Listeria monocytogenes, Cronobacter spp. und Campylobacter spp. verwendet.

Im Falle der vergleichenden CTAB-Extraktion enthielt die Lösung zur Extraktion bakterieller DNA 2% CTAB, 100 mM Tris-HCl pH 8, 20 mM EDTA, 1,4 M NaCl, 0,2% β-Mercaptoethanol, 0,1 mg Proteinase K. 0,8 ml CTAB-Puffer bei 60°C wurden 200 μl angereicherter Kulturprobe hinzugefügt und 1 Stunde lang bei 60°C mit regelmäßiger Bewegung alle 10 Minuten inkubiert. 0,8 ml Chloroform/Isoamylalkohol (24:1) wurden hinzugefügt, 2 Minuten lang gemischt, gefolgt von einer Zentrifugation bei 14000 UPM für 10 Minuten bei 4°C, wodurch zwei Phasen erhalten wurden. Die obere klare wässrige Phase über einer weißen Zwischenschicht wurde abgezogen und zur DNA-Aufreinigung und Entsalzung wie in Beispiel 2 beschrieben verwendet. Eine qualitative RT-PCR und Ct-Wert Bestimmung wurde wie in Beispiel 4 beschrieben durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 11 dargestellt. Die Ct-Werte der Testsysteme geben an, ob DNA des jeweiligen Krankheitserregers in der entnommenen Probe vorhanden war oder nicht. TABELLE 11

		Testsystem	Testsystem	Inhibitionskontrolle	Inhibitionskontrolle
Matrix	Krankheitserreger	Ct Salt	Ct CTAB	Ct Salz	Ct CTAB
Wischtuch	Salmonella spp.	33,23	36,55	28,89	31,06
Wischtuch	Salmonella spp.	31,96	31,66	29,59	29,17
Wasser aus Kühlkreislauf	Salmonella spp.	25,90	27,02	29,84	30,44
Schokolade	Salmonella spp.	20,48	18,97	27,83	28,25
dunkler Schokoladenüberzug	Salmonella spp.	23,66	21,68	29,25	27,99
Trinkwasser	Salmonella spp.	26,91	27,90	29,44	29,90
Ringversuch 01	Salmonella spp.	18,79	19,76	27,73	29,32
Ringversuch 02	Salmonella spp.	17,54	20,88	28,71	27,8
Ringversuch 03	Salmonella spp.	17,40	20,88	27,31	28,47
Sesam	Salmonella spp.	25,27	30,13	31,06	28,32
Zwiebelmettwurst	Salmonella spp.	32,00	30,56	29,32	30,23
Milchprodukt	L. monocytogenes	kein Ct	kein Ct	28,92	29,52
Entenstreifen	L. monocytogenes	30,41	30,64	29,89	30,85
Truthahnbrust	L. monocytogenes	21,98	34,16	30,21	30,29
marinierte Ente	L. monocytogenes	33,66	35,53	29,02	31,33
Milchprodukt	Cronobacter spp.	37,86	42,00	28,33	28,94
Milchprodukt	Cronobacter spp.	35,32	36,47	28,99	28,88
Vollmilch	Campylobacter spp.	23,19	30,50	27,90	31,63
Vollmilch	Campylobacter spp.	18,96	23,46	27,63	29,48
Truthahn	Campylobacter spp.	17,33	19,10	28,02	29,03

Die Ct-Werte für die Referenz-DNA (”Inhibitionskontrolle”) bestätigen die Qualität des Extraktionsverfahrens, etwa dass die RT-PCR Reaktion nicht durch DNA-Polymeraseinhibitoren aus der extrahierten Nahrungsmittelmatrix inhibiert wurde. Ein verringerter Ct-Wert im Testsystem zeigt an, dass die Probe mit einem Krankheitserreger kontaminiert war. Im Wesentlichen lieferte das CTAB-Protokoll sehr ähnliche Ergebnisse wie das Talkum/Salz-Protokoll. Die unter Verwendung des Talkum/Salz-Protokolls präparierte DNA wies im Allgemeinen eine höhere Qualität auf verglichen mit dem CTAB-Verfahren, mit der einzigen Ausnahme von ”dunkler Schokolade”, die reich an Polyphenol und Catechinen ist. Es wird jedoch eine wahlweise Extraktion nach der Talkum/Salz-Extraktion vor dem DNA-Entsalzen in Betracht gezogen. Nichtsdestoweniger erwies sich das Talkum/Salz-Protokoll als völlig zufriedenstellend für diese traditionell schwierige Nahrungsmittelmatrix.

Claims

Zusammensetzung zur Verwendung beim Extrahieren und Aufreinigen von Nukleinsäuren aus Nahrungsmittelproben dadurch gekennzeichnet, dass die Zusammensetzung ein Feststoffgemisch ist, das Folgendes umfasst: 10 bis 40 Gewichtsprozent Teilchen, die aus wasserunlöslichem hydriertem Magnesiumsilikat bestehen und eine mittlere Teilchengröße von 0,8 bis 2,5 μm aufweisen; sowie 20 bis 70 Gewichtsprozent kristalline phosphatgepufferte Saline, die leicht wasserlöslich ist, wodurch eine Lösung hergestellt wird, die einen pH-Wert von 5,5 bis 7,0 bei 70 bis 95 Grad Celsius aufweist.
Zusammensetzung wie in Anspruch 1 beansprucht, wobei das Feststoffgemisch als Tablette oder Kapsel portioniert wurde, die ein bekanntes vorbestimmtes Gewicht aufweist.
Zusammensetzung wie in Anspruch 1 oder Anspruch 2 beansprucht, die ferner 20 bis 35 Gewichtsprozent eines hydrophilen Kolloids umfasst, das zum Dispergieren des Feststoffgemischs in Wasser wirksam ist.
Zusammensetzung wie in einem der vorherigen Ansprüche 1 bis 3 beansprucht, das Teilchen von hydratisiertem Magnesiumsilikat umfasst, die eine mittlere Teilchengröße von 1,0 bis 2,0 μm aufweisen, vorzugsweise 1,2 bis 1,5 μm.
Tablette oder Kapsel, die im Wesentlichen eine Zusammensetzung wie in einem der Ansprüche 1 bis 4 beschrieben umfasst, die Folgendes aufweist: 10 bis 25 Gewichtsprozent wasserunlösliche hydrierte Magnesiumsilikatteilchen; 45 bis 70 Gewichtsprozent phosphatgepufferte Saline und 20 bis 30 Gewichtsprozent eines hydrophilen Kolloids, das zum Dispergieren des Feststoffgemischs in Wasser wirksam ist.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, das ferner ein oder mehrere nicht-chaotrope lysierende Mittel umfasst.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das hydrophile Kolloid Cellulose, Carboxymethylcellulose, Cellulosederivate, Alginat, Stärke, Xanthankautschuk, Gummi arabicum, Guarkautschuk ist oder Gemische davon.
Standardverfahren zum Isolieren von DNA aus einer Vielzahl von Futter- und Nahrungsmittelproben, einschließlich Getränken, zur anschließenden PCR-Analyse, das die folgenden Schritte umfasst: – Erhalten einer vorbestimmten Gewichts- oder Volumenmenge der Probe, vorzugsweise als kleine Teilchen, Lösung oder Dispersion und Überführen der Probe in ein Gefäß; – Hinzufügen einer vorbestimmten Menge des Feststoffgemischs wie in einem der Ansprüche 1 bis 7 offenbart, wobei ein Gewichtsverhältnis von Feststoffen zu Probe im Gefäß von 1:5 bis 5:1 erhalten wird; – ferner Hinzufügen einer Menge von Wasser, um die Pufferkomponenten des Feststoffgemischs zu lösen, wobei eine wässrige phosphatgepufferte Salinelösung erhalten wird, die einen pH-Wert von 5,5 bis 7,0 und eine Salzkonzentration von 0,6 bis 1,2 Mol/l aufweist; – Erhalten einer Dispersion der Probe und des Feststoffgemischs in phosphatgepufferter Saline und Erhitzen der Lösung oder Dispersion bis zu einer Temperatur von 70 bis 95 Grad Celsius für 1 Minute bis 30 Minuten, um die Nukleinsäuren aus den zellulären Materialien und anderen wasserunlöslichen Komponenten der Probe freizusetzen; – Trennen der wasserunlöslichen Komponenten der Probe und des Feststoffgemischs von der wässrigen Phase durch Zentrifugation oder Filtration, gemeinsam mit den Komponenten, die auf den Magnesiumsilikatteilchen des Feststoffgemischs adsorbiert sind; – Entfernen des wässrigen Überstands oder Filtrats, das lösliche Nukleinsäuren enthält, gefolgt von einem Entsalzungsschritt, wodurch eine Lösung der Proben-DNA erhalten wird, die zur PCR-Analyse geeignet ist.
Kit zum Extrahieren und Aufreinigen von Nukleinsäuren aus Proben, der portionierte Mengen der in einem der vorherigen Ansprüche 1 bis 7 beanspruchten Zusammensetzung umfasst.
Verwendung der Zusammensetzung, des Verfahrens und des Kits nach einem der Ansprüche 1 bis 9 zum Isolieren und Charakterisieren des Nukleinsäuretyps aus rohen und/oder verarbeiteten Tier- und Pflanzenmaterialien und verarbeiteten Produkten davon.
Verwendung der Zusammensetzung, des Verfahrens und des Kits nach einem der Ansprüche 1 bis 9 zum Isolieren von Nukleinsäuren, die für potentielle Allergene charakteristisch sind, welche in Getreiden und deren Produkten, Kichererbse und deren Produkten, Casein, Mandel und deren Produkten, Cashew und deren Produkten, Erdnuss und deren Produkten, Haselnuss und deren Produkten, Macadamia und deren Produkten, Senf und dessen Produkten, Soja und dessen Produkten, Sesam und dessen Produkten, Walnuss und deren Produkten, Pistazie und deren Produkten, Lupine und deren Produkten, Sellerie und dessen Produkten, Fisch und dessen Produkten, Krebstieren und deren Produkten vorkommen.
Verwendung der Zusammensetzung, des Verfahrens und des Kits nach einem der Ansprüche 1 bis 9 zum Isolieren von Nukleinsäuren, die für genetisch modifizierte Organismen, Krankheitserreger, Salmonella spp., Listeria spp., Shigella spp., Campylobacter spp., Cronobacter spp., Clostridium spp., Legionella spp., Enterobacteriaceae, Escherichia spp. charakteristisch sind.
Verwendung der Zusammensetzung, des Verfahrens und des Kits nach einem der Ansprüche 1 bis 9 zum Isolieren von Nukleinsäuren aus menschlichen und tierischen Fäkalproben.