CN107722088A - 一种低糖基化普鲁宁的制备及其在止咳化痰药物中的应用 - Google Patents

一种低糖基化普鲁宁的制备及其在止咳化痰药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及低糖基化普鲁宁的制备及其在用于咳化痰药物中的应用。低糖基化普鲁宁是由柚苷等原料经过两次生物酶催化制得。经过两次生物酶催化，解决了普鲁宁的水溶性和脂溶性差问题，经过低糖基化普鲁宁比普鲁宁溶解度提高了75倍以上，生物利用度显著提高，可以让普鲁宁得到广泛应用。本发明的低糖基化普鲁宁具有更好的止咳化痰作用，对于由急、慢性支气管炎以及感冒等引起的各种咳嗽气喘疗效显著，未见毒副作用，比传统的止咳药‑(念慈)川贝枇杷膏的疗效更为显著，是止咳化痰理想药物，拥有广阔的市场前景。

Description

一种低糖基化普鲁宁的制备及其在止咳化痰药物中的应用
技术领域
本发明涉及一种低糖基化普鲁宁的制备及其在止咳化痰药物中的应用
技术背景
咳、痰、喘是呼吸系统疾病的常见症状，日常生活中尤常见于急、慢性支气管炎、感冒等所引起，临床是以咳嗽、咯痰伴有喘息及反复发作为特征，是由于感染或非感染因素引起的气管、支气管粘膜及周围组织的急、慢性非特异性炎症。属中医学的咳嗽、痰饮、哮喘范畴，是一种常见病、多发病。特别是中老年人由于环境因素和生活习惯的影响，容易产生咳嗽、咯痰等支气管炎症状，发病期间没有很好的进行治疗控制，而逐渐发展成为疾病的。
对于用中医药来止咳化痰，人们已经进行了很多的努力，像橘红丸、克咳片等，已进入市场但从其特点而言，目前已上市的该类药物还是具有服药量多而不方便的特点，而且效果并不明显。因此有必要继续研制出服用安全、疗效可靠的止咳化痰新药物。柚皮素是黄酮类化合物的苷元，广泛存在于柚皮、柑橘等植物组织中，是一种黄酮类物质，具有，抗菌，消炎，抗癌，解痉和利胆，治疗心血管疾病，降胆固醇等方面的作用。本发明以小鼠和家兔为动物实验模型验证了低糖基化普鲁宁在止咳化痰中的效果，经过试验验证低糖基化普鲁宁比传统的止咳化痰的效果更为显著。
黄酮化合物广泛存在于芸香科植物中，不同类型的黄酮类化合物在人体中的代谢途径和生物利用度不同，苷元型黄酮化合物易于人体的吸收和利用，可通过小肠壁直接吸收进入血液，而糖苷型的黄酮化合物需要在肠腔中微生物的作用下，通过降解和代谢途径转化为苷元型黄酮，才能被人体吸收和利用。因此，苷元型黄铜化合物具有更高的生物利用价值和营养价值。苷元型黄酮一般在水中的溶解度低，不利于苷元黄酮的生物利用和发挥黄酮苷元的药效。因此，为增加苷元黄酮的溶解性，科研人员在溶剂中加入碱如：在溶液中加入NaOH、KOH等，或者加入有机溶剂如：乙醇，二甲基亚砜等，大大提高苷元黄酮的溶解性，但是强碱和有机溶剂对人体有害，会限制苷元黄酮开发利用。
普鲁宁是单糖基化柚皮素，国内外的药理研究表明：普鲁宁具有杀菌、抗氧化、抗病毒、抗缺血、抗肿瘤、消炎、抗过敏等多种药理活性(Grzechulska J，ApplCatal B，2002，36(1):45－51；Daghrir R，Ind Eng Chem Res，2013，52(10):3581－3599)。普鲁宁最初由南朝鲜民间药物山桃中提取得到的，其在自然界中主要分布于苏木科、蔷薇科、大戟科等植物中。其在自然界中含量少且提取率低，又因水溶性、脂溶性差，较难获得，价格昂贵。目前普鲁宁的制备方法主要有一下两种，化学合成法和酶法水解柚皮苷法。相对于化学法合成普鲁宁，反应条件苛刻、产物分离繁琐且对环境危害大的缺点；利用酶法(α-L-鼠李糖苷酶切掉柚苷鼠李糖糖基后得到普鲁宁(胡群芳Modern Food Science and Technology 2015,Vol.31,No.1))水解柚苷制备普鲁宁的条件温和、转化率高、安全环保，因此研究酶法制备普鲁宁具有很高的应用价值。但是普鲁宁在水中溶性和脂溶性都极低(＜10mg/L)，这大大限制了普鲁宁的应用，使普鲁宁生物利用度较低。
本发明旨在提高普鲁宁的在水中的溶解度，来提高普鲁宁的生物利用度。因此，本发明通过2次酶法获得低糖基化普鲁宁溶解度是普鲁宁的75倍以上，药物制剂的半衰期也有明显的延长，低糖基化普鲁宁生物利用度提高10倍以上。具体实施方法如下：
一种低糖基化普鲁宁，其特征在于化学结构式如I所示：
其中
R1＝H, 其中n＝1～3；
R2＝H或Rha；
低糖基化普鲁宁制备自高糖基化母体，其结构式如Ⅱ所示：
R1＝H, n＝4～10；
R2＝H，Rha；
高糖基化普鲁宁制备自柚苷、柚皮素、普鲁宁等柑橘或者柚子提取物；在对普鲁宁高糖基化时，糖基化酶为UDP-糖基转移酶等得到高糖基化普鲁宁(糖基化程度为4-10个糖基)。高糖基普鲁宁用α-L-鼠李糖苷酶、葡萄糖淀粉酶、木糖聚酶制备低糖基化普鲁宁(糖基化程度小于4个糖基)。
低糖基化普鲁宁的结构通式
发明内容
本发明第一个目的在于，提供一个低糖基化普鲁宁的制备方法。
本发明第二个目的在于，提供一个低糖基化普鲁宁对急、慢性支气管炎以及感冒等引起的咳嗽痰多等急症的药物的制备方法。
本发明低糖基化普鲁宁是通过一下途径实现的。
1.制备低糖基化普鲁宁干粉
(1)制备柚苷超滤溶液
以质量分数为50～98％的柚苷溶于氢氧化钠或氢氧化钾溶液的摩尔浓度为0.1～1mol/L中，在30～40℃条件下处理30min，即柚苷溶液。将制备出的柚苷溶液泵入截留分子量为1000～2000Da的聚醚砜膜超滤器中，控制超滤压力为0.1～0.3MPa，进行超滤处理，直至超滤截留液体积降低至化橘红中的黄酮化合物溶液体积的1/10～1/20时停止，分别收集超滤滤过液和超滤截留液，收集的超滤滤过液，即为柚苷超滤溶液。
(2)制备高糖基化普鲁宁溶液
第(1)步完成后，在超滤滤过液加入糖苷转移酶：环糊精的质量比为1:20～80投入到反应容器中，25～70℃恒温搅拌1～20h，然后泵入4000～5000Da的聚醚砜膜超滤器中，在温度不高于50℃、流速不低于15mL/min、操作压力0.6～1.1MPa的条件下超滤分离回收，截留液中主要为糖苷转移酶，返回到糖苷转移酶容器中重复利用6-8次。对收集的超滤液，即为高糖基化普鲁宁溶液。
(3)制备低糖基化普鲁宁溶液
将高糖基化普鲁宁溶液浓缩至原来1/3时泵入反应釜中，然后加入活性不低于100U/mg的糖苷酶溶液，高糖基化普鲁宁溶液：糖苷酶溶液＝1:0.05～1。在25～70℃恒温搅拌1～20h，然后泵入1000～1500Da的聚醚砜膜超滤器中，在温度不高于50℃、流速不低于15mL/min、操作压力0.6～1.1MPa的条件下超滤分离回收，截留液中主要为糖苷酶，返回到糖苷酶容器中重复利用。对收集的超滤液，即为低糖基化普鲁宁溶液。
所用糖苷转移酶的活性不低于100U/mg的糖苷转移酶，即环糊精葡萄糖苷转移酶、麦芽糖基转移酶、4-α-葡萄糖转移酶、α-淀粉酶中的一种或一种以上混合物；所用糖基为，葡萄糖、UDP-葡萄糖、UDP-木糖、环糊精、可溶性淀粉、果糖等。
糖苷酶活性不低于100U/mg，选用的酶为以α-L-鼠李糖苷酶、葡萄糖化酶、葡萄糖淀粉酶、木糖聚酶、α-L-鼠李糖苷酶或者它们的固定化产品。
(4)制备低糖基化普鲁宁干粉
第(3)步完成后，将截留液在温度40～50℃、真空度0.09～0.l MPa的条件下减压浓缩至膏状，经过冷冻干燥或者喷雾干燥得到低糖基化普鲁宁干粉。
经过低糖基化后，柚苷的综合利用能达到90％，得到低糖基化普鲁宁干粉的纯度能达到98.3％以上。
本发明的低糖基化普鲁宁的药效是通过一下实验方案得到的。
1.制备低糖基化普鲁宁在医药上可接受的制剂。
本发明所说的低糖基化普鲁宁在制备止咳化痰的药物，其成分中可以含有0.1-10％wt低糖基化普鲁宁。所说的低糖基化普鲁宁药物可以由糖基化普鲁宁单体组成，或者由低糖基化普鲁宁与其他有效成分或常规制药辅料组成。
上述的低糖基化普鲁宁药物是通过选择通用剂型的常规辅料或者不加辅料，用常规方法制备成所需的不同剂型的药物制剂。加入的辅料可以为固体、半固态或者液体物质，作为低糖基化普鲁宁的载体、赋形剂或者介质。因此，低糖基化普鲁宁药物制剂可以为片剂、粉剂、小药囊剂、甘香酒剂、混悬剂、乳剂、溶液、糖浆、气雾剂、吸入剂、软或硬胶囊、无菌注射液等各种剂型。
低糖基化普鲁宁药物的制剂包括：胶囊剂，其内含物含有0.5-99.5％wt的低糖基化普鲁宁或通常由不少于0.5％wt的低糖基化普鲁宁与其他有效成分或各种常规辅料组成；片剂，其成分中含有不少于0.1％wt的低糖基化普鲁宁或通常可由少于0.1％wt的低糖基化普鲁宁与其他有效成分或各种常规辅料组成；吸入剂，其内含物含有0.5-99.5％wt％wt的低糖基化普鲁宁或通常由不少于0.1％wt的低糖基化普鲁宁与其他有效成分或各种常规辅料组成；其与粉剂、小药囊剂、甘香酒剂、混悬剂、乳剂、溶液、糖浆、气雾剂、软或硬胶囊、无菌注射液各种剂型其内有0.5-10％wt的低糖基化普鲁宁以及可接受的辅料。
2.本发明是通过以下方法进行药效评价。
发明人对基化普鲁宁进行实验动物小白鼠的止咳实验。结果表明：低糖基化普鲁宁对刺激小鼠引起咳嗽的耐受时间，与空白对照组比较，均有显著的延长，在统计学上有显著差异(P＜0.05)；与阳性对照物氢溴酸右美沙片比较，耐受时间延长，疗效较阳性对照药物氢溴酸右美沙片显著。
发明人对低糖基化普鲁宁进行实验动物小白鼠的化痰实验。结果表明：低糖基化普鲁宁对小鼠支气管分泌液增加，与空白对照组比较，有显著的增加，统计学上有显著差异(P＜0.05)，与阳性对照药物痰咳净比较，对小鼠支气管分泌液显著增加，统计学上有显著差异(P＜0.05)，疗效较阳性对照药物痰咳净显著。说明低糖基化普鲁宁具有化痰的作用。
实验证明，低基糖化普鲁宁不仅具有很好止咳化痰作用，而且在小鼠实验中没有毒性。动物实验结果表明，当2000mg/kg剂量的基糖化普鲁宁口服给药动物时，动物未见毒性反应，该剂量相当于人服用剂量为4-6g基糖化普鲁宁/kg体重。
本发明所述的低糖基化普鲁宁药物在0.1-700mg低糖基化普鲁宁/kg体重/天，具有良好的止咳化痰效果，优选的日剂量为1-100mg低糖基化普鲁宁/kg体重/天。
本发明所述的低糖基化普鲁宁药物，具有良好的止咳化痰效果。能有效治疗急、慢性支气管炎以及感冒引起的咳嗽痰多病症。并且具有质量稳定、服用量小、疗效迅速、安全等。
综上所述，说明基糖化普鲁宁具有良好的止咳化痰效果，能很好的治疗临床中由于急、慢性支气管炎以及感冒等引起的咳嗽痰多。因此，可用于制备止咳化痰药物。
附图说明
图1：低糖基化普鲁宁颗粒剂溶解度
下面结合实施案例对本发明做进一步的说明。
各实施例中所涉及的材料用料配比及成分含量中的固体与固体、液体与液体以及液体与固体的比分别以wt/wt(质量比)、v/v(体积比)、wt/v(重量/体积比)计算，除非另有说明。
实施例1：制备低糖基化普鲁宁
(1)制备柚苷超滤溶液
以质量分数为50～98％的柚苷溶于氢氧化钠或氢氧化钾溶液的摩尔浓度为0.1～1mol/L中，在30～40℃条件下处理30min，即柚苷溶液。将制备出的柚苷溶液泵入截留分子量为1000～2000Da的聚醚砜膜超滤器中，控制超滤压力为0.1～0.3MPa，进行超滤处理，直至超滤截留液体积降低至化橘红中的黄酮化合物溶液体积的1/10～1/20时停止，分别收集超滤滤过液和超滤截留液，收集的超滤滤过液，即为柚苷超滤溶液。
(2)制备高糖基化普鲁宁溶液
第(1)步完成后，在超滤滤过液加入糖苷转移酶：环糊精的质量比为1:20～80投入到反应容器中，25～70℃恒温搅拌1～20h，然后泵入4000～5000Da的聚醚砜膜超滤器中，在温度不高于50℃、流速不低于15mL/min、操作压力0.6～1.1MPa的条件下超滤分离回收，截留液中主要为糖苷转移酶，返回到糖苷转移酶容器中重复利用。收集的超滤液，即为高糖基化普鲁宁溶液。
(3)制备低糖基化普鲁宁溶液
将高糖基化普鲁宁溶液浓缩至原来1/3时泵入反应釜中，然后加入活性不低于100U/mg的糖苷酶溶液，高糖基化普鲁宁溶液：糖苷酶溶液＝1:0.05～1。在25～70℃恒温搅拌1～20h，然后泵入1000～1500Da的聚醚砜膜超滤器中，在温度不高于50℃、流速不低于15mL/min、操作压力0.6～1.1MPa的条件下超滤分离回收，截留液中主要为糖苷酶，返回到糖苷酶容器中重复利用6-8次。对收集的超滤液，即为低糖基化普鲁宁溶液。
所用糖苷转移酶的活性不低于100U/mg的糖苷转移酶，即环糊精葡萄糖苷转移酶、麦芽糖基转移酶、4-α-葡萄糖转移酶、α-淀粉酶中的一种或一种以上混合物；所用糖基为，葡萄糖、UDP-葡萄糖、UDP-木糖、环糊精、可溶性淀粉。
糖苷酶活性不低于100U/mg，选用的酶为以α-L-鼠李糖苷酶、葡萄糖化酶、葡萄糖淀粉酶、木糖聚酶、α-L-鼠李糖苷酶或者它们的固定化产品。
(4)制备低糖基化普鲁宁干粉
第(3)步完成后，将截留液在温度40～50℃、真空度0.09～0.l MPa的条件下减压浓缩至膏状，经过冷冻干燥或者喷雾干燥得到低糖基化普鲁宁干粉。经过低糖基化后，柚苷的综合利用能达到90％。
实施例2：低糖基化普鲁宁纯度分析
1、液相分析条件：色谱柱(型号C18 250×4.6mm)；流速：1.0ml/min；流动相：0.5％醋酸溶液：乙腈＝7:3；检测波长：346nm；进样量:10μl。
2、流动相的制备：用超纯水与冰乙酸(试剂纯)制备0.5％的醋酸溶液1000ml，用液相用抽滤器过滤至无肉眼可见杂质，超声半小时除气泡；取500ml乙腈(分析纯)，用液相用抽滤器过滤至无肉眼可见杂质，超声半小时除气泡。
3、已知浓度样品溶液的配制及分析：取5.0mg样品分别溶于10ml 50％DMSO溶液中，震荡使完全溶解。用注射器及针筒式滤膜过滤器过滤每种浓度溶液1ml于液相进样瓶中，做高效液相分析。
4、样品纯度分析：取任意一浓度的样品溶液做高效液相分析，通过峰面积百分比计算纯度。
从峰面积可以得到糖基化普鲁宁纯度为98.3％。
实施例3：低糖基化普鲁宁药物的止咳药理学实验
1、实验动物：NIH小鼠，雄性，体重18.0-22.0g，普通级标准，共90只。先将动称重，编号，选择健康，体重在18.5-21.5g的小鼠共75只。按体重大小排序，用随机分组法分成五组，每组15只。设阴性对照组，阳性对照组和低糖基化普鲁宁药物样品低剂量组、低糖基化普鲁宁药物样品中剂量组、低糖基化普鲁宁药物样品高剂量组。
2、样品来源与处理
1)空白对照组：生理盐水，NaCl含量0.9％。
2)阳性对照组：取美沙芬2片溶解于20mg生理盐水中，即得阳性对照美沙芬溶液，美沙芬浓度为1.5mg/ml。
3)低糖基化普鲁宁药物样品低剂量组：取低糖基化普鲁宁适量，用生理盐水定容于容量瓶中，低糖基化普鲁宁浓度为0.5mg/ml。
4)低糖基化普鲁宁药物样品中剂量组：取低糖基化普鲁宁适量，用生理盐水定容于容量瓶中，低糖基化普鲁宁浓度为1.5mg/ml。
5)低糖基化普鲁宁药物样品高剂量组：取低糖基化普鲁宁适量，用生理盐水定容于容量瓶中，低糖基化普鲁宁浓度为4.5mg/ml。
1、实验方法：(浓氨水喷雾法)
小鼠灌胃1h后，开始接受喷雾。按一定时间喷入浓氨水气雾，喷雾结束，立即取出小鼠，观察有无咳嗽反应，观察一分钟内咳嗽次数，若1分钟内出现3次以上典型咳嗽动作(腹肌收缩或缩胸，同时张大嘴，有时可有咳声)者，算作“有咳嗽”。否则算作“无咳嗽”。
1、实验过程：
用序贯法(上下法)求出引起半数小鼠咳嗽的喷雾时间(EDT50)。计算R值，若R值大于130％，说明药物有止咳作用。若R值大于150％，则表明有显著的止咳作用。计算公式如下：
EDT50＝log-1c/n(式中n为动物数，c为rx值的总和，r为每计量的动物数，x为剂量(即喷雾时间)的对数)。
2、实验结果：
经统计，各样品组半数咳嗽时间及止咳效果见表1
表1.各样品的止咳效果
从低糖基化普鲁宁样品和阳性对照药物美沙芬，经口给药对刺激小鼠引起咳嗽的耐受时间比较，低糖基化普鲁宁对小鼠耐受时间有显著的延长，比阳性对照药物美沙芬的耐受时间长，在统计学上有显著差异。说明低糖基化普鲁宁对剌激小鼠引起咳嗽的耐受时间与美沙芬比较，耐受时间延长，疗效显著。具有良好的止咳化痰作用，对急、慢性支气管炎以及感冒等引起的咳嗽痰多等病症具有明显的疗效。
实施例4低糖基化普鲁宁药物的化痰药理学实验
1、实验动物：NIH小鼠，雄性，体重18.0-22.0g，普通级标准，共90只。先将动称重，编号，选择健康，体重在18.5-21.5g的小鼠共75只。按体重大小排序，用随机分组法分成五组，每组15只。设阴性对照组，阳性对照组和低糖基化普鲁宁药物样品低剂量组、低糖基化普鲁宁药物样品中剂量组、低糖基化普鲁宁药物样品高剂量组。
2.样品来源与处理
1)空白对照组：生理盐水，NaCl含量0.9％。
2)阳性对照组：取0.2g痰咳净散剂溶解于10ml生理盐水中，即得阳性对照痰咳净溶液，浓度为20mg/ml。
3)低糖基化普鲁宁药物样品低剂量组：精密称量低糖基化普鲁宁样品5mg，用蒸馏水定容到10ml容量瓶中，超声波溶解5min，摇匀，即得，浓度为0.5mg/ml。
4)低糖基化普鲁宁药物样品中剂量组：精密称量低糖基化普鲁宁样品15mg，用蒸馏水定容到10ml容量瓶中，超声波溶解5min，摇匀，即得，浓度为1.5mg/ml。。
5)低糖基化普鲁宁药物样品高剂量组：精密称量低糖基化普鲁宁样品45mg，用蒸馏水定容到10ml容量瓶中，超声波溶解5min，摇匀，即得，浓度为4.5mg/ml。。
3、实验方法：
1)标准酚红曲线的绘制：用分析天平准确称取一定量的酚红，用5％的碳酸氢钠溶解，配成每1ml12.5ng，然后顺次进行倍比稀释成每ml含酚红6.235ng、3.125ng、1.5625ng、0.7813ng、0.3906ng、0.1953ng，0.0977ng、0.0488ng，用分光光度计测OD值。以酚红浓度为纵坐标，OD值为横坐标，根据酚红浓度和OD值计算出回归方程。根据回归方程计算出各鼠酚红的排泄量。
2)小鼠禁食不禁水12h
3)灌胃给药。按动物号顺序，每只小鼠灌胃后停3分钟，再灌另外一只，时间间隔3min，每组10只总共灌胃时间30min。
4)各鼠灌胃后半小时，经腹腔注射5％酚红生理盐水溶液0.2ml。按顺序，即每一只小鼠腹腔注射酚红后3min，再注射另外一只，10只小鼠共30min。
5)各鼠腹腔注射后半小时，按顺序脱颈椎处死小鼠，处死时间间隔3min。动物处死后，仰位固定于手术板上，剪开颈正中皮肤，分离气管，用小镊子支起气管。
6)用大注射器吸取生理盐水冲洗气管外壁，洗去血液和气管外壁中的酚红，滤纸吸干洗液。
7)先于气管分支处剪下气管，再于另一端甲状软骨上端剪下气管(环状甲状软骨包括在内)。
8)将各气管段放入预先盛有1.5ml的5％NaHCO3溶液试管中。
9)在3分钟内完成上述气管分离剪切工作。再用同样方法处理第二只小鼠。方法如上。
10)将各试管置超声波清洗器上超声5分钟，使气管段中的酚红释放出来。
11)将各试管中溶液于721型分光光度计546nm处测OD值。
12)将各试管含气管段放置过夜，24h后测OD值。
13)根据回归方程计算出酚红的含量。计算公式：Y＝7.3266X-0.04554.X为OD值，Y为酚红含量。
14)根据酚红含量和动物体重计算出校正酚红含量，用SPSS8.0统计软件进行方差分析。校正酚红含量＝酚红含量(ng)/小鼠体重(kg)。
4、实验结果：
经统计，各剂量组酚红排出量见表
表2.普鲁宁的化咳效果(X±S)
a：校正酚红含量＝酚红含量/动物体重 b:化痰率＝给药组/空白对照组×100％
酚红含量计算方法(ng)：OD值×7.6266-0.0554
从低糖基化普鲁宁样品和阳性药痰咳净，经口给药对小鼠支气管分泌液增加实验看，低糖基化普鲁宁低、中、高剂量组各剂量组对小鼠支气管分泌液的分泌，与空白对照组比较，均有显著的增加，在统计学上有显著差异。高剂量组与阳性对照业务痰咳净比较，对小鼠支气管分泌液有显著。说明低糖基化普鲁宁具有良好的止咳化痰作用，对急、慢性支气管炎以及感冒等引起的咳嗽痰多等病症具有明显的疗效。
实施例5低糖基化普鲁宁颗粒剂溶出度的测定
1分析方法学的建立
检测波长的确定：分别称低糖基化普鲁宁和辅料适量，用甲醇配制成适宜浓度的溶液，并以甲醇为空白对照，于200～700nm范围内进行扫描。结果表明在346nm处有低糖基化普鲁宁的最大吸收峰；而辅料在此处对低糖基化普鲁宁的测定均无干扰。因此，选定346nm作为测定波长。标准曲线：精密称低糖基化普鲁宁适量，用甲醇配制成系列浓度的溶液，于346nm处测定吸收度，以浓度(C)对吸收度(A)进行线性回归。
2低糖基化普鲁宁溶出度的测定方法
称取化含有普鲁宁83nmol(50mg)的固体颗粒，以及含有低糖基化普鲁宁83nmol的固体颗粒样品进行溶出度试验。每组样品平行测定3份，按中国药典2015版第二法进行。溶出介质为900mL的蒸馏水，温度为37±0.5℃，转速为100±3rpm。分别在3、6、9、12、15min取样5mL并补入相同体积的溶出介质，样品经0.8μm微孔滤膜过滤。取续滤液稀释后于346nm处测定吸收度，计算化低糖基化普鲁宁的溶出度。
3测定结果
标准曲线方程C＝17.5317A+0.162,R2＝0.9914，线性范围：1.478～66.771μg/mL。本发明采用体外溶出度实验以普鲁宁原料药为对照，测定低糖基化普鲁宁在体外的溶出情况，结果表明，低糖基化普鲁宁在体外溶出情况良好。结果见表三
表三低糖基化普鲁宁-聚乙烯吡咯烷酮K30颗粒的溶出速率
从表一可以看出，原料药普鲁宁在15min体外累计溶出的百分比为13.13％，而在本发明的低糖基化普鲁宁在3-15min内达到标量的96.33％-99.41％，制成的糖基化后的溶出速度均高于普鲁宁。因此糖基化增加了药物的体外释放速度。
实施例6低糖基化普鲁宁颗粒剂溶解度的测定
低糖基化普鲁宁颗粒剂溶于水，溶解能力的大小直接影响到药物在溶液体系和细胞体系的应用。因为普鲁宁在水溶液中稳定，所以我们利用紫外分光光度法对饱和状态的普鲁宁的水溶液进行溶解度值的测定。本实验中，我们配制0.3g/L普鲁宁的水溶液，按照一定比例稀释后测吸光度做出标准曲线，对346nm区间的特征峰进行积分作为纵坐标。再测定配制的饱和溶液稀释液的吸光值，通过内标法得到稀释液的浓度，最后计算出饱和溶液浓度。标准曲线如图1。
标准曲线方程为y＝1547.1294A-28.37,R2＝0.9978。饱和溶液经50倍稀释后，吸光度积分值为690.16，浓度为0.446g/L，则低糖基化普鲁宁的溶解度是22.3g/L。
实施例7低糖基化普鲁宁药物的毒理学实验
在28±1℃的温度，70±5％的湿度条件下，选取7-8周龄，健康的清洁级NIH小鼠20只雌雄各半，体重在20-22g。将饲料和水消毒，试验前和试验的观察期内，均按正常饲料条件饲养。
将低糖基化普鲁宁溶解在0.5％Tween80中，浓度为300mg/ml，将该液体经口给药小鼠，给药剂量为0.4ml/20g小鼠体重。给药后观察1,4,8,12小时，以后每12h观察一次。观察死亡情况，每天记录小鼠体重变化以及其他的症状。第10天，断颈处死小鼠，取各器官进行病理检查。
在第10天，全部小鼠存活，2.0g/kg剂量的低糖基化普鲁宁未见毒性反应。小鼠各器官病理检查正常，没有发现病变，10天内小鼠体重未见减轻。因此，说明本发明的低糖基化普鲁宁药物在口服给药动物时未见毒性。
实施例8低糖基化普鲁宁胶囊制剂
按以下成分配比制备成明胶胶囊：
成分 组分(％)
干燥淀粉 35
低糖基化普鲁宁 60
微粉硅胶 5
总计 100
将辅料与低糖基化普鲁宁混合均匀，装入明胶胶囊中，即得。装量：100mg/胶囊。
实施例9低糖基化普鲁宁片剂
按以下成分配比制备成片剂：
将低糖基化普鲁宁与淀粉混合均匀，加淀粉浆继续搅拌使成软材，用10目尼龙帅质粒，80-90℃通风干燥，干粒加入硬脂酸镁，经过12目嗮整粒，混匀，压成片剂。共得10000片，每片片重约为0.1g。
实施例10低糖基化普鲁宁吸入剂
按以下成分配比制备成片剂：
成分 组分(g)
低糖基化普鲁宁 100
乳糖 500
泊洛沙姆 1
微粉硅胶 10
L-亮氨酸 0.5
PEG400(50％)水溶液 300
总计 911.5
将低糖基化普鲁宁、乳糖、泊洛沙姆、L-亮氨酸用PEG400水溶液溶解，再进行喷雾干燥，所得喷雾干燥粉末加入微粉硅胶，混合均匀，分装于胶囊型干粉吸入装置中。
实施例11低糖基化普鲁宁的生物利用度实验
1、样品制备：分别取普鲁宁编号为①和低糖基化普鲁宁编号为②两个样品；
2、试验方法：试验动物采用体重约2kg的健康家兔40只(由中山大学实验动物中心提供)，动物随机分为四组，预先禁食12h后，分别灌胃给予上述样品，剂量为300mg/kg(相当于70kg成人日服用剂量4g)，给予样品后密集测定血浆中普鲁宁和低糖基化普鲁宁的含量，至达峰时间后半小时，检测血药峰浓度(Cmax)；
试验样品灌胃结束后，停药一段时间，至动物体内样品完全代谢，然后静脉注射给予等剂量样品溶液，并测定血浆中样品含量(μg/mL)，以此作为参比数据；
结果见表七：
表七：低糖基化普鲁宁生物利用度
试验样品 ① ②
给药量(g) 0.6 0.6
样品含量(％) 2.66 2.60
样品给药剂量(mg) 16.00 15.60
静脉给样血浆样品浓度(μg/mL) 72.91 70.16
口服给样血浆中样品峰浓度Cmax(μg/mL) 10.98 65.33
吸收率(％) 15.06 93.12
试验结果表明：本发明所述普低糖基化普鲁宁(②号样品)中吸收率高，为普鲁宁(①号样品)的6.18倍，其生物利用度大大提高。

Claims (10)

1.一种低糖基化普鲁宁，其特征在于化学结构式如I所示：
其中：
R1＝H, 其中n＝1～3。
2.按照权利要求1所述，低糖基化普鲁宁制备自高糖基化母体，其结构式如Ⅱ所示：
R1＝H, 其中n＝4～10；
R2＝H或Rha。
3.按照权利要求1所述，高糖基化普鲁宁制备原料来自柚苷、柚皮素、普鲁宁等柑橘或柚子提取物。
4.按照权利要求1所述，高糖基化普鲁宁(糖基化程度为4-10个糖基)是通过糖基转移酶来制备得到的，其中糖基转移酶为环糊精葡萄糖基转移酶和UDP-糖基转移酶。
5.按照权利要求1所述，其中UDP-糖基转移酶包括UDP-葡萄糖基转移酶、UDP-木糖基转移酶、UDP-鼠李糖基转移酶、UDP-半乳糖基转移酶、UDP-果糖基转移酶中一种或/和两者及以上组合。
6.按照权利要求4所述，高糖基化普鲁宁以糖基化酶、α-L-鼠李糖苷酶、葡萄糖化酶、葡萄糖淀粉酶、木糖聚酶、果糖聚酶等制备低糖基化普鲁宁(糖基化程度小于4个糖基)。
7.如权利要求6所述，低糖基化普鲁宁在止咳、化痰、平喘药物中的应用。
8.如权利要求7所述，低糖基化普鲁宁在止咳化痰药物中的应用，其特征在于低糖基化普鲁宁以及在药学上可接受的载体，或者作为有效成分的低糖基化普鲁宁与其他有效成分或常规的制药辅料组成。
9.一种药用组合物，其包含至少一种权利要求1所述的化合物或它的药学上可接受的盐和晶体，及其药学上可接受的载体、赋形剂、稀释剂、辅剂、媒介物或它们的组合。
10.如权利要求6所述，其特征是在于药物含有0.001-100％wt的低糖基化普鲁宁，优选0.01-50％wt的低糖基化普鲁宁，更优选0.1-10％wt的低糖基化普鲁宁。
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