CN113009051A - 肠道病毒71型灭活疫苗中β-内酰胺类抗生素的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种肠道病毒71型灭活疫苗中β‑内酰胺类抗生素的检测方法，本发明采用液相色谱‑质谱联用仪，首次建立同时检测肠道病毒71型灭活疫苗中40种β‑内酰胺类抗生素的方法。本方法实现了残留抗生素高通量筛查，具有高速、准确，灵敏度高，操作时间短的特点，同时采用MRM的扫描方式，减少了假阳性的产生。疫苗中40种β‑内酰胺类抗生素同时定性定量分析，也为检测疫苗中其他抗生素残留方法的建立提供了新的思路，为保证疫苗中的质量提供了保障。同时对不同疫苗研制阶段中抗生素残留的检测，可掌握不同阶段下抗生素残留量，及时做出调整，避免因终产品不合格而导致的巨大损失。

Description

肠道病毒71型灭活疫苗中β-内酰胺类抗生素的检测方法

技术领域

本发明涉及疫苗中抗生素残留检测，具体地说，涉及一种肠道病毒71型灭活疫苗中β-内酰胺类抗生素的检测方法。

背景技术

疫苗作为生物制品中一种预防类产品，主要是通过将病原微生物(如细菌、病毒、螺次体等)及其代谢产物，经过人工减毒、灭活或采用基因工程等方法制成。在生产和存储的过程中，为了保证产品的质量，常加入一些抗生素抑制细菌、衣原体、支原体的感染，造成抗生素残留，从而导致一些不良反应。人用药品注册技术要求国际协调会(ICH)将疫苗中抗生素的残留作为工艺杂质进行控制；美国药典、欧洲药典、中国药典等均要求对疫苗中抗生素的使用进行限制。

β-内酰胺类抗生素是比较常见的一类抗生素，主要是通过抑制细菌细胞壁的合成来达到抑菌的效果，抗菌率高，可对G+菌、G-菌起作用。过敏反应是其最常见的不良反应，该反应通常与使用剂量无关，对于比较敏感的人群，极微量都可能导致休克或死亡，同时各种青霉素之间也存在交叉过敏，对于青霉素过敏的患者，可能对于其他β-内酰胺类抗生素也产生过敏反应。因此，不管是中国药典还是美国药典都规定疫苗中不能添加β-内酰胺类抗生素。

控制疫苗中抗生素残留对保障消费者安全尤为重要。在《中国药典》附录中对于抗生素残留检测方法，采用培养法，但是该方法在检测复杂成分的生物制品中容易受干扰。对于多数疫苗项下的抗生素残留检测采用酶联免疫反应的方法。该方法是采用对应的试剂盒，进行抗原抗体结合，每检测一种抗生素就要对应一种试剂盒，一次检测只能对一种或是一类抗生素进行检测，无法实现抗生素高通量检测。姜崴(2010)采用间接竞争ELISA方法检测了疫苗中卡那霉素残留量采用了一种试剂盒。在测定流感疫苗生产用鸡胚中氨苄青霉素和氯霉素的残留时，就采用了相应的两种试剂盒进行测定。

近些年随着仪器分析的发展，检测结果准确、分离速度快、分离效率高，越来越广泛的应用于环境、食品、生物、医药领域。目前，液质联用技术是化合物分析中常用的检测手段，既具备分子结构分析的能力，也可实现一次扫描筛查多种化合物，在抗生素的滥用和残留检测中广泛应用。但目前关于疫苗中多种β-内酰胺类抗生素的检测方法未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种肠道病毒71型灭活疫苗中β-内酰胺类抗生素的检测方法。

为了实现本发明目的，本发明提供一种肠道病毒71型灭活疫苗中β-内酰胺类抗生素的检测方法，包括：

A、配制不同浓度的β-内酰胺类抗生素混合标准溶液；其中，β-内酰胺类抗生素选自法罗培南、头孢羟氨苄、苯唑西林、头孢克肟、头孢吡肟、拉氧头孢、头孢地嗪、青霉素、阿莫西林、头孢噻吩、氟氯西林、头孢甲肟、头孢替安、头孢匹胺、头孢氨苄、头孢克洛、头孢唑啉、头孢他美酯、头孢呋辛酯、头孢哌酮、头孢拉定、头孢唑肟、氯唑西林、头孢噻肟、美洛西林、头孢西丁、氨苄西林、美罗培南、头孢替唑、阿洛西林、哌拉西林、头孢他定、头孢泊肟酯、青霉素V、替卡西林、头孢呋辛、头孢美唑、头孢硫脒、比阿培南和头孢丙烯中的两种或两种以上；

B、向肠道病毒71型灭活疫苗空白基质中分别加入上述不同浓度的β-内酰胺类抗生素混合标准溶液，混匀，制成系列浓度的加标样品溶液，然后进行液相色谱串联质谱检测；

其中，所述肠道病毒71型灭活疫苗空白基质是指不含β-内酰胺类抗生素的肠道病毒71型灭活疫苗；

C、对于每种β-内酰胺类抗生素，根据加标样品溶液中该β-内酰胺类抗生素的浓度及其对应的峰面积绘制标准曲线；

D、将待测肠道病毒71型灭活疫苗0.5mL加至离心管中，加入乙腈0.5mL，涡旋15s，充分摇匀，10000rpm室温离心10min，取上清液，按相同条件进行液相色谱串联质谱检测；根据检测结果，对照标准曲线，获得待测肠道病毒71型灭活疫苗中各β-内酰胺类抗生素的浓度。

前述的方法，步骤A包括：

A1、储备液的配制：精密称取每一种β-内酰胺类抗生素对照品10mg，用试剂溶解，制成浓度为1mg/mL的溶液作为储备液；其中，头孢菌素类抗生素用甲醇水溶液溶解，青霉素类抗生素用水溶解；

A2、基本工作溶液的配制：精密量取每一种抗生素储备液10μL混合，用甲醇水溶液稀释至浓度为10μg/mL作为基本工作溶液；

A3、不同浓度的β-内酰胺类抗生素混合标准溶液标准系列溶液的配制：用甲醇水溶液稀释基本工作溶液，分别制成浓度为10000、5000、2500、1000、500、200、100、50、10、5和1ng/mL的β-内酰胺类抗生素混合标准溶液。

其中，所述甲醇水溶液中甲醇与水的体积比为1:1。

前述的方法，步骤B中所述加标样品溶液中β-内酰胺类抗生素混合物的浓度分别为0.04、0.2，0.4、2、4、8、20、40、100、200和400ng/mL。

优选地，液相色谱条件如下：

采用SHISEIDO CAPCELL PAK C18 MG色谱柱，150mm×2.0mm,5μm；流动相A：0.1％甲酸溶液，流动B：0.1％甲酸乙腈溶液；进样量10μL；流速0.3mL/min；按如下程序进行梯度洗脱：

优选地，质谱条件如下：

采用AB QTrap 6500三重四级杆-线性离子阱质谱仪，包含ESI离子源。

质谱分析采用正离子扫描方式，扫描模式为scheduled MRM，电喷雾电压(IS)：5500V；离子化温度：500℃；雾化气压力：40psi；辅助气压力：40psi；气帘气压力：25psi；碰撞气(CAD)：6V；进口电压：10ev，出口电压：11ev。

每种β-内酰胺类抗生素的MRM参数和保留时间如表1所示。

表1每种化合物的MRM参数和保留时间

前述的方法，肠道病毒71型灭活疫苗中β-内酰胺类抗生素的定量限为0.08-20ng/mL，最低检出限为0.04ng/mL。

本发明还提供上述方法在肠道病毒71型灭活疫苗产品质量控制中的应用。

本发明采用液相色谱-质谱联用仪，建立了检测肠道病毒71型灭活疫苗(vero细胞)基质中40种β-内酰胺类抗生素方法，并进行相关方法学验证。该方法采用SHISEIDOCAPCELL PAK C18 MG(150mm×2.0mm,5μm)色谱柱，0.1％甲酸水-0.1％甲酸乙腈为流动相；三重四级杆-线性离子阱质谱仪电喷雾电离源(ESI)多重反应监测(MRM)的正离子扫描方式。采用乙腈沉淀作为前处理方法。各种抗生素在肠道病毒71型灭活疫苗(vero细胞)中回收率为84.5％～108.2％。各目标抗生素在肠道病毒71型灭活疫苗(vero细胞)中的检出限为0.02-4ng/剂(S/N≥3)，定量限为0.04-10ng/剂(S/N≥10)；各抗生素在疫苗基质中的日内和日间精密度均小于12.5％，准确度在80％～115％。该方法灵敏度高、重现性好、实现了疫苗中多种抗生素同时进行定性定量分析，为保证疫苗的质量提供了保障。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

实施例1

1、化学药品与试剂

对照品法罗培南(批号130532-201301，纯度80.3％)，头孢羟氨苄(批号130431-201203，纯度94.8％)，苯唑西林(批号130482-201402，纯度90.4％)，头孢克肟(批号130503-201706，纯度89.2％)，头孢吡肟(批号130524-201404，纯度83.5％)，拉氧头孢(批号130590-201702，纯度84.3％)，头孢地嗪(批号130520-201803，纯度89.8％)，青霉素(批号130437-201707，纯度94.1％)，阿莫西林(批号130409-201913，纯度86.9％)，头孢噻吩(批号130407-200707，纯度96.1％)，氟氯西林(批号130529-202002，纯度92.6％)，头孢甲肟(批号130525-201001，纯度94.6％)，头孢替安(批号130565-201703，纯度80.7％)，头孢匹胺(批号130505-201301，纯度92.5％)，头孢氨苄(批号130408-201411，纯度94.4％)，头孢克洛(批号130481-201606，纯度95.3％)，头孢唑啉(批号130421-201204，纯度99.0％)，头孢他美酯(批号130512-201202，纯度70.2％)，头孢呋辛酯(批号130492-201703，纯度82.5％)，头孢哌酮(批号130420-201105，纯度93.8％)，头孢拉定(批号130427-201708，纯度88.4％)，头孢唑肟(批号130504-201503，纯度98.2％)，氯唑西林(批号130423-200903，纯度91.0％)，头孢噻肟(批号130483-201505，纯度92.2％)，头孢匹罗(批号130545-201701，纯度83.0％)，美洛西林(批号130519-201904，纯度93.3％)，头孢西丁(批号130572-201603，纯度95.1％)，氨苄西林(批号130410-201908，纯度86.5％)，美罗培南(批号130506-202004，纯度87.0％)，头孢替唑(批号130510-201402，纯度90.9％)，阿洛西林(批号130566-201502，纯度93.8％)，哌拉西林(批号130419-201907，纯度96.2％)，头孢他定(批号130484-201806，纯度85.7％)，头孢泊肟酯(批号130517-201503，纯度73.4％)，青霉素V(批号130490-201705，纯度88.8％)，替卡西林(批号130569-201903，纯度84.9％)，头孢呋辛(批号130493-201706，纯度92.1％)，头孢美唑(批号130580-202002，纯度98.4％)，头孢硫脒(批号130523-201203，纯度99.0％)，比阿培南(批号130578-201602，纯度99.0％)，头孢丙烯(批号130567-201904，纯度85.6％)均来自中国食品药品检定研究院，肠道病毒71型灭活疫苗(vero细胞)(0.5mL/剂)、重组乙型肝炎疫苗(酿酒酵母)(1mL/剂)、水痘减毒活疫苗(0.5mL/剂)分别来自于A、B、C三个厂家；质谱级甲醇、乙腈购自Fisher公司；质谱级甲酸购自Sigma公司，水购自广州屈臣氏有限公司。

2、溶液的配置

储备液：精密称取每一种β-内酰胺类抗生素对照品10mg，分别采用一定的溶解剂溶解，制成浓度为1mg/mL的溶液作为储备液。一般头孢菌素类抗生素采用甲醇：水(v/v＝1:1)溶解，青霉素类抗生素采用水溶解，在-20℃下储存。

基本工作溶液：精密量取每一种抗生素储备液10μL混合，采用甲醇：水(v/v＝1:1)溶液稀释至浓度为10μg/mL作为基本工作溶液。

标准系列溶液：采用甲醇：水(v/v＝1:1)溶液稀释基本工作溶液制成一定浓度的β-内酰胺类抗生素混合标准溶液(10000、5000、2500、1000、500、200、100、50、10、5和1ng/mL)；现用现配。

3、流动相的配置

流动相A采用0.1％甲酸水溶液，量取1000mL水，加入1mL甲酸，摇匀超声即可。流动相B采用0.1％甲酸乙腈溶液，量取1000mL乙腈，加入1mL甲酸，摇匀超声即可。

4、标准样品溶液的制备

在疫苗空白基质中加入一定量(肠道病毒71型灭活疫苗(vero细胞)(0.5mL/剂)10μL；重组乙型肝炎疫苗(酿酒酵母)(1mL/剂)20μL；水痘减毒活疫苗(0.5mL/剂)20μL)不同浓度的混合标准溶液，混匀，制成加标样品溶液(肠道病毒71型灭活疫苗(vero细胞)和重组乙型肝炎疫苗(酿酒酵母)浓度为0.02、0.1、0.2、1、2、4、10、20、50、100和200ng/剂；水痘减毒活疫苗浓度为0.04、0.2、0.4、2、4、8、20、40、100、200和400ng/剂)。

5、样品的前处理

取肠道病毒71型灭活疫苗(vero细胞)(0.5mL/剂)，转移至2mL离心管中，加入乙腈0.5mL，涡旋15s，充分摇匀，10000rpm离心10min使沉淀蛋白，取上清液进入液质联用仪进行分析。

取重组乙型肝炎疫苗(酿酒酵母)(1mL/剂)，转移至2mL离心管中，加入乙腈1ml，涡旋15s，充分摇匀，10000rpm离心10min使沉淀蛋白，取上清液进入液质联用仪进行分析。

取水痘减毒活疫苗(0.5mL/剂)溶解、涡旋15s，转移至2mL离心管中，加入乙腈1.5mL，涡旋15s，10000rpm离心10min使沉淀蛋白，取上清液进入液质联用仪进行分析。

6、液质条件

液相系统采用岛津公司的LC 20AT液相色谱仪(岛津，日本)，包含双元泵，进样器、柱温箱、检测器组成。质谱系统采用AB QTrap 6500三重四级杆-线性离子阱质谱仪，包含ESI离子源(AB sciex)。

采用SHISEIDO CAPCELL PAK C18 MG(150mm×2.0mm,5μm)色谱柱；流动相A：0.1％甲酸溶液，流动B：0.1％甲酸乙腈溶液，进样量10μL，流速0.3mL/min；梯度洗脱条件如下：

质谱分析采用正离子扫描方式scheduled MRM的扫描模式，电喷雾电压(IS)：5500V；离子化温度：500℃；雾化气压力：40psi；辅助气压力：40psi；气帘气压力：25psi；碰撞气(CAD)：6V；进口电压：10ev，出口电压：11ev。采用针泵进样的方式，优化每一种化合物质谱条件(包含每一种化合物的母离子质荷比、去簇电压(DP)、子离子质荷比以及碰撞电压(CE))，优化得到的质谱参数见表1。

上述方法同样适用于重组CHO乙型肝炎疫苗中相关β-内酰胺类抗生素的检测。

对于每种β-内酰胺类抗生素，根据加标样品溶液中该β-内酰胺类抗生素的浓度及其对应的峰面积绘制标准曲线(表2)；然后，按照相同条件对经过前处理的待测样品进行液相色谱串联质谱检测；根据检测结果，对照标准曲线，获得待测疫苗中各β-内酰胺类抗生素的浓度。

表2肠道病毒71型灭活疫苗(vero细胞)中40种β-内酰胺类抗生素线性关系

实施例2提取条件的优化与效率

在进行疫苗前处理时，首先尝试采用超滤离心管浓缩疫苗，回收滤出液的方法，但该方法基质效应过大，没有达到对目标抗生素进行提取的目的。我们采用简便、快速的前处理溶剂沉淀的方法，以水痘减毒活疫苗为基质，探索了乙醇、甲醇、乙腈的沉淀剂效果，当沉淀剂与疫苗的体积比为1:1时，3种沉淀剂，都有较高的基质效应，能看到明显的基质干扰峰，尝试提高沉淀剂的加入量，减小基质效应，最终确定水痘减毒活疫苗(0.5mL/剂)中加入沉淀剂体积为其规格的3倍，在沉淀过程中醇沉的沉淀现象不稳定，有时候出现明显的白色沉淀的现象，而有时没有，因此最终确定采用乙腈为沉淀剂。同时兼顾检出方法的灵敏度，最终确定重组乙型肝炎疫苗(酿酒酵母)和肠道病毒71型灭活疫苗(vero细胞)乙腈加入量为其规格的1倍，水痘疫苗为其规格的3倍。

实施例3液质条件的优化

本实施例中尝试采用以下三种色谱柱：ACE Excel 5 C18(75mm×2.1mm,5μm)，Shiseido CAPCSLL PAK C18 MG(150mm×2.0mm,5μm)，Shiseido CAPCSLL PAK C18 MG(75mm×2.0mm,5μm)，进行色谱条件优化。结果显示：采用ACE Excel 5 C18(75mm×2.1mm,5μm)色谱柱时，阿莫西林峰分裂，拖尾严重；采用Shiseido CAPCSLL PAK C18 MG(150mm×2.0mm,5μm)为色谱柱时各抗生素峰形尖锐，分离度较好；为了缩短各抗生素的保留时间，还采用了Shiseido CAPCSLL PAK C18 MG(75mm×2.0mm,5μm)色谱柱，但该色谱柱下各抗生素峰型较宽；因此最终选择Shiseido CAPCSLL PAK C18 MG(150mm×2.0mm,5μm)色谱柱。

对于流动相的选择，采用流动相A：5mM甲酸铵溶液、0.1％甲酸水溶液；流动相B：乙腈。通过不断进行流动相梯度调整，结果显示，当采用5mM甲酸铵溶液和乙腈为流动相时各抗生素的出峰时间比较集中，分辨率低；而当采用0.1％甲酸溶液和0.1％甲酸乙腈溶液，各色谱峰出峰时间比较分散且峰型好。因此最终将0.1％甲酸溶液和0.1％甲酸乙腈溶液作为本方法的流动相。甲酸是LC/MS常见加入剂，既能提高离子化效率，还可以改善色谱峰的峰型。

对于洗脱梯度的选择，为满足不同极性的抗生素都能有较好的峰型，首先采用较低的有机相的比例进行洗脱，当初始有机相的比例过大时，阿莫西林的峰型分裂，不断降低有机相的比例时，该抗生素峰型好转，最终确定初始比例为1％有机相时，阿莫西林有较好的峰型，同时在该比例下，其他所有抗生素具有较好的出峰。因此，最终确定的梯度洗脱条件为0.1min，1％流动相B；4.5min，60％流动相B；5.5min，95％流动相B；8.0min，95％流动相B；8.1min，1％流动相B；15min，1％流动相B。

每种抗生素质谱条件的优化，采用针泵进样的方式，对每一种抗生素(1μg/ml或100ng/mL)进行质谱条件的优化，首先采用Q1的扫描方式，得到目标抗生素的母离子质荷比信息，然后采用Q1M的扫描方式，优化其去簇电压，再采用MS2的扫描方式，得到化合物的子离子信息，每一种抗生素选择3对信号较强的子离子对，选择信号最强的离子对可用于抗生素的定量分析，3对离子对同时检测可用于抗生素的定性分析，最后采用MRM的扫描方式，优化每一对离子对的碰撞电压。最终确定各抗生素的质谱条件。

实施例4方法验证

1、基质效应是指在色谱分离体系中，与待测样品共流出的组分，对待测样品的离子化过程的影响，产生离子增强或离子抑制的作用。本发明中，每种疫苗选择了3种不同浓度(重组乙型肝炎疫苗(酿酒酵母)和肠道病毒71型灭活疫苗(vero细胞)10、50、100ng/剂；水痘减毒活疫苗20、100、200ng/剂)进行40β-内酰胺类抗生素在疫苗中基质效应考察。

基质效应的计算采用疫苗中β-内酰胺类抗生素峰面积响应与在纯溶剂中峰面积响应的比值。公式为：

基质效应＝(A_{疫苗中β-内酰胺类抗生素}-A_{纯溶剂中β-内酰胺类抗生素})/A_{纯溶剂中β-内酰胺类抗生素}×100％

其中，A_{疫苗中β-内酰胺类抗生素}表示疫苗中β-内酰胺类抗生素峰面积响应，A_{纯溶剂中β-内酰胺类抗生素}表示纯溶剂中β-内酰胺类抗生素峰面积响应。

基质效应范围在-20％～20％可以忽略不计，当基质效应小于-20％时，认为有抑制效应，当基质效应大于20％时，有增强效应。最终三种疫苗测得结果见表3～表5。结果显示，大多数抗生素在疫苗中都有不同程度增强和抑制效应。且同一种疫苗提取液对于不同目标抗生素基质效应是不同的，同时不同疫苗基质对于同一种β-内酰胺类抗生素的基质效应也不尽相同。为了消除基质效应的影响，采用在空白疫苗基质中，加标工作曲线法，计算相关含量。

肠道病毒71型灭活疫苗(vero细胞)和重组乙型肝炎疫苗(酿酒酵母)各目标抗生素的检出限均在：0.02-4ng/剂(S/N≥3)，定量限均在：0.04-10ng/剂(S/N≥10)；水痘减毒活疫苗中各目标抗生素的检出限均在：0.04-16ng/剂(S/N≥3)，定量限均在：0.2-20ng/剂(S/N≥10)。

2、准确度表示用该方法测得样品的结果与样品真值之间的接近程度，准确度＝测得样品的浓度/理论样品加入浓度。精密度是表示多次测量样品之间的接近程度，常用相对标准偏差来表示。为了确定各抗生素在疫苗中的准确度和精密度，在肠道病毒71型灭活疫苗(vero细胞)和重组乙型肝炎疫苗(酿酒酵母)中测试各目标抗生素的浓度为：10、50、100ng/剂；水痘减毒活疫苗中测试各目标抗生素浓度为：20、100、200ng/剂，结果见表3～表5。肠道病毒71型灭活疫苗(vero细胞)中各抗生素准确度为90％～115％，重组乙型肝炎疫苗(酿酒酵母)为80％～110％；水痘减毒活疫苗为85％～115％，且各抗生素在三种疫苗基质中的日内和日间精密度均小于12.5％。结果见表6～表8。

采用加标工作曲线法来考察该方法的线性，三种疫苗基质中各种抗生素线性R≥0.9944，表明该方法线性良好。

3、对于各抗生素回收率，每种疫苗中考察三种不同浓度，肠道病毒71型灭活疫苗(vero细胞)和重组乙型肝炎疫苗(酿酒酵母)：10、50、100ng/剂；水痘减毒活疫苗：20、100、200ng/剂。肠道病毒71型灭活疫苗(vero细胞)中各抗生素的回收率均在84.5％～108.2％(表3)，重组乙型肝炎疫苗(酿酒酵母)的回收率均在73％～108％(表4)；水痘减毒活疫苗中大多数抗生素的回收率在68.2％～107.8％(表5)，但是美罗培南、头孢西丁、拉氧头孢、头孢他定、头孢地嗪、比阿培南、头孢羟氨苄、替卡西林、头孢丙烯抗生素回收率较差，可能是因为水痘疫苗中辅料比较复杂，与抗生素结合，干扰了样品的回收率。

表3肠道病毒71型灭活疫苗(vero细胞)中40种β-内酰胺类抗生素检出限、定量限、回收率、基质效应

表4重组乙型肝炎疫苗(酿酒酵母)中40种β-内酰胺类抗生素检出限、定量限、回收率、基质效应

表5水痘减毒活疫苗中40种β-内酰胺类抗生素检出限、定量限、回收率、基质效应

表6肠道病毒71型灭活疫苗(vero细胞)中40种β-内酰胺类抗生素日内精密度、日间精密度

表7重组乙型肝炎疫苗(酿酒酵母)中40种β-内酰胺抗生素日内精密度、日间精密度

表8水痘减毒活疫苗中40种β-酰胺类抗生素日内精密度、日间精密度

本发明采用HPLC-MS/MS方法，首次建立了可同时检测肠道病毒71型灭活疫苗(vero细胞)、重组乙型肝炎疫苗(酿酒酵母)、水痘减毒活疫苗三种疫苗基质中40种β-内酰胺类抗生素。采用乙腈沉淀作为前处理，并进行相关方法学验证。肠道病毒71型灭活疫苗(vero细胞)中各抗生素的回收率均在84.5％～108.2％，重组乙型肝炎疫苗(酿酒酵母)中各抗生素的回收率在73％～108％；水痘减毒活疫苗中大多数抗生素的回收率在68.2％～107.8％，具有较好的回收率。该方法的建立弥补了已有疫苗检测方法酶联免疫反应每次只能检测一种或一类抗生素的不足，实现了疫苗中多种抗生素检测的高通量、高效、快速检测，为保证疫苗的质量和消费者安全提供了保障。同时可通过对不同疫苗研制阶段中抗生素残留检测，掌握不同阶段下抗生素残留量，及时做出调整，避免因终产品不合格而导致的损失。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

参考文献：

[1]国家药典委员会.中华人民共和国国药典(三部)[S].2020,2020版.北京：中国医药科技出版社，2020：35-41.

[2]朱连德.疫苗生产过程中是否可以使用抗生素,生产出来的疫苗是否存在抗生素残留问题[J].中国猪业,2014(1).

[3]ICH指导委员会.药品注册的国际要求(质量部分)[M].北京：人民人民卫生出版社，2000.

[4]徐传学,顾长龙,方雅,等.生物制品中抗生素的使用及残留检测方法[J].国外医药(抗生素分册),2017(4).

[5]张致平.β—内酰胺类抗生素研究进展[J].中国新药杂志,2002,11(1):233-237.

[6]杨建华,张辉文,李秀清.β—内酰胺类抗生素的过敏反应[J].医学理论与实践,2000(03):191-192.

[7]洪小栩.疫苗中抗生素使用安全问题的讨论[J].中国执业药师,2012,09(009):6-9.

[8]邱少辉,方鑫,何鹏,等.重组乙型肝炎疫苗中庆大霉素残留量检测相关影响因素研究[C]//2013中国药学大会暨第十三届中国药师周.2013.

[9]江志杰,高春,王国兰,等.疫苗中辅料对庆大霉素残留量测定影响的考察[J].药物分析杂志,2013(03):447-449.

[10]姜崴,庄茂欣,褚东琳,等.ELISA检测疫苗中卡那霉素残留量的实用性验证[J].药物分析杂志,2010,030(012):2422-2424.

[11]姜崴,惠琪,刘宏伟,等.ELISA法检测鸡胚中抗生素残留量的研究及其应用[J].微生物学免疫学进展,2010,38(2):40-40.

[12]曾祥林,曾智.超高效/高分离度快速/超快速液相色谱技术在分析领域中的应用[J].医药导报,2010,29(007):909-914.

[13]Rossi R,Saluti G,Moretti S,et al.Multiclass methods for theanalysis of antibiotic residues in milk by liquid chromatography coupled tomass spectrometry:A review[J].Food Additives&Contaminants Part A,2017:1-17.

[14]罗璐,刘盛涛,彭农,等.在疫苗研制中对其抗生素残留量检测分析的意义[C]//第四届全国免疫诊断暨疫苗学术研讨会.2009.

Claims (8)

1.肠道病毒71型灭活疫苗中β-内酰胺类抗生素的检测方法，其特征在于，包括：

A、配制不同浓度的β-内酰胺类抗生素混合标准溶液；其中，β-内酰胺类抗生素选自法罗培南、头孢羟氨苄、苯唑西林、头孢克肟、头孢吡肟、拉氧头孢、头孢地嗪、青霉素、阿莫西林、头孢噻吩、氟氯西林、头孢甲肟、头孢替安、头孢匹胺、头孢氨苄、头孢克洛、头孢唑啉、头孢他美酯、头孢呋辛酯、头孢哌酮、头孢拉定、头孢唑肟、氯唑西林、头孢噻肟、美洛西林、头孢西丁、氨苄西林、美罗培南、头孢替唑、阿洛西林、哌拉西林、头孢他定、头孢泊肟酯、青霉素V、替卡西林、头孢呋辛、头孢美唑、头孢硫脒、比阿培南和头孢丙烯中的两种或两种以上；

B、向肠道病毒71型灭活疫苗空白基质中分别加入上述不同浓度的β-内酰胺类抗生素混合标准溶液，混匀，制成系列浓度的加标样品溶液，然后进行液相色谱串联质谱检测；

其中，所述肠道病毒71型灭活疫苗空白基质是指不含β-内酰胺类抗生素的肠道病毒71型灭活疫苗；

C、对于每种β-内酰胺类抗生素，根据加标样品溶液中该β-内酰胺类抗生素的浓度及其对应的峰面积绘制标准曲线；

D、将待测肠道病毒71型灭活疫苗0.5mL加至离心管中，加入乙腈0.5mL，涡旋15s，充分摇匀，10000rpm室温离心10min，取上清液，按相同条件进行液相色谱串联质谱检测；根据检测结果，对照标准曲线，获得待测肠道病毒71型灭活疫苗中各β-内酰胺类抗生素的浓度。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤A包括：

A1、储备液的配制：精密称取每一种β-内酰胺类抗生素对照品10mg，用试剂溶解，制成浓度为1mg/mL的溶液作为储备液；其中，头孢菌素类抗生素用甲醇水溶液溶解，青霉素类抗生素用水溶解；

A2、基本工作溶液的配制：精密量取每一种抗生素储备液10μL混合，用甲醇水溶液稀释至浓度为10μg/mL作为基本工作溶液；

A3、不同浓度的β-内酰胺类抗生素混合标准溶液标准系列溶液的配制：用甲醇水溶液稀释基本工作溶液，分别制成浓度为10000、5000、2500、1000、500、200、100、50、10、5和1ng/mL的β-内酰胺类抗生素混合标准溶液；

其中，所述甲醇水溶液中甲醇与水的体积比为1:1。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤B中所述加标样品溶液中β-内酰胺类抗生素混合物的浓度分别为0.04、0.2，0.4、2、4、8、20、40、100、200和400ng/mL。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，液相色谱条件如下：

采用SHISEIDO CAPCELL PAK C18 MG色谱柱，150mm×2.0mm,5μm；流动相A：0.1％甲酸溶液，流动B：0.1％甲酸乙腈溶液；流速0.3mL/min；按如下程序进行梯度洗脱：

。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，质谱条件如下：

采用AB QTrap 6500三重四级杆-线性离子阱质谱仪，包含ESI离子源；

质谱分析采用正离子扫描方式，扫描模式为scheduled MRM，电喷雾电压：5500V；离子化温度：500℃；雾化气压力：40psi；辅助气压力：40psi；气帘气压力：25psi；碰撞气：6V；进口电压：10ev，出口电压：11ev。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，每种β-内酰胺类抗生素的MRM参数和保留时间如下：

。

7.根据权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于，β-内酰胺类抗生素的定量限为0.08-20ng/mL，最低检出限为0.04ng/mL。

8.权利要求1-7任一项所述方法在肠道病毒71型灭活疫苗产品质量控制中的应用。