CN103316087A - 肉豆蔻五味有效部位及其制备方法、质量检测方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种肉豆蔻五味有效部位及其制备方法、质量检测方法。该有效部位中总内酯类、总酚类、总萜类等的活性成分百分含量的总和为5～99％(w/w)。有效部位的制备方法可以采用以下任意一种方法，或这些方法的任意组合进行制备:(1)溶剂萃取法；(2)大孔吸附树脂法；(3)超临界C02流体萃取法；(4)液—液逆流分配色谱法。本发明还公开了有效部位中总内酯、总萜Santamarine，木香烃内酯，去氢木香内酯，异土木香内酯，土木香内酯，11,13-二氢异土木香内酯的含量测定方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种蒙药的有效部位，特别涉及肉豆蔻五味有效部位及其制备方法、质量检测方法以及在药品和保健食品等领域的应用，属医药技术领域。
背景技术
肉豆蔻五味由肉豆蔻、木香、土木香、广枣、荜茇5味中药组成，蒙医临床较常用,具有利尿、清泻湿热功能;主要用于心烦失眠、心神不安,是蒙医治疗心脏病的首选方剂。肉豆蔻五味中主要含有内酯类、萜类、酚酸类等成分，但是迄今未见涉及肉豆蔻五味的有效部位及其制备方法和用途的专利。
发明内容
本发明的目的在于提供一种肉豆蔻五味有效部位及其制备方法，还提供一种肉豆蔻五味有效部位的质量检测方法，还提供一种以肉豆蔻五味有效部位为活性成分的药物或功能性食品。
本发明中肉豆蔻五味有效部位的原料药组成为：肉豆蔻80-150重量份、木香60-120重量份、土木香60-120重量份、广枣40-75重量份、荜茇7-20重量份。
本发明中肉豆蔻五味有效部位的原料药组成优选为：肉豆蔻100重量份、木香80重量份、土木香80重量份、广枣50重量份、荜茇10重量份。
本发明肉豆蔻五味有效部位的原料药，可以是市售肉豆蔻五味中各味药材的饮片，也可以是这些植物的茎、叶、花穗、果实、地下根茎及根等任一部位或全部植株，优选的药材来源为：肉豆蔻：为肉豆蔻科植物肉豆蔻Myristica fragrans Houtt.的干燥种仁。木香：为菊科植物木香Aucklandia lappa Decne.的干燥根。秋、冬二季采挖，除去泥沙和须根，切段，大的再纵剖成瓣，干燥后撞去粗皮。土木香：为菊科植物土木香Inulahelenium L.的干燥根。广枣：为蒙古族习用药材，为漆树科植物南酸枣Choerospondiasaxillaris(Roxb.)Burtt et Hill的干燥成熟果实。荜茇：为胡椒科植物荜茇Piperlongum L.的干燥近成熟或成熟果穗,果穗由绿变黑时采收，除去杂质，晒干。其中所述的肉豆蔻五味各味药材包括未经任何炮制处理的原药材、饮片以及炮制品。
本发明肉豆蔻五味有效部位的制备方法：可以采用以下任意一种方法，或这些方法的任意组合进行制备:(1)溶剂萃取法；(2)大孔吸附树脂法；(3)超临界C02流体萃取法；(4)液—液逆流分配色谱法。其中优选的方法为大孔吸附树脂法。
在使用这些方法进行制备时，一般包括以下几个步骤:
(l)提取:所用溶剂可以是水或醇类、酮类及脂类溶剂，或这些溶剂组成的混合溶剂，或由这些溶剂与酸、碱、盐配成的酸性或碱性溶剂。提取方法可以是煎煮法、冷浸法、渗漉法、加热回流法、超声提取法、微波提取法、高压提取法等。优选的提取工艺为：肉豆蔻五味复方药材加50%-95%乙醇，回流提取2-3次，每次1-2小时，溶剂用量为5-15L/Kg。
(2)过滤:包括离心法、抽滤法、超滤法、压滤法等方法，可使用以下任意一种澄清剂或其组合:醇沉剂，高岭土，明胶，各种树脂，聚乙二醇，聚乙三醇，壳聚糖以及天然澄清剂成品如101果汁澄清剂、ZTC+1天然澄清剂等。
(3)浓缩:包括常压或减压条件下的旋转蒸发及减压法、薄膜蒸发法、煎煮浓缩法等。
(4)干燥:包括真空干燥法、喷雾干燥法、冷冻干燥法等。
所述方法(1)溶剂萃取法具体步骤可以为：
取肉豆蔻五味复方药材饮片0.5-1.5重量份，40%-95%乙醇回流提取2-3次，溶剂用量为5～15体积份，每次提取1-2小时，减压回收溶剂，得提取物，先将混悬于水中，使药材与分散后溶液体积比为1：2.5—1：10，然后用低极性的溶剂如石油醚、乙醚、己烷等萃取3-5次，溶剂用量为1-3倍提取物的水溶液，得到脂溶性成分；再用中等极性的溶剂，如氯仿、乙酸乙酯、正丁醇等或是这些溶剂的混合物，经2-5次萃取其中的成分，溶剂用量为1-3倍提取物的水溶液，与之前萃取得到的脂溶性成分混合得到肉豆蔻五味有效部位。
所述方法(2)大孔吸附树脂法具体步骤可以为：
取肉豆蔻五味复方药材饮片0.5-1.5重量份，40%-95%乙醇回流提取2-3次，溶剂用量为8～15体积份，每次提取1-2小时，减压回收溶剂，得提取物，加一定体积的水溶解，使得药材量与分散后溶液体积比为1:8-1:2.5；通过相当生药量的6-10体积倍的AB-8大孔吸附树脂，吸附流速2BV/h，树脂柱径高比为1:5～1:12，2-4倍树脂体积的水洗脱，除杂流速为2～6BV/h；以6-15倍树脂体积的30％-70%乙醇洗脱，洗脱流速为4～9BV/h，收集30％-70%乙醇洗脱液，回收溶剂，减压干燥，再以6-10倍树脂体积的71％-95%乙醇洗脱，洗脱流速为4～9BV/h，收集71％-95%乙醇洗脱液，回收溶剂，减压干燥，将30％-70%乙醇洗脱物与71％-95%乙醇洗脱物混合即为肉豆蔻五味有效部位；
其中所用的大孔树脂是非极性、弱极性、中等极性、弱碱性或弱酸性任意一种类型，如AB-8、D3520、D101、D4020、HPD400、S-8、HZ-806等，其中优选弱极性或中等极性的树脂，如AB-8、D4020、D101等。其中所用的洗脱剂范围可以扩展为水或含水的乙醇、甲醇、丙酮等，优选为0～100％的乙醇。
其中30％-70%乙醇洗脱物与71％-95%乙醇洗脱物混合可以是洗脱物直接混合，也可以将71％-95%乙醇洗脱物用β-环糊精包合或用磷酸氢钙吸收后再与30％-70%乙醇洗脱物混合。β-环糊精与71％-95%乙醇洗脱物量为4:1～6：1，包合温度为65～75℃，包合时间为1.5-3小时。
所述方法(2)大孔吸附树脂法具体步骤还可以为：
取肉豆蔻五味复方药材饮片0.5-1.5重量份，70%-95%乙醇回流提取2-3次，溶剂用量为5～15体积份，每次提取1-2小时，减压回收溶剂，得酯类提取物，药渣中加入40%-70%乙醇回流提取2-3次，溶剂用量为8～15体积份，每次提取1-2小时，减压回收溶剂，得提取物，加一定体积的水溶解，使得药材量与分散后溶液体积比为1:8-1:2.5；通过相当生药量的6-10体积倍的AB-8大孔吸附树脂，吸附流速2BV/h，树脂柱径高比为1:5～1:12，2-4倍树脂体积的水洗脱，除杂流速为2～6BV/h；以6-15倍树脂体积的30％-70%乙醇洗脱，洗脱流速为4～9BV/h，收集30％-70%乙醇洗脱液，回收溶剂，减压干燥，将30％-70%乙醇洗脱物与酯类提取物混合即为肉豆蔻五味有效部位。
30％-70%乙醇洗脱物与酯类提取物的混合可以是洗脱物直接混合，也可以将酯类提取物用β-环糊精包合或用磷酸氢钙吸收后再与30％-70%乙醇洗脱物混合。
β-环糊精与酯类提取物量为4:1～6：1，包合温度为65～75℃，包合时间为1.5-3小时。
所述方法(3)超临界C02流体萃取法具体步骤可以为：
取肉豆蔻五味复方药材饮片0.5-1.5重量份，超临界流体萃取2-3次，每次提取1-3小时，将所得的提取物混悬于水中，然后用低极性的氯仿、乙酸乙酯，萃取其中的成分，得肉豆蔻五味有效部位；
本方法可以对肉豆蔻五味原材料直接进行萃取，也可以对上述任一方法和步骤所获得的产物进行萃取。萃取时可以使用或不使用以下任一种类溶剂及溶剂混合物:水、醇类、酮类及酯类溶剂。
所述方法(4)液—液逆流分配色谱法具体步骤可以为：
取肉豆蔻五味复方药材饮片0.5-1.5重量份，50％-95%乙醇回流提取2-4次，溶剂用量为5-15体积份，每次提取1-3小时，减压回收溶剂，得提取物；先将提取物混悬于水中，然后用低极性的酯类、烷烃类或醚类溶剂(如石油醚、乙醚、己烷、汽油、乙酸乙酯等)萃取得到脂溶性成分，然后用中等极性的溶剂，如氯仿、乙酸乙酯、丙酮、正丁醇等，或是这些溶剂的混合物，萃取获得其中的萜类、酚类等成分，将脂溶性成分与萜类、酚类等成分混合得肉豆蔻五味提取物。
脂溶性成分与萜类、酚类等成分混合可以是直接混合，也可以将脂溶性成分用β-环糊精包合或用磷酸氢钙吸收后再与萜类、酚类等等成分混合。β-环糊精与脂溶性成分量为4:1～6：1，包合温度为65～75℃，包合时间为1.5-3小时。
本方法处理的对象可以是上述提取步骤的产物，也可以是经上述溶剂萃取法、大孔吸附树脂法或超临界萃取法初步纯化后的产物。
上述四种方法还可以任意组合，如大孔吸附树脂法可与超临界C02流体萃取法组合提取，具体步骤如下：
取肉豆蔻五味复方药材饮片0.5-1.5重量份，超临界流体萃取2次，每次提取2小时，得到酯类提取物，取出药渣，药渣中加入40%-70%乙醇回流提取2-3次，溶剂用量为8～15体积份，每次提取1-2小时，减压回收溶剂，得提取物，加一定体积的水溶解，使得药材量与分散后溶液体积比为1:8-1:2.5；通过相当生药量的6-10体积倍的AB-8大孔吸附树脂，吸附流速2BV/h，树脂柱径高比为1:5～1:12，2-4倍树脂体积的水洗脱，除杂流速为2～6BV/h；以6-15倍树脂体积的30％-70%乙醇洗脱，洗脱流速为4～9BV/h，收集30％-70%乙醇洗脱液，回收溶剂，减压干燥，将30％-70%乙醇洗脱物与酯类提取物混合即为肉豆蔻五味有效部位。
30％-70%乙醇洗脱物与酯类提取物的混合可以是洗脱物直接混合，也可以将酯类提取物用β-环糊精包合或用磷酸氢钙吸收后再与30％-70%乙醇洗脱物混合。
β-环糊精与酯类提取物量为4:1～6：1，包合温度为65～75℃，包合时间为1.5-3小时。
本发明所述的重量份与体积份的关系为g/mL的关系。
本发明所述的肉豆蔻五味有效部位中总内酯类、总酚类、总萜类等的活性成分百分含量的总和为5～99％(w/w)，其中优选为50～99％（w/w）。其中，总内酯类成分以异土木香内酯计为50%～80%；总萜类成分以10α-hydroxyl-artemisinic acid计为5%～12%；Santamarine，木香烃内酯，去氢木香内酯，异土木香内酯，土木香内酯，11,13-二氢异土木香内酯的百分含量分别为0.004%-0.010%，0.010-0.025%，0.25%-0.45%，0.15%-0.40%，0.25%-0.40%，0.006%-0.20%。
本发明所述的肉豆蔻五味提取物中内酯类活性成分最主要的是Santamarine，木香烃内酯，去氢木香内酯，异土木香内酯，土木香内酯，11,13-二氢异土木香内酯等成分。本发明所述的肉豆蔻五味提取物中酚类活性成分最主要的是没食子酸、原儿茶酸、水杨酸、鞣花酸、3,3＇-二甲氧基鞣花酸、香草酸等成分。
本发明所述的肉豆蔻五味提取物中主要的内酯类化合物结构见表1：
表1主要的内酯类化合物结构
本发明所述的肉豆蔻五味有效部位可以单独、组合或与其它中西药物、食物配伍，制成胶囊剂、片剂、丸剂、颗粒剂、口服液、糖浆、冲剂、酒剂、注射剂、膏剂、散剂、饮料等药物或功能性食品。
本发明所述的肉豆蔻五味有效部位的质量检测方法包括如下含量测定方法中的任意一种或几种：
1、肉豆蔻五味有效部位中总内酯的含量测定
精密吸取浓度为1.704mg/ml的异土木香内酯对照品溶液1、1.5、2、2.5、3、和4ml置10ml具塞刻度试管中；向试管中加入0.75ml碱性羟胺溶液（10%的盐酸羟胺甲醇溶液与10%的氢氧化钠甲醇溶液1：1混匀，临用现配）振摇试管使两者混匀；置70摄氏度水浴上加热30分钟，取出冷却至室温后加入30%的盐酸0.2ml混匀后加入2%的氯化铁0.2ml，于490nm处测定吸光度；以异土木香内酯对照品取样量（mg）为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线；
精密称取肉豆蔻五味有效部位样品各3份，每份0.5g，置25ml容量瓶中，用95%乙醇定容至刻度，使成20mg/ml的供试品溶液；精密吸取1.0ml，用95%乙醇定容至5ml；作为样品溶液；
分别精密吸取上述样品溶液1.0mL置10ml具塞刻度试管中，向试管中加入0.75ml碱性羟胺溶液（10%的盐酸羟胺甲醇溶液与10%的氢氧化钠甲醇溶液1：1混匀，临用现配）振摇试管使两者混匀；置70摄氏度水浴上加热30分钟，取出冷却至室温后加入30%的盐酸0.2ml，混匀后加入2%的氯化铁0.2ml，于490nm处测定吸光度；外标两点法计算含量,即得本发明肉豆蔻五味有效部位中总酯类成分以异土木香内酯计为50%～80%。
2.肉豆蔻五味有效部位中总萜的含量测定
精密称10α-hydroxyl-artemisinic acid3.33mg至10ml容量瓶中，用少量甲醇溶解后，定容至刻度；分别精密吸取如上标准品溶液0.1、0.2、0.25、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、1.0毫升至10毫升具塞试管中；分别向具塞试管中加入1mg/ml的香草醛-浓硫酸至5ml,室温下反应10min后在436nm处测定吸光度；以10α-hydroxyl-artemisinicacid对照品取样量（mg）为横坐标,吸光度为纵坐标,绘制标准曲线；
精密称取肉豆蔻五味有效部位样品各3份，每份10mg，置10ml容量瓶中，从中吸取2ml至10ml容量瓶中，用50%乙醇定容至刻度，摇匀，作为样品溶液；吸取1ml毫升至10毫升具塞试管中；分别向具塞试管中加入1mg/ml的香草醛-浓硫酸至5ml,室温下反应10min后在436nm处测定吸光度；外标两点法计算含量,即得本发明肉豆蔻五味有效部位中总萜以10α-hydroxyl-artemisinic acid计为5%～12%。
3．肉豆蔻五味有效部位中Santamarine，木香烃内酯，去氢木香内酯，异土木香内酯，土木香内酯，11,13-二氢异土木香内酯的含量测定
色谱条件：色谱柱:Elite C18色谱柱，4.6mm×250mm,5μm；流动相:乙腈(A)–水（B），梯度洗脱条件：0～60min,35%A→57%A；60～70min,57%A→90%A；70～80min,90%A→90%A，流速0.8ml·min-1；检测波长为204nm；柱温30℃；进样量20ul；
标准曲线绘制：精密称取经减压干燥至恒重的Santamarine对照品0.27mg定容于5ml容量瓶中，吸取1ml上述制备的Santamarine，同时称取木香烃内酯对照品0.60mg，去氢木香内酯对照品1.71mg，异土木香内酯对照品2.50mg，土木香内酯对照品1.40mg，11,13-二氢异土木香内酯对照品1.81mg，同时定容于2ml容量瓶中，摇匀，即得混合对照品储备液；分别取如上混合对照品溶液分别进样2.0ul，4.0ul，8.0ul，10.0ul，15.0ul，20.0ul在上述色谱条件下进行HPLC分析，以峰面积Y为纵坐标，溶液的质量X（ug）为横坐标绘制标准曲线，得到Santamarine、木香烃内酯、去氢木香内酯、异木香内酯、土木香内酯、11,13-二氢异土木香内酯的回归方程；
含量测定：取肉豆蔻五味的原料药材4g,精密称定,置250mL圆底烧瓶中,精密加入50mL的70%的乙醇，回流提取2次，每次1.5小时,每次趁热用棉花粗滤，合并两次的提取液，回收溶剂至无醇味，加一定体积的水溶解，使得药材量与分散后溶液体积比为1:5；通过30mL的AB-8大孔吸附树脂，吸附流速2BV/h，树脂柱径高比为1:10，2倍树脂体积的水洗脱，除杂流速为2BV/h；以8倍树脂体积的70%乙醇洗脱，洗脱流速为4BV/h，收集70%乙醇洗脱液，回收溶剂，减压干燥，再以8倍树脂体积的90%乙醇洗脱，洗脱流速为4BV/h，收集90%乙醇洗脱液，回收溶剂，减压干燥，将70%乙醇洗脱物与90%乙醇洗脱物混合即为肉豆蔻五味有效部位；
精密称取3批肉豆蔻五味有效部位样品各3份，每份约25mg，于25ml容量瓶中，70%乙醇定容，摇匀后用0.45μm微孔滤膜滤过,取续滤液,即得供试品溶液；
取3批样品，按上述方法制备供试品溶液，取供试品溶液20μL注入液相色谱仪中，记录峰面积，计算Santamarine、木香烃内酯、去氢木香内酯、异土木香内酯、土木香内酯、11,13-二氢异土木香内酯的含量；即得本发明肉豆蔻五味有效部位中含Santamarine，木香烃内酯，去氢木香内酯，异土木香内酯，土木香内酯，11,13-二氢异土木香内酯分别为0.004%-0.010%、0.010-0.025%，0.25%-0.45%，0.15%-0.40%，0.25%-0.40%，0.006%-0.20%。
本发明质量检测方法中所用的对照品：异土木香内酯、10α-hydroxyl-artemisinicacid、Santamarine、土木香内酯，11,13-二氢异土木香内酯等，均是本发明自制，从肉豆蔻五味复方药材中采用硅胶柱层析法、Sephadex LH-20柱层析法、反相硅胶柱层析法进行分离制得，用核磁共振氢谱、核磁共振碳谱法鉴定其化合物结构，经熔点测定，HPLC含量测定，纯度均达99%以上。
本发明对肉豆蔻五味的原料药提取物进行纯化得到肉豆蔻五味有效部位，使其有效成分的含量大大提高，克服了汤剂、胶囊剂服用剂量大的缺陷；同时，以前的肉豆蔻五味缺乏具体的质量标准控制指标，未形成系统的质量标准体系，本发明通过纯化得到肉豆蔻五味有效部位，进行了肉豆蔻五味有效部位中总内酯、Santamarine，木香烃内酯，去氢木香内酯，异土木香内酯，土木香内酯，11,13-二氢异土木香内酯的含量测定，有利于提高产品质量的可控性，对蒙药肉豆蔻五味的开发具有现实意义。
下面实验例和实施例进一步说明但不限于本发明。
实验例1：肉豆蔻五味有效部位富集所用树脂工艺的筛选
经查阅文献资料和实际结合，采用4因素3水平正交实验，考察因素：洗脱流速、径高比、上样浓度、生药和树脂的体积比。以总萜类提取量为考察指标。具体见下表。
表4因素水平表
样品的制备：
称取复方肉豆蔻五味药材共18份，按L9（3）4正交实验表，分别制备各样品（重复一份,共18次），过滤，回收溶剂，真空干燥。
将上述18份样品分别置于25mL量瓶，以70%乙醇溶解，超声，分别吸取一定量的待测液，平行操作两份，以10α-hydroxyl-artemisinic acid为对照品，按照本发明中肉豆蔻五味有效部位中总萜的含量测定，测定总萜的量。
正交试验结果分析
因素A、B、C、D均有显著性差异，即流速、径高比、上样浓度、生药和树脂的体积比均有显著性差异。用SAS软件比较因素A、B、C、D中各水平之间的差异，进行水平相关性分析，因素A中水平1、2明显优于3,而1、2水平没有明显差异；；因素B中2、3水平明显优于1水平，而2、3水平没有明显差异；因素C中2水平明显优于1、3水平；因素D中1、2水平明显优于3水平，而1、2水平没有明显差异。
综上所述：蒙药肉豆蔻五味有效部位的最佳纯化工艺为：A2B2C2D2。
实验例2：肉豆蔻五味提取物中总内酯的含量测定
1.仪器与测定条件：
TU-1901型紫外可见分光光度计(北京),
SARTORIUS-BS224S型电子分析天平（北京塞多利斯仪器系统公司），
KQ-250DE型数控超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）。
测定波长：490nm
2.对照品与试剂：
对照品：异土木香内酯（自制,经与UV,1H-NMR,13C-NMR,MS数据对照一致,HPLC检验纯度均在99%以上）
试剂:水为娃哈哈纯净水，其他试剂均为分析纯
3.对照品溶液的制备：
精密称取异土木香内酯对照品适量，加甲醇制备成1.704mg/ml的对照品溶液。
4.样品溶液的制备
精密称取实施例3制备的肉豆蔻五味有效部位样品各3份，每份约0.5g至25ml容量瓶中95%乙醇定容至刻度，使成20mg/ml的供试品溶液精密吸取1.0ml，将1.0ml样品溶液用95%乙醇定容至5ml。作为样品溶液。
5.肉豆蔻五味有效部位中总内酯的含量测定
分别精密吸取上述样品溶液1.0mL置10ml具塞刻度试管中，向试管中加入0.75ml碱性羟胺溶液（10%的盐酸羟胺甲醇溶液与10%的氢氧化钠甲醇溶液1：1混匀临用现配）振摇试管使两者混匀。置70摄氏度水浴上加热30分钟，取出冷却至室温后加入30%的盐酸0.2ml混匀后加入2%的氯化铁0.2ml，于490nm处测定吸光度；外标两点法计算含量，即得。
表5肉豆蔻五味有效部位总内酯含量
实验例3：肉豆蔻五味提取物中总萜的含量测定
1.仪器与测定条件：
TU-1901型紫外可见分光光度计(北京),
SARTORIUS-BS224S型电子分析天平（北京塞多利斯仪器系统公司），
KQ-250DE型数控超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）。
测定波长：436nm
2.对照品与试剂：
10α-hydroxyl-artemisinic acid,自制,经与UV,1H-NMR,13C-NMR,数据对照一致,HPLC检验纯度均在99%以上。
试剂:水为娃哈哈纯净水，其他试剂均为分析纯
3.对照品溶液的制备：
精密称取10α-hydroxyl-artemisinic acid对照品适量,加无水甲醇制备成0.33mg/mL的对照品溶液。
4.样品溶液的制备
精密称取实施3制备的肉豆蔻五味有效部位样品各3份，每份10mg，置10ml容量瓶中，从中吸取2ml至10ml容量瓶中，用50%乙醇定容至刻度，摇匀，作为样品溶液。
5.肉豆蔻五味有效部位中总萜的含量测定
吸取1ml毫升至十毫升具塞试管中。分别向具塞试管中加入1mg/ml的香草醛-浓硫酸至5ml,室温下反应10min后在436nm处测定吸光度。外标两点法计算含量,即得。
表6肉豆蔻五味有效部位总萜含量
实验例4：肉豆蔻五味有效部位中Santamarine，木香烃内酯，去氢木香内酯，异土木香内酯，土木香内酯，11,13-二氢异土木香内酯的含量测定
1.仪器与测定条件：
美国Agilent1100高效液相色谱仪,安捷伦化学工作站；AB135-S型超声清洗仪，AB135-S电子天平(Mettler Toledo公司)。
色谱条件：色谱柱:Elite C18(4.6mm×250mm,5μm)色谱柱;流动相:乙腈(A)–水（B），梯度洗脱（0～60min,35%A→57%A；60～70min,57%A→90%A；70～80min,90%A→90%A），流速0.8ml·min-1;检测波长为204nm;柱温30℃;进样量20ul。
2.对照品与试剂：
木香烃内酯对照品（中国药品生物制品检定所，批号:111524-201006）；异土木香内酯对照品（中国药品生物制品检定所，批号:110761-200204）；去氢木香内酯对照品（中国药品生物制品检定所，批号:111525-200907）；Santamarine对照品（实验室自制）；土木香内酯对照品（实验室自制）；11,13-二氢异土木香内酯（实验室自制）,蒙药复方肉豆蔻-5中各味药材均由安国市康达中药材有限公司提供，乙腈为Fisher色谱纯试剂，水为娃哈哈，其它试剂均为分析纯。
3.对照品溶液的制备：
精密称取Santamarine对照品0.27mg定容于5ml容量瓶中，吸取1ml上述制备的Santamarine，同时称取木香烃内酯对照品0.60mg，去氢木香内酯对照品1.71mg，异土木香内酯对照品2.50mg，土木香内酯对照品品1.40mg，11,13-二氢异土木香内酯对照品1.81mg，同时定容于2ml容量瓶中，摇匀，即得混合对照品储备液。
4.样品溶液的制备
精密称取肉豆蔻-5药材约10g，用10倍量95%乙醇提取2次，每次2小时，合并滤液，减压回流浓缩并定容至50ml容量瓶中，吸取5ml提取液，上硅胶柱进行纯化，用380ml(石油醚：乙酸乙酯=4：1)进行洗脱，洗脱液减压回流浓缩至10ml容量瓶中，摇匀后用0.45μm微孔滤膜滤过,取续滤液,即得。
5.肉豆蔻五味有效部位中Santamarine，木香烃内酯，去氢木香内酯，异土木香内酯，土木香内酯，11,13-二氢异土木香内酯的含量测定
精密吸取上述供试品溶液20μL，注入液相色谱仪，测定各色谱峰峰面积，计算含量。
下述实施例均能实现上述实验例的效果。
实施例1：肉豆蔻五味有效部位的制备-大孔吸附树脂法
取肉豆蔻五味复方药材饮片1kg，50％乙醇10L回流提取2次，每次提取2小时，减压回收溶剂，得提取物，加一定体积的水分散溶解，使得药材量与分散后溶液体积比为1：3.5。通过7.5LAB-8大孔吸附树脂，吸附流速2Bv/h，树脂柱径高比为1:10，水洗脱2.5倍树脂体积进行除杂，除杂流速为4Bv/h，50％乙醇洗脱8倍树脂体积，洗脱流速为4Bv/h，收集50％乙醇洗脱液，回收溶剂，减压干燥，8倍树脂体积的95%乙醇洗脱，洗脱流速为4BV/h，收集95%乙醇洗脱液，回收溶剂，减压干燥，将95%乙醇洗脱物用磷酸氢钙吸收后与50%乙醇洗脱物混合即为肉豆蔻五味有效部位。
实施例2：肉豆蔻五味有效部位的制备-大孔吸附树脂法与超临界C02流体萃取法组合
取肉豆蔻五味复方药材饮片1kg，超临界流体萃取2次，每次提取2小时，得到酯类提取物，取出药渣，药渣中加入50%乙醇回流提取2-3次，溶剂用量为10L，每次提取2小时，减压回收溶剂，得提取物，加一定体积的水溶解，使得药材量与分散后溶液体积比为1:4。通过相当生药量的8体积倍的AB-8大孔吸附树脂，吸附流速2BV/h，树脂柱径高比为1:8，3倍树脂体积的水洗脱，除杂流速为4BV/h；以10倍树脂体积的50%乙醇洗脱，洗脱流速为5BV/h，收集50%乙醇洗脱液，回收溶剂，减压干燥，将50%乙醇洗脱物与超临界流体萃取所得酯类提取物混合即为肉豆蔻五味有效部位。
实施例3：肉豆蔻五味有效部位的制备-大孔吸附树脂法
取肉豆蔻五味复方药材饮片1kg，95%乙醇10L回流提取2次，每次提取2小时，减压回收溶剂，得酯类提取物，药渣中加入50%乙醇回流提取2次，溶剂用量为10L，每次提取2小时，减压回收溶剂，得提取物，加一定体积的水溶解，使得药材量与分散后溶液体积比为1:4。通过相当生药量的7.5体积倍的AB-8大孔吸附树脂，吸附流速2BV/h，树脂柱径高比为1:8，2倍树脂体积的水洗脱，除杂流速为4BV/h；以8倍树脂体积的50乙醇洗脱，洗脱流速为4BV/h，收集50%乙醇洗脱液，回收溶剂，减压干燥，将酯类提取物用β-环糊精包合，β-环糊精与酯类提取物量为5：1，包合温度为70℃，包合时间为2小时，包合后与50%乙醇洗脱物混合即为肉豆蔻五味有效部位。
实施例4：肉豆蔻五味有效部位的制备-溶剂萃取法
取肉豆蔻五味复方药材饮片1kg，50%乙醇回流提取2次，溶剂用量为10L，每次提取2小时，减压回收溶剂，得提取物，先将混悬于水中，使药材与分散后溶液体积比为1：8，然后用低极性的溶剂石油醚萃取4次，溶剂用量为2倍提取物的水溶液，得到脂溶性成分；再用中等极性的溶剂氯仿，经2次萃取其中的成分，溶剂用量为2倍提取物的水溶液，与之前萃取得到的脂溶性成分混合得到肉豆蔻五味有效部位。
实施例5：肉豆蔻五味有效部位的制备-超临界C02流体萃取法
取肉豆蔻五味复方药材饮片1kg，超临界流体萃取2次，每次提取2小时，将所得的提取物混悬于水中，然后用低极性的氯仿萃取其中的成分，得肉豆蔻五味有效部位.
实施例6：肉豆蔻五味有效部位的制备-液-液逆流萃取法
取肉豆蔻五味复方药材饮片1kg，75%乙醇回流提取3次，溶剂用量为10L，每次提取2小时，减压回收溶剂，得提取物；先将提取物混悬于水中，然后用乙醚萃取得到脂溶性成分，然后用乙酸乙醋萃取获得其中的萜类、酚类等成分，将脂溶性成分用β-环糊精包合后再与萜类、酚类等等成分混合得肉豆蔻五味提取物,β-环糊精与脂溶性成分量为5：1，包合温度为70℃，包合时间为2小时。
实施例7：肉豆蔻五味有效部位中总内酯、总萜的含量测定
肉豆蔻五味有效部位中总内酯的含量测定
精密吸取异土木香内酯对照品溶液1、1.5、2、2.5、3、和4ml置10ml具塞刻度试管中。向试管中加入0.75ml碱性羟胺溶液（10%的盐酸羟胺甲醇溶液与10%的氢氧化钠甲醇溶液1：1混匀临用现配并过滤除去混合后的不溶物）振摇试管使两者混匀。置70摄氏度水浴上加热30分钟，取出冷却至室温后加入30%的盐酸0.25mL混匀后加入2%的氯化铁0.2ml，于490nm处测定吸光度值。以异土木香内酯对照品取样量（mg）为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。
精密称取实施例2中肉豆蔻五味有效部位样品各3份，约0.5g至25ml容量瓶中95%乙醇定容至刻度，使成20mg/ml的供试品溶液精密吸取1.0ml，用95%乙醇定容至5ml。作为样品溶液。
分别精密吸取上述样品溶液1.0mL置10ml具塞刻度试管中，向试管中加入0.75ml碱性羟胺溶液（10%的盐酸羟胺甲醇溶液与10%的氢氧化钠甲醇溶液1：1混匀临用现配）振摇试管使两者混匀。置70摄氏度水浴上加热30分钟，取出冷却至室温后加入30%的盐酸0.2ml混匀后加入2%的氯化铁0.2ml，于490nm处测定吸光度；外标两点法计算含量,即得本发明肉豆蔻五味有效部位中总酯类成分以异土木香内酯计为68.23%。
肉豆蔻五味提取物中总萜的含量测定
精密称10α-hydroxyl-artemisinic acid3.33mg至10ml容量瓶中，用少量甲醇溶解后，定容至刻度。分别精密吸取如上标准品溶液0.1、0.2、0.25、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、1.0毫升至十毫升具塞试管中。分别向具塞试管中加入1mg/ml的香草醛-浓硫酸至5ml,室温下反应10min后在436nm处测定吸光度。以10α-hydroxyl-artemisinic acid对照品取样量（mg）为横坐标,吸光度为纵坐标,绘制标准曲线。
精密称取实施例2肉豆蔻五味有效部位样品各3份，每份10mg，置10ml容量瓶中，从中吸取2ml至10ml容量瓶中，用50%乙醇定容至刻度，摇匀，作为样品溶液。吸取1ml毫升至十毫升具塞试管中。分别向具塞试管中加入1mg/ml的香草醛-浓硫酸至5ml,室温下反应10min后在436nm处测定吸光度。外标两点法计算含量,即得本发明肉豆蔻五味有效部位中总萜以10α-hydroxyl-artemisinic acid计为7.06%。
实施例8：肉豆蔻五味有效部位中Santamarine，木香烃内酯，去氢木香内酯，异土木香内酯，土木香内酯，11,13-二氢异土木香内酯的含量测定
色谱条件：色谱柱:Elite C18(4.6mm×250mm,5μm)色谱柱;流动相:乙腈(A)–水（B），梯度洗脱（0～60min,35%A→57%A；60～70min,57%A→90%A；70～80min,90%A→90%A），流速0.8ml·min-1;检测波长为204nm;柱温30℃;进样量20ul。
标准曲线绘制：精密称取经减压干燥至恒重的Santamarine对照品0.27mg定容于5ml容量瓶中，吸取1ml上述制备的Santamarine，同时称取木香烃内酯对照品0.60mg，去氢木香内酯对照品1.71mg，异土木香内酯对照品2.50mg，土木香内酯对照品品1.40mg，11,13-二氢异土木香内酯对照品1.81mg，同时定容于2ml容量瓶中，摇匀，即得混合对照品储备液。分别取如上混合对照品溶液分别进样2.0ul，4.0ul，8.0ul，10.0ul，15.0ul，20.0ul在上述色谱条件下进行HPLC分析，以峰面积Y为纵坐标，溶液的质量X（ug）为横坐标绘制标准曲线，得到Santamarine、木香烃内酯、去氢木香内酯、异木香内酯、土木香内酯、11,13-二氢异土木香内酯的回归方程。
含量测定：精密称取3批实施例2肉豆蔻五味有效部位样品各3份，每份约25mg，于25ml容量瓶中，70%乙醇定容，摇匀后用0.45μm微孔滤膜滤过,取续滤液,即得供试品溶液。
取3批样品，按上述方法制备供试品溶液，取供试品溶液20μL注入液相色谱仪中，记录峰面积，计算Santamarine、木香烃内酯、去氢木香内酯、异土木香内酯、土木香内酯、11,13-二氢异土木香内酯的含量。即得本发明肉豆蔻五味有效部位中含Santamarine，木香烃内酯，去氢木香内酯，异土木香内酯，土木香内酯，11,13-二氢异土木香内酯分别为0.0069%、0.019%，0.36%，0.21%，0.31%，0.12%。
实施例9：片剂的制备
取实施例1制备的肉豆蔻五味有效部位，加入常规辅料，按照常规工艺，制成片剂。
实施例10：胶囊剂的制备
取实施例2制备的肉豆蔻五味有效部位，加入常规辅料，按照常规工艺，制成胶囊剂。
实施例11：口服液体制剂的制备
取实施例3制备的肉豆蔻五味有效部位，加入常规辅料，按照常规工艺，制成口服液体制剂。
实施例12：颗粒剂的制备
取实施例4制备的肉豆蔻五味有效部位，加入常规辅料，按照常规工艺，制成颗粒剂。
Claims (12)
1.一种肉豆蔻五味有效部位,其特征在于该有效部位中活性成分百分含量的总和为5～99％；其中，总酯类成分以异土木香内酯计为50%～80%；总萜类成分以
10α-hydroxyl-artemisinic acid计为5%～12%；Santamarine，木香烃内酯，去氢木香内酯，异土木香内酯，土木香内酯，11,13-二氢异土木香内酯的百分含量分别为0.004%-0.010%，0.010-0.025%，0.25%-0.45%，0.15%-0.40%，0.25%-0.40%，0.006%-0.20%。
2.如权利要求1所述的肉豆蔻五味有效部位,其特征在于该有效部位中活性成分百分含量的总和为50～99％。
3.如权利要求1或2所述的肉豆蔻五味有效部位的制备方法，其特征在于采用溶剂萃取法、大孔吸附树脂法、超临界C02流体萃取法或液—液逆流分配色谱法中的任意一种方法，或其任意组合进行制备；所用原料药为肉豆蔻五味复方药材饮片，其组成为：肉豆蔻80-150重量份、木香60-120重量份、土木香60-120重量份、广枣40-75重量份、荜茇7-20重量份。
4.如权利要求3所述的肉豆蔻五味有效部位的制备方法，其特征在于所用原料药组成为：肉豆蔻100重量份、木香80重量份、土木香80重量份、广枣50重量份、荜茇10重量份。
5.权利要求3所述的肉豆蔻五味有效部位的制备方法，其特征在于所述溶剂萃取法具体步骤为：取肉豆蔻五味复方药材饮片0.5-1.5重量份，40%-95%乙醇回流提取2-3次，溶剂用量为5～15体积份，每次提取1-2小时，减压回收溶剂，得提取物，先将混悬于水中，使药材与分散后溶液体积比为1：2.5—1：10，然后用低极性的溶剂萃取3-5次，溶剂用量为1-3倍提取物的水溶液，得到脂溶性成分；再用中等极性的溶剂，经2-5次萃取其中的成分，溶剂用量为1-3倍提取物的水溶液，与之前萃取得到的脂溶性成分混合得到肉豆蔻五味有效部位。
6.权利要求3所述的肉豆蔻五味有效部位的制备方法，其特征在于所述大孔吸附树脂法具体步骤为：
取肉豆蔻五味复方药材饮片0.5-1.5重量份，40%-95%乙醇回流提取2-3次，溶剂用量为8～15体积份，每次提取1-2小时，减压回收溶剂，得提取物，加一定体积的水溶解，使得药材量与分散后溶液体积比为1:8-1:2.5；通过相当生药量的6-10体积倍的AB-8大孔吸附树脂，吸附流速2BV/h，树脂柱径高比为1:5～1:12，2-4倍树脂体积的水洗脱，除杂流速为2～6BV/h；以6-15倍树脂体积的30％-70%乙醇洗脱，洗脱流速为4～9BV/h，收集30％-70%乙醇洗脱液，回收溶剂，减压干燥，再以6-10倍树脂体积的71％-95%乙醇洗脱，洗脱流速为4～9BV/h，收集71％-95%乙醇洗脱液，回收溶剂，减压干燥，将30％-70%乙醇洗脱物与71％-95%乙醇洗脱物混合即为肉豆蔻五味有效部位；
或取肉豆蔻五味复方药材饮片0.5-1.5重量份，70%-95%乙醇回流提取2-3次，溶剂用量为5～15体积份，每次提取1-2小时，减压回收溶剂，得酯类提取物，药渣中加入40%-70%乙醇回流提取2-3次，溶剂用量为8～15体积份，每次提取1-2小时，减压回收溶剂，得提取物，加一定体积的水溶解，使得药材量与分散后溶液体积比为1:8-1:2.5；通过相当生药量的6-10体积倍的AB-8大孔吸附树脂，吸附流速2BV/h，树脂柱径高比为1:5～1:12，2-4倍树脂体积的水洗脱，除杂流速为2～6BV/h；以6-15倍树脂体积的30％-70%乙醇洗脱，洗脱流速为4～9BV/h，收集30％-70%乙醇洗脱液，回收溶剂，减压干燥，将30％-70%乙醇洗脱物与酯类提取物混合即为肉豆蔻五味有效部位。
7.如权利要求6所述的肉豆蔻五味有效部位的制备方法，其特征在于30％-70%乙醇洗脱物与71％-95%乙醇洗脱物或酯类提取物的混合方式是洗脱物直接混合，或将71％-95%乙醇洗脱物或酯类提取物用β-环糊精包合或用磷酸氢钙吸收后再与30％-70%乙醇洗脱物混合；β-环糊精与71％-95%乙醇洗脱物或酯类提取物的用量比例为4:1～6：1，包合温度为65～75℃，包合时间为1.5-3小时。
8.如权利要求3所述的肉豆蔻五味有效部位的制备方法，其特征在于所述超临界C02流体萃取法具体步骤为：取肉豆蔻五味复方药材饮片0.5-1.5重量份，超临界流体萃取2-3次，每次提取1-3小时，将所得的提取物混悬于水中，然后用低极性的氯仿、乙酸乙酯萃取其中的成分，得肉豆蔻五味有效部位。
9.如权利要求3所述的肉豆蔻五味有效部位的制备方法，其特征在于所述液-液逆流萃取法具体步骤为：取肉豆蔻五味复方药材饮片0.5-1.5重量份，50％-95%乙醇回流提取2-4次，溶剂用量为5-15体积份，每次提取1-3小时，减压回收溶剂，得提取物；先将提取物混悬于水中，然后用低极性的酯类、烷烃类或醚类溶剂萃取得到脂溶性成分，然后用中等极性的溶剂萃取获得其中的萜类、酚类等成分，将脂溶性成分与萜类、酚类等成分混合得肉豆蔻五味提取物；脂溶性成分与萜类、酚类等成分混合方式为直接混合，或将脂溶性成分用β-环糊精包合或用磷酸氢钙吸收后再与萜类、酚类等等成分混合；β-环糊精与脂溶性成分的用量比例为4:1～6：1，包合温度为65～75℃，包合时间为1.5-3小时。
10.如权利要求3所述的肉豆蔻五味有效部位的制备方法，其特征在于该方法为：取肉豆蔻五味复方药材饮片0.5-1.5重量份，超临界流体萃取2次，每次提取2小时，得到酯类提取物，取出药渣，药渣中加入40%-70%乙醇回流提取2-3次，溶剂用量为8～15体积份，每次提取1-2小时，减压回收溶剂，得提取物，加一定体积的水溶解，使得药材量与分散后溶液体积比为1:8-1:2.5；通过相当生药量的6-10体积倍的AB-8大孔吸附树脂，吸附流速2BV/h，树脂柱径高比为1:5～1:12，2-4倍树脂体积的水洗脱，除杂流速为2～6BV/h；以6-15倍树脂体积的30％-70%乙醇洗脱，洗脱流速为4～9BV/h，收集30％-70%乙醇洗脱液，回收溶剂，减压干燥，将30％-70%乙醇洗脱物与酯类提取物混合即为肉豆蔻五味有效部位；30％-70%乙醇洗脱物与酯类提取物的混合方式是洗脱物直接混合，或将酯类提取物用β-环糊精包合或用磷酸氢钙吸收后再与30％-70%乙醇洗脱物混合；β-环糊精与酯类提取物量为4:1～6：1，包合温度为65～75℃，包合时间为1.5-3小时。
11.如权利要求1或2所述的肉豆蔻五味有效部位的质量检测方法，其特征在于该方法包括如下含量测定方法中的任意一种或几种：
A.肉豆蔻五味有效部位中总内酯的含量测定
精密吸取浓度为1.704mg/ml的异土木香内酯对照品溶液1、1.5、2、2.5、3、和4ml置10ml具塞刻度试管中；向试管中加入0.75ml碱性羟胺溶液振摇试管使两者混匀；置70摄氏度水浴上加热30分钟，取出冷却至室温后加入30%的盐酸0.2ml混匀后加入2%的氯化铁0.2ml，于490nm处测定吸光度；以异土木香内酯对照品取样量为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线；
精密称取肉豆蔻五味有效部位样品各3份，每份0.5g，置25ml容量瓶中，用95%乙醇定容至刻度，使成20mg/ml的供试品溶液；精密吸取1.0ml，用95%乙醇定容至5ml；作为样品溶液；
分别精密吸取上述样品溶液1.0mL置10ml具塞刻度试管中，向试管中加入0.75ml碱性羟胺溶液振摇试管使两者混匀；置70摄氏度水浴上加热30分钟，取出冷却至室温后加入30%的盐酸0.2ml，混匀后加入2%的氯化铁0.2ml，于490nm处测定吸光度；外标两点法计算含量,即得本发明肉豆蔻五味有效部位中总酯类成分以异土木香内酯计为50%～80%；
B.肉豆蔻五味有效部位中总萜的含量测定
精密称10α-hydroxyl-artemisinic acid3.33mg至10ml容量瓶中，用少量甲醇溶解后，定容至刻度；分别精密吸取如上标准品溶液0.1、0.2、0.25、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、1.0毫升至10毫升具塞试管中；分别向具塞试管中加入1mg/ml的香草醛-浓硫酸至5ml,室温下反应10min后在436nm处测定吸光度；以10α-hydroxyl-artemisinicacid对照品取样量为横坐标,吸光度为纵坐标,绘制标准曲线；
精密称取肉豆蔻五味有效部位样品各3份，每份10mg，置10ml容量瓶中，从中吸取2ml至10ml容量瓶中，用50%乙醇定容至刻度，摇匀，作为样品溶液；吸取1ml毫升至10毫升具塞试管中；分别向具塞试管中加入1mg/ml的香草醛-浓硫酸至5ml,室温下反应10min后在436nm处测定吸光度；外标两点法计算含量,即得本发明肉豆蔻五味有效部位中总萜以10α-hydroxyl-artemisinic acid计为5%～12%；
C．肉豆蔻五味有效部位中Santamarine，木香烃内酯，去氢木香内酯，异土木香内酯，土木香内酯，11,13-二氢异土木香内酯的含量测定
色谱条件：色谱柱:Elite C18色谱柱，4.6mm×250mm,5μm；流动相:乙腈(A)–水（B），梯度洗脱条件：0～60min,35%A→57%A；60～70min,57%A→90%A；70～80min,90%A→90%A，流速0.8ml·min-1；检测波长为204nm；柱温30℃；进样量20ul；
标准曲线绘制：精密称取经减压干燥至恒重的Santamarine对照品0.27mg定容于5ml容量瓶中，吸取1ml上述制备的Santamarine，同时称取木香烃内酯对照品0.60mg，去氢木香内酯对照品1.71mg，异土木香内酯对照品2.50mg，土木香内酯对照品1.40mg，11,13-二氢异土木香内酯对照品1.81mg，同时定容于2ml容量瓶中，摇匀，即得混合对照品储备液；分别取如上混合对照品溶液分别进样2.0ul，4.0ul，8.0ul，10.0ul，15.0ul，20.0ul在上述色谱条件下进行HPLC分析，以峰面积Y为纵坐标，溶液的质量X为横坐标绘制标准曲线，得到Santamarine、木香烃内酯、去氢木香内酯、异木香内酯、土木香内酯、11,13-二氢异土木香内酯的回归方程；
含量测定：取肉豆蔻五味的原料药材4g,精密称定,置250mL圆底烧瓶中,精密加入50mL的70%的乙醇，回流提取2次，每次1.5小时,每次趁热用棉花粗滤，合并两次的提取液，回收溶剂至无醇味，加一定体积的水溶解，使得药材量与分散后溶液体积比为1:5；通过30mL的AB-8大孔吸附树脂，吸附流速2BV/h，树脂柱径高比为1:10，2倍树脂体积的水洗脱，除杂流速为2BV/h；以8倍树脂体积的70%乙醇洗脱，洗脱流速为4BV/h，收集70%乙醇洗脱液，回收溶剂，减压干燥，再以8倍树脂体积的90%乙醇洗脱，洗脱流速为4BV/h，收集90%乙醇洗脱液，回收溶剂，减压干燥，将70%乙醇洗脱物与90%乙醇洗脱物混合即为肉豆蔻五味有效部位；
精密称取3批肉豆蔻五味有效部位样品各3份，每份25mg，于25ml容量瓶中，70%乙醇定容，摇匀后用0.45μm微孔滤膜滤过,取续滤液,即得供试品溶液；
取3批样品，按上述方法制备供试品溶液，取供试品溶液20μL注入液相色谱仪中，记录峰面积，计算Santamarine、木香烃内酯、去氢木香内酯、异土木香内酯、土木香内酯、11,13-二氢异土木香内酯的含量；即得本发明肉豆蔻五味有效部位中含Santamarine，木香烃内酯，去氢木香内酯，异土木香内酯，土木香内酯，11,13-二氢异土木香内酯分别为0.004%-0.010%、0.010-0.025%，0.25%-0.45%，0.15%-0.40%，0.25%-0.40%，0.006%-0.20%。
12.如权利要求1或2所述的肉豆蔻五味有效部位，其特征在于所述肉豆蔻五味有效部位单独或与其它中西药物、食物组合，制成胶囊剂、片剂、丸剂、颗粒剂、口服液、糖浆、冲剂、酒剂、注射剂、膏剂、散剂、饮料形式的药物或功能性食品。
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