CN110940742A - 血液病相关药物的浓度的检测方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种血液病相关药物的浓度的检测方法和应用,所述方法包括如下步骤:首先将待测血液样本与细胞裂解液或缓冲盐溶液混合,再加入与待检测药物同位素内标的甲醇溶液并振荡,再离心分离并收集上清液;将所述上清液注入快速液相色谱系统进行分离分析,然后进入三重四极质谱检测器中,通过色谱软件采集处理数据,计算待测血液样本中的药物浓度。本发明的血液病相关药物的浓度的检测方法,根据血液病的特点和临床需要,建立了一套检测跟血液病相关药物血药浓度的方案,该方案具有不需更换色谱柱和流动相的优点,极大的提高了检测效率和操作的便捷性,适合在临床大范围推广。
Description
技术领域
本发明属于药物分析检测技术领域,具体涉及一种血液病相关药物的浓度的检测方法和应用。
背景技术
随着精准医疗的提出和大健康计划的实施,精准用药越来越得到行业和患者的重视。血药浓度测定作为精准用药的重要工具,能为临床用药提供依据。而血液病作为影响人类健康的重大疾病,具有发病急,周期长,病死率高等特点,导致血液病的治疗和用药极具复杂性。特别是血液肿瘤和移植患者用药毒性作用大和用药周期长,而有些药物又具有较大的个体间和个体内差异,同时具有较小的治疗窗,严重制约着患者的治疗效果。
发明内容
本发明的一个目的在于提出一种准确度和精敏度高的血液病相关药物的浓度的检测方法。
本发明的一种血液病相关药物的浓度的检测方法,包括如下步骤:S101:首先将待测血液样本与细胞裂解液或缓冲盐溶液混合,再加入与待检测药物同位素内标的甲醇溶液并振荡,再离心分离并收集上清液;其中,所述待检测血液样本与所述细胞裂解液的体积比为1:(0.8~1.2);或所述待检测血液样本与所述缓冲盐溶液的体积比为1:(0.8~1.2);所述待检测血液样本与所述甲醇溶液的体积比为1:(2.8~3.2);S102:将所述上清液注入快速液相色谱系统进行分离分析,然后进入三重四极质谱检测器中,通过色谱软件采集处理数据,计算待测血液样本中的药物浓度。
本发明的血液病相关药物的浓度的检测方法,根据血液病的特点和临床需要,建立了一套检测跟血液病相关药物血药浓度的方案,该方案具有不需更换色谱柱和流动相的优点,极大的提高了检测效率和操作的便捷性,适合在临床大范围推广。
近年来,质谱技术正处在早期增长阶段,同时迎来高速发展,随着国家精准医疗新政策的逐步落地,质谱技术成为精准诊断实现过程中不可或缺的工具,同时也影响了医学和临床实验的诸多领域。目前临床上应用较多的质谱类型有三重四级杆质谱(LC-MS/MS)、飞行时间质谱(LC/TOF)、电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)。LC/TOF主要用于生物标记物的鉴定,ICP-MS主要用来测定人体内微量元素。其中在临床诊断和治疗方面应用较多的是LC-MS/MS,如治疗药物监测、新生儿筛查、维生素检测、药物滥用及内分泌激素检测等,均推动了该技术在临床诊断领域的发展。本发明采用液相-质谱联用技术对血液病相关药物进行血药浓度监测,相较于免疫方法提高了检测结果的精准性、灵敏度、特异性。
另外,本发明上述的血液病相关药物的浓度的检测方法,还可以具有如下附加的技术特征:
进一步地,在所述步骤S101中,振荡的方式为涡旋振荡,振荡时间为50s~70s。
进一步地,在所述步骤S101中,离心分离的时间为8min~12min,离心分离的转速为9500r/min~13000r/min。
进一步地,在所述步骤S102中,通过快速液相色谱系统进行分离分析时,采用Ultimate XB-C18色谱柱。
进一步地,在所述步骤S102中,所述快速液相色谱系统进行分离分析时的流速为0.6mL·min-1~1mL·min-1,柱温为58℃~62℃,进样量0.8μL~1.2μL。
进一步地,在所述步骤S102中,流动相为1.8mmol·L-1~2.2mmol·L-1的乙酸铵、质量浓度为0.08%~0.12%的甲酸水溶液和质量浓度为0.08%~0.12%的甲酸甲醇溶液。
进一步地,在所述步骤S102中,洗脱方式为梯度洗脱。
进一步地,在所述步骤S101中,所述待测血液样本为全血或血浆。
进一步地,在所述步骤S102中,所述三重四极质谱检测器采用电喷雾离子源。
本发明的另一个目的在于提出所述的方法在疾病治疗、药品检测领域的应用。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出,部分将从下面的描述中变得明显,或通过本发明的实践了解到。
附图说明
图1是本发明实施例中环孢素和环孢素-d4的色谱图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例,所述实施例的示例在附图中示出,其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的,旨在用于解释本发明,而不能理解为对本发明的限制。
本发明针对现有技术不足,提供一种能同时测定大部分血液病药物血药浓度的液相体系,不需更换色谱柱和流动相,提高了检测速率,提供一种简单、快捷、灵敏的测定血液病药物血药浓度的方法。
为实现上述目的,本发明采用的技术方案如下:
(1)待测样本的预处理
取100μL全血或血浆待测样本,加入100μL细胞裂解液或缓冲盐溶液,按照1:3(v/v,血液/有机溶剂)比例加入含有内标的甲醇沉淀剂,涡旋振荡1min,13000rpm离心10min,取出上清液。
(2)样品分离与分析
将步骤(1)中处理好的上清液注入快速液相色谱系统,在每种药物合适的液相条件下进行分离分析,然后进入三重四级杆质谱检测器,在合适的质谱条件下检测,最终通过色谱软件采集处理数据,计算样品中的药物浓度。
(a)色谱柱:Ultimate XB-C18色谱柱(4.6*50mm,5μm),柱温60℃。
(b)流动相:B相(0.1%甲酸和2mmoL·L-1乙酸铵的水),A相(0.1%甲酸的甲醇),流速0.8mL·min-1,进样量1μL。每种药物的洗脱梯度分别见表1-16。(c)仪器:SCIEX TripleQuad 4500MD-JasperTM HPLC system。
免疫抑制剂
表1环孢素A,他克莫司梯度洗脱
表2西罗莫司等度洗脱
表3霉酚酸梯度洗脱
抗菌药
表4伏立康唑梯度洗脱
表5泊沙康唑梯度洗脱
表6伊曲康唑梯度洗脱
表7氟胞嘧啶梯度洗脱
表8万古霉素,去甲万古霉素梯度洗脱
抗肿瘤药
表9甲氨蝶呤梯度洗脱
表10白消安梯度洗脱
表11伊马替尼、达沙替尼梯度洗脱
表12尼洛替尼梯度洗脱
表13普纳替尼梯度洗脱
表14芦可替尼梯度洗脱
表15Venetoclax梯度洗脱
表16维生素C梯度洗脱
本发明采用同一流动相和同一色谱柱检测所有血液病相关药物血药浓度,避免了不同项目间更换流动相和色谱柱的弊端,极大的提高了检测效率和操作的便捷性,适合在临床大范围推广。并且该方法预处理简单、快速、灵敏度高、线性范围大,专属性强,内源性物质和常见合并用药均不干扰上述药物测定,适合常规血液病药物血药浓度监测。
实施例(以环孢素血药浓度监测为例)
色谱、质谱条件
SCIEX Triple Quad 4500MD-JasperTM HPLC system(美国AB公司),色谱柱Ultimate XB-C18(4.6mm×50mm,5μm);流速0.8mL·min-1;柱温60℃;流动相:2mMoL·L-1乙酸铵-0.1%甲酸水溶液(B)-0.1%甲酸甲醇溶液(A),进样量1μL。梯度洗脱见表1。
采用电喷雾离子源(ESI);正离子模式;扫描方式为多重反应监测(MRM);离子喷射电压(IS):5500V;离子源温度(TEM):550℃;源内气体1(GS1,N2):55;气体2(GS2,N2):55;气帘气体(CUR,N2):30;碰撞气(N2)压力:8。环孢素m/z 1219.9→1203.0,环孢素-d4 m/z1224.0→1207.0,DP 60V,CE 32V。
样本预处理
精密量取样本全血100μL置于1.5mL Microtube中,然后加入100mmol·L-1细胞裂解液(硫酸锌溶液)100μL,涡旋振荡0.5min,再加入环孢素-d4 300μL,涡旋振荡1min,13000r离心10min,取上清液置于自动进样器。
线性实验
10μL标准曲线工作液加90μL空白全血,配置成环孢素浓度为16、40、80、160、400、800、1600ng·ml-1的标准曲线。按照“样本预处理”项下进行操作,用1/x2加权线性回归计算标准曲线,得到环孢素标准曲线方程Y=0.000805x+0.000384(r=0.9998),表明环孢素在16~1600ng·ml-1范围线性良好。
准确度和精密度
分别在3个1.5mL Microtube中加入环孢素标准工作液570ng·mL-1、1190ng·mL-1、2370ng·mL-1各10μL,并加入空白全血90μL,得到环孢素浓度为57、119、237ng·mL-1的低、中、高质控血样。按照“样本预处理”项下进行操作,各浓度日内重复测定5次,连续测定5天,考察日内和日间精密度和准确度。见表17。
本发明的血液病相关药物的浓度的检测方法,根据血液病的特点和临床需要,建立了一套检测跟血液病相关药物血药浓度的方案,该方案具有不需更换色谱柱和流动相的优点,极大的提高了检测效率和操作的便捷性,适合在临床大范围推广。
在本说明书的描述中,参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中,对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且,描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外,在不相互矛盾的情况下,本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例,可以理解的是,上述实施例是示例性的,不能理解为对本发明的限制,本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (10)
1.一种血液病相关药物的浓度的检测方法,其特征在于,包括如下步骤:
S101:首先将待测血液样本与细胞裂解液或缓冲盐溶液混合,再加入与待检测药物同位素内标的甲醇溶液并振荡,再离心分离并收集上清液;其中,所述待检测血液样本与所述细胞裂解液的体积比为1:(0.8~1.2);或所述待检测血液样本与所述缓冲盐溶液的体积比为1:(0.8~1.2);所述待检测血液样本与所述甲醇溶液的体积比为1:(2.8~3.2);
S102:将所述上清液注入快速液相色谱系统进行分离分析,然后进入三重四极质谱检测器中,通过色谱软件采集处理数据,计算待测血液样本中的药物浓度。
2.根据权利要求1所述的血液病相关药物的浓度的检测方法,其特征在于,在所述步骤S101中,振荡的方式为涡旋振荡,振荡时间为50s~70s。
3.根据权利要求1所述的血液病相关药物的浓度的检测方法,其特征在于,在所述步骤S101中,离心分离的时间为8min~12min,离心分离的转速为9500r/min~13000r/min。
4.根据权利要求1所述的血液病相关药物的浓度的检测方法,其特征在于,在所述步骤S102中,通过快速液相色谱系统进行分离分析时,采用Ultimate XB-C18色谱柱。
5.根据权利要求4所述的血液病相关药物的浓度的检测方法,其特征在于,在所述步骤S102中,所述快速液相色谱系统进行分离分析时的流速为0.6mL·min-1~1mL·min-1,柱温为58℃~62℃,进样量0.8μL~1.2μL。
6.根据权利要求4所述的血液病相关药物的浓度的检测方法,其特征在于,在所述步骤S102中,流动相为1.8mmol·L-1~2.2mmol·L-1的乙酸铵、质量浓度为0.08%~0.12%的甲酸水溶液和质量浓度为0.08%~0.12%的甲酸甲醇溶液。
7.根据权利要求4所述的血液病相关药物的浓度的检测方法,其特征在于,在所述步骤S102中,洗脱方式为梯度洗脱。
8.根据权利要求1所述的血液病相关药物的浓度的检测方法,其特征在于,在所述步骤S101中,所述待测血液样本为全血或血浆。
9.根据权利要求1所述的血液病相关药物的浓度的检测方法,其特征在于,在所述步骤S102中,所述三重四极质谱检测器采用电喷雾离子源。
10.权利要求1-9任一项所述的方法在疾病治疗、药品检测领域的应用。
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