CN103074321B - 一种固定化复合酶及利用该酶处理蒜氨酸废液的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物化学领域，涉及了一种固定化复合酶及利用该酶提取蒜氨酸废液中大蒜多糖的方法，该方法主要将破壁酶：果胶酶（酶活：10万u/g）和除蛋白酶：菠萝蛋白酶(酶活：10万u/g）固定在环氧基大孔树脂中，破壁酶能够水解纤维素使细胞壁破裂，蛋白多糖被释放出来，而除蛋白酶能够酶解与多糖结合的蛋白质。采用该固定化复合酶提取蒜氨酸废液中的大蒜多糖，经过滤、0.5μm~5μm超滤膜分离、浓缩、喷雾干燥，制备大蒜多糖产品，采用该方法可以提高多糖的得率，降低多糖中蛋白质的含量，提高了多糖的纯度。
Description
技术领域
本发明涉及生物化学领域，涉及了一种固定化复合酶及利用该酶提取蒜氨酸废液中大蒜多糖的方法。
背景技术
大蒜为百合科葱属植物蒜（Allium sativum L.）的地下鳞茎，为多年生草本植物，是历史悠久的药食两用植物。大蒜中的糖类主要为果聚糖类，占干重的75%左右，是大蒜籽的能量贮藏物质，提供大蒜萌发所需的碳源和能源。其中菊糖含量为15~25%，另外，大蒜中还含有少量小分子糖类，如葡萄糖、果糖和蔗糖等。低聚果糖约占大蒜糖类总量的3.9%，其中蔗果三糖是果聚糖的基础。低聚果糖和果聚糖类总含量高达12.5~23.5%(湿重)。大蒜多糖是从大蒜中提取的有效活性成分,属于菊糖类的果聚糖。近年来,国内外大量研究证实大蒜多糖具有多种生理活性。大蒜多糖可以控制血脂、可选择性地增殖肠道双歧杆菌、降低血糖、增强免疫功能；能增强T淋巴细胞、B淋巴细胞和巨噬细胞的活力,具有护肝、抗氧化和抗病毒作用,在保健食品和医药中有着较好的开发前景。
近年来，人们对于大蒜多糖的提取研究做了大量工作。常用的提取方法有热水浸提法、超声波提取法、碱提取法、蛋白酶水解提取法等。其中蛋白酶水解法因其具有经济、快速、高效安全、样品损失少等优点越来越受到人们的青睐。酶作为一种生物催化剂具有高效、专一的特点，有很高的工业应用价值。但是由于酶使用条件的温和性和其本身的易变性使酶对环境要求非常的苛刻，且很难回收利用而残余的酶对产品的性能有一定影响，从而大大限制了酶在工业中的应用。传统提取大蒜多糖的工艺方法对大蒜多糖的提取率偏低，一般在50%左右且纯度较低，而且酶的使用条件也很苛刻，这样就严重限制了大蒜多糖的进一步发展。
发明内容
本发明针对现有大蒜多糖提取遇到的技术瓶颈，提供了一种固定化复合酶及利用该酶提取蒜氨酸废液中大蒜多糖的方法，该固定化酶是将破壁酶：果胶酶和除蛋白酶：菠萝蛋白酶固定在环氧基大孔树脂中获得的，将酶固定在载体上来改善其对环境的适应能力，从而使酶可以在工业中得到广泛的应用，使用本发明所提供的固定化复合酶技术从蒜氨酸废液提取大蒜多糖的工艺能够有效提取大蒜多糖，提取效率较传统方法高出了20%以上，且提取出的大蒜多糖中基本上没有残留的酶，纯度大大提高。
本发明所采用的固定化符合酶，包括固定在环氧基大孔树脂中的破壁酶和除蛋白酶，具体是将破壁酶和除蛋白酶固定在环氧基大孔树脂中获得的，其中所采用的破壁酶为果胶酶、纤维素酶、及半纤维素酶中的一种；除蛋白质的酶为菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶中的一种，也可以采用酸性蛋白酶。两种酶的酶活均为10万u/g，所述破壁酶与除蛋白酶的用量比例按酶活计为1：3~3：1。在该用量比例下，两者的配合效果最佳，最终获得的收率最高且纯度好。
其具体获得方法是：
1）环氧基大孔树脂载体的制备：采用悬浮聚合法以甲基丙烯酸缩水甘油酯（GMA）为功能单体，二甲基丙烯酸乙二醇酯（EGDMA）为交联剂，合成环氧基大孔树脂载体，选取80～110目的树脂作为固定化酶用树脂；其中具体的合成方法可参考文献Immobiliztion ofcandida lipolytica lipase on macroporousbeaded terpolymers with epoxy groups.Wentao Liu,Hongdong Duan,Xia Meng,Dawei Qin.Journal of Applied polymer science.2013(127)4251-4255进行制备。
2）固定化复合酶：将选取1.0g的树脂载体溶胀；将破壁酶及除蛋白酶分别用pH为4.5~6.5缓冲液配置成15mg/ml的酶溶液，之后分别吸取5.0～15.0ml破壁酶及除蛋白的酶溶液并转移到锥形瓶中，然后再用移液管吸取40.0~80.0ml上述pH为4.5~6.5的缓冲溶液置入锥形瓶中，轻微摇动使体系混合均匀，把溶胀的环氧基大孔树脂加入到锥形瓶中，用保鲜膜将锥形瓶盖好，然后放入35℃恒温振荡器中，在200rpm转速条件下，震荡6h，使其充分固定即得。
其中所采用的缓冲溶液是浓度为0.05mol/L的醋酸溶液和浓度为0.05mol/L醋酸钠溶液，也可以是浓度为0.05mol/L柠檬酸溶液和浓度为0.05mol/L柠檬酸钠溶液；
所选择的的酶种类如上所述，之所以选择上述的各种酶，是由于固定后的复合酶的最佳使用温度及最佳使用pH值在4.5~6.5之间，选择出的上述的酶，在这一范围内依然能够保持高活性，能够保证在酶活不受影响的情况下进行提取，从而提高最终多糖的提取效率和纯度。
应用上述的固定化复合酶处理蒜氨酸废液的方法如下：
取蒜氨酸废液，用浓度为1mol/L的氢氧化钠和浓度为1mol/L的盐酸溶液调节至pH值为4.5~6.5，取5~20mg上述制备的固定化复合酶加入到200-800mL上述pH值为4.5~6.5蒜氨酸废液中，置于恒温震荡器中酶解，酶解温度为35~55℃，转速在200~400rpm，pH值为4.5~6.5，时间为60~100min；酶解后酶解液经过滤、0.5μm～5μm的超滤膜分离、浓缩、干燥得到大蒜多糖产品；
所述的超滤膜分离时，所用组件为中空纤维膜组件或陶瓷膜组件或平板膜或卷式膜；所采用的过滤为减压过滤。
采用该方法提取大蒜多糖的得率在67%以上，大蒜多糖的纯度可达87%以上，远高于现有技术水平。
其中所述的蒜氨酸废液是现有蒜氨酸提取过程中产生的废液，其一般获得步骤如下：
微波处理使大蒜片中的蒜氨酸酶失活，然后调节匀浆机8000r/min将大蒜片制成蒜浆，常温下循环超声波提取得到大蒜粗提取液，过滤，滤液流经离子交换树脂，25w/w%氨水洗脱树脂吸附的蒜氨酸得到蒜氨酸溶液，残留液为蒜氨酸废液，其中所采用的离子交换树脂为丙烯酸型阳离子交换树脂。
综上所述，采用本发明所提供的固定化复合酶技术从蒜氨酸废液中提取大蒜多糖的工艺能够有效提取大蒜多糖，提取效率较传统方法高出了20%以上，且提取出的大蒜多糖中基本上没有残留的酶，纯度大大提高。
具体实施方式
下面结合实施例来进一步说明本发明，可以使本领域技术人员更全面的理解本发明，但不以任何方式限制本发明。本发明除特殊说明外，其他所述百分比均为重量百分比。
实施例1
取5ml pH为4.5，15mg/ml的果胶酶（酶活：10万u/g）溶液与15ml pH为4.5，15mg/ml的菠萝蛋白酶(酶活：10万u/g）溶液于锥形瓶中，
其中所述的果胶酶溶液采用浓度为0.05mol/L的醋酸溶液和浓度为0.05mol/L醋酸钠溶液配制而成；
所述的菠萝蛋白酶溶液采用0.05mol/L的醋酸溶液和浓度为0.05mol/L醋酸钠溶液配制而成；
然后用移液管分别吸取45ml和35ml pH为4.5的浓度为0.05mol/L的醋酸溶液和浓度为0.05mol/L醋酸钠溶液置入锥形瓶中，轻微摇动使体系混合均匀，把1.0g溶胀的环氧基大孔树脂（参考文献Immobiliztion of candida lipolyticalipase on macroporous beaded terpolymers with epoxy groups.Wentao Liu,Hongdong Duan,Xia Meng,Dawei Qin.Journal of Applied polymer science.2013(127)4251-4255制得.）加入到锥形瓶中，用保鲜膜将锥形瓶盖好，然后放入35℃恒温振荡器中，在200rpm转速条件下，震荡6h，使其充分固定即可获得固定化复合酶；
取大蒜片100g，微波处理使大蒜片中的蒜氨酸酶失活，然后调节匀浆机8000r/min将大蒜片制成蒜浆，常温下循环超声波提取得到大蒜粗提取液，过滤，滤液流经离子交换树脂，25w/w%氨水洗脱树脂吸附的蒜氨酸得到蒜氨酸溶液，残留液为除蒜氨酸的废液，其中所采用的离子交换树脂为丙烯酸型阳离子交换树脂。
取5mg上述固定化复合酶，加入到200mL用浓度为1mol/L的氢氧化钠和浓度为1mol/L的盐酸溶液配制的pH值为4.5的上述蒜氨酸废液中，35℃下，200rpm转速条件下，恒温震荡60min，之后经减压过滤、0.5μm～5μm的超滤膜分离、浓缩、喷雾干燥得到大蒜多糖产品，大蒜多糖的得率在73.67%以上，大蒜多糖纯度为92.43%。
实施例2
取8ml pH为5.0，15mg/ml的果胶酶（酶活：10万u/g）溶液与12ml pH为5.0，15mg/ml的菠萝蛋白酶(酶活：10万u/g）溶液于锥形瓶中，
其中所述的果胶酶溶液采用浓度为0.05mol/L的醋酸溶液和浓度为0.05mol/L醋酸钠溶液配制而成；
所述的菠萝蛋白酶溶液采用0.05mol/L的醋酸溶液和浓度为0.05mol/L醋酸钠溶液配制而成；
然后用移液管分别吸取42ml和38ml pH为5.0的浓度为0.05mol/L的醋酸溶液和浓度为0.05mol/L醋酸钠溶液置入锥形瓶中，轻微摇动使体系混合均匀，把1.0g溶胀的环氧基大孔树脂（参考文献Immobiliztion of candida lipolyticalipase on macroporous beaded terpolymers with epoxy groups.Wentao Liu,Hongdong Duan,Xia Meng,Dawei Qin.Journal of Applied polymer science.2013(127)4251-4255制得.）加入到锥形瓶中，用保鲜膜将锥形瓶盖好，然后放入35℃恒温振荡器中，在200rpm转速条件下，震荡6h，使其充分固定即可获得固定化复合酶；
取大蒜片100g，微波处理使大蒜片中的蒜氨酸酶失活，然后调节匀浆机8000r/min将大蒜片制成蒜浆，常温下循环超声波提取得到大蒜粗提取液，过滤，滤液流经离子交换树脂，25w/w%氨水洗脱树脂吸附的蒜氨酸得到蒜氨酸溶液，残留液为除蒜氨酸的废液，其中所采用的离子交换树脂为丙烯酸型阳离子交换树脂。
取9mg上述固定化复合酶，加入到360mL用浓度为1mol/L的氢氧化钠和浓度为1mol/L的盐酸溶液配制的pH值为5.0的上述蒜氨酸废液中，40℃下，250rpm转速条件下，恒温震荡70min，之后经减压过滤、0.5μm～5μm的超滤膜分离、浓缩、喷雾干燥得到大蒜多糖产品，大蒜多糖的得率在78.89%以上，大蒜多糖纯度为94.63%.。
实施例3
取10ml pH为5.5，15mg/ml的果胶酶（酶活：10万u/g）溶液与10ml pH为5.5，15mg/ml的菠萝蛋白酶(酶活：10万u/g）溶液于锥形瓶中，
其中所述的果胶酶溶液采用浓度为0.05mol/L的醋酸溶液和浓度为0.05mol/L醋酸钠溶液配制而成；
所述的菠萝蛋白酶溶液采用0.05mol/L的醋酸溶液和浓度为0.05mol/L醋酸钠溶液配制而成；
然后用移液管分别吸取45ml和35ml pH为5.5的浓度为0.05mol/L的醋酸溶液和浓度为0.05mol/L醋酸钠溶液置入锥形瓶中，轻微摇动使体系混合均匀，把1.0g溶胀的环氧基大孔树脂（参考文献Immobiliztion of candida lipolyticalipase on macroporous beaded terpolymers with epoxy groups.Wentao Liu,Hongdong Duan,Xia Meng,Dawei Qin.Journal of Applied polymer science.2013(127)4251-4255制得.）加入到锥形瓶中，用保鲜膜将锥形瓶盖好，然后放入35℃恒温振荡器中，在200rpm转速条件下，震荡6h，使其充分固定即可获得固定化复合酶；
取大蒜片100g，微波处理使大蒜片中的蒜氨酸酶失活，然后调节匀浆机8000r/min将大蒜片制成蒜浆，常温下循环超声波提取得到大蒜粗提取液，过滤，滤液流经离子交换树脂，25w/w%氨水洗脱树脂吸附的蒜氨酸得到蒜氨酸溶液，残留液为除蒜氨酸的废液，其中所采用的离子交换树脂为丙烯酸型阳离子交换树脂。
取13mg上述固定化复合酶，加入到520mL用浓度为1mol/L的氢氧化钠和浓度为1mol/L的盐酸溶液配制的pH值为5.5的上述蒜氨酸废液中，45℃下，300rpm转速条件下，恒温震荡80min，之后经减压过滤、0.5μm～5μm的超滤膜分离、浓缩、喷雾干燥得到大蒜多糖产品，大蒜多糖的得率在76.64%以上，大蒜多糖纯度为93.11%。
实施例4
取14ml pH为6.0，15mg/ml的果胶酶（酶活：10万u/g）溶液与6ml pH为6.0，15mg/ml的菠萝蛋白酶(酶活：10万u/g）溶液于锥形瓶中，
其中所述的果胶酶溶液采用浓度为0.05mol/L的醋酸溶液和浓度为0.05mol/L醋酸钠溶液配制而成；
所述的菠萝蛋白酶溶液采用0.05mol/L的醋酸溶液和浓度为0.05mol/L醋酸钠溶液配制而成；
然后用移液管分别吸取36ml和36ml pH为6.0的浓度为0.05mol/L的醋酸溶液和浓度为0.05mol/L醋酸钠溶液置入锥形瓶中，轻微摇动使体系混合均匀，把1.0g溶胀的环氧基大孔树脂（参考文献Immobiliztion of candida lipolyticalipase on macroporous beaded terpolymers with epoxy groups.Wentao Liu,Hongdong Duan,Xia Meng,Dawei Qin.Journal of Applied polymer science.2013(127)4251-4255制得.）加入到锥形瓶中，用保鲜膜将锥形瓶盖好，然后放入35℃恒温振荡器中，在200rpm转速条件下，震荡6h，使其充分固定即可获得固定化复合酶；
取大蒜片100g，微波处理使大蒜片中的蒜氨酸酶失活，然后调节匀浆机8000r/min将大蒜片制成蒜浆，常温下循环超声波提取得到大蒜粗提取液，过滤，滤液流经离子交换树脂，25w/w%氨水洗脱树脂吸附的蒜氨酸得到蒜氨酸溶液，残留液为除蒜氨酸的废液，其中所采用的离子交换树脂为丙烯酸型阳离子交换树脂。
取17mg上述固定化复合酶，加入到680mL用浓度为1mol/L的氢氧化钠和浓度为1mol/L的盐酸溶液配制的pH值为6.0的上述蒜氨酸废液中，50℃下，350rpm转速条件下，恒温震荡90min，之后经减压过滤、0.5μm～5μm的超滤膜分离、浓缩、喷雾干燥得到大蒜多糖产品，大蒜多糖的得率在70.03%以上，大蒜多糖纯度为90.12%。
实施例5
取15ml pH为6.5，15mg/ml的果胶酶（酶活：10万u/g）溶液与5ml pH为6.5，15mg/ml的菠萝蛋白酶(酶活：10万u/g）溶液于锥形瓶中，
其中所述的果胶酶溶液采用0.05mol/L柠檬酸溶液和浓度为0.05mol/L柠檬酸钠溶液配制而成；
所述的菠萝蛋白酶溶液采用0.05mol/L柠檬酸溶液和浓度为0.05mol/L柠檬酸钠溶液配制而成；
然后用移液管分别吸取35ml和45ml pH为6.5的浓度为0.05mol/L柠檬酸溶液和浓度为0.05mol/L柠檬酸钠溶液制备的溶液置入锥形瓶中，轻微摇动使体系混合均匀，把1.0g溶胀的环氧基大孔树脂（参考文献Immobiliztion ofcandida lipolytica lipase on macroporous beaded terpolymers with epoxygroups.Wentao Liu,Hongdong Duan,Xia Meng,Dawei Qin.Journal of Appliedpolymer science.2013(127)4251-4255制得.）加入到锥形瓶中，用保鲜膜将锥形瓶盖好，然后放入35℃恒温振荡器中，在200rpm转速条件下，震荡6h，使其充分固定即可获得固定化复合酶；
取大蒜片100g，微波处理使大蒜片中的蒜氨酸酶失活，然后调节匀浆机8000r/min将大蒜片制成蒜浆，常温下循环超声波提取得到大蒜粗提取液，过滤，滤液流经离子交换树脂，25w/w%氨水洗脱树脂吸附的蒜氨酸得到蒜氨酸溶液，残留液为除蒜氨酸的废液，其中所采用的离子交换树脂为丙烯酸型阳离子交换树脂。
取20mg上述固定化复合酶，加入到800mL用浓度为1mol/L的氢氧化钠和浓度为1mol/L的盐酸溶液配制的pH值为6.5的上述蒜氨酸废液中，55℃下，400rpm转速条件下，恒温震荡100min，之后经减压过滤、0.5μm～5μm的超滤膜分离、浓缩、喷雾干燥得到大蒜多糖产品，大蒜多糖的得率在68.98%以上，大蒜多糖纯度为89.25%。
Claims (3)
1.固定化复合酶提取蒜氨酸废液中大蒜多糖的方法，其特征在于：具体步骤如下：取蒜氨酸废液，用浓度为1mol/L的氢氧化钠和浓度为1mol/L的盐酸溶液调节至pH值为4.5-6.5，取5-20mg制备的固定化复合酶加入到200-800mL的pH值为4.5-6.5蒜氨酸废液中，置于恒温振荡器中酶解，酶解温度为35-55℃，转速为200-400rpm，pH值为4.5-6.5，时间为60-100min；酶解后酶解液经过滤，0.5μm-5μm的超滤膜分离，浓缩，干燥得到大蒜多糖产品；蒜氨酸废液采用如下方法获得：微波处理使大蒜片中的蒜氨酸酶失活，然后调节匀浆机8000r/min将大蒜片制成蒜浆，常温下循环超声波提取得到大蒜粗提取液，过滤，滤液流经离子交换树脂，25w/w％氨水洗脱树脂吸附的蒜氨酸得到蒜氨酸溶液，残留液为蒜氨酸废液；其中所采用的离子交换树脂为丙烯酸型阳离子交换树脂；固定化复合酶为固定在环氧基大孔树脂载体中的果胶酶和菠萝蛋白酶，所述果胶酶与菠萝蛋白酶的用量比例按酶活计为1：3-3：1；所述环氧基大孔树脂载体为：采用悬浮聚合法以甲基丙烯酸缩水甘油酯为功能单体，二甲基丙烯酸乙二醇酯为交联剂，合成环氧基大孔树脂载体，选取80-110目的环氧基大孔树脂载体作为固定化复合酶用环氧基大孔树脂载体；固定化复合酶制备方法为：将选取1.0g的环氧基大孔树脂载体溶胀；将果胶酶及菠萝蛋白酶分别用pH为4.5-6.5缓冲液配置成15mg/ml的酶溶液，之后分别吸取5.0-15.0ml果胶酶及菠萝蛋白酶溶液并转移到锥形瓶中，然后再用移液管吸取40.0-80.0ml的pH为4.5-6.5的缓冲溶液置入锥形瓶中，轻微摇动使体系混合均匀，把溶胀的环氧基大孔树脂载体加入到锥形瓶中，用保鲜膜将锥形瓶盖好，然后放入35℃恒温振荡器中，在200rpm转速条件下，振荡6h，使其充分固定即得；其中所采用的缓冲溶液是浓度为0.05mol/L的醋酸溶液和浓度为0.05mol/L醋酸钠溶液，或浓度为0.05mol/L柠檬酸溶液和浓度为0.05mol/L柠檬酸钠溶液。
2.根据权利要求1所述的固定化复合酶提取蒜氨酸废液中大蒜多糖的方法，其特征在于：所采用的过滤为减压过滤；所述的超滤膜分离时，所用组件为中空纤维膜组件或陶瓷膜组件。
3.根据权利要求1所述的固定化复合酶提取蒜氨酸废液中大蒜多糖的方法，其特征在于：所采用的过滤为减压过滤；所述的超滤膜分离时，所用组件为平板膜或卷式膜。
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