CN113820414B - 分离测定磷酸芦可替尼中间体z1及杂质含量的方法 - Google Patents

分离测定磷酸芦可替尼中间体z1及杂质含量的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及分析化学领域，具体公开了一种分离测定磷酸芦可替尼中间体Z1及杂质含量的方法。本发明提供了磷酸芦可替尼中间体Z1及杂质能较好分离的高效色谱条件，能同时分离中间体Z1和多种杂质。本发明的方法专属性极强，不易受空白溶剂和其他未知杂质干扰。

Description

分离测定磷酸芦可替尼中间体Z1及杂质含量的方法
技术领域
本发明涉及分析化学领域，具体涉及分离测定磷酸芦可替尼中间体Z1及杂质含量的方法。
背景技术
磷酸芦可替尼主要用于中危或高危的原发性骨髓纤维化、真性红细胞增多症继发的骨髓纤维化或原发性血小板增多症继发的骨髓纤维化的成年患者，治疗疾病相关脾肿大或疾病相关症状。
磷酸芦可替尼中间体Z1：
Figure BDA0003267876790000011
是磷酸芦可替尼制备过程中最为关键的中间体，相关制备过程为：
Figure BDA0003267876790000012
因此在制备磷酸芦可替尼中需要对其中间体Z1进行重点监控，并且需要对其相关杂质进行检测定量。高效液相色谱法是检测各项药物杂质的管用方法，但是现未有具体的洗脱条件能有效的分离磷酸芦可替尼中间体Z1和相关杂质，更不用说定量分析它们了。
因此，亟需一种分离测定磷酸芦可替尼中间体Z1及杂质含量的方法，在分离它们的同时能对其定量分析，节约检测成本和时间，提高生产效率。
发明内容
本发明为了解决上述问题，提供了一种利用高效液相色谱法分离测定磷酸芦可替尼中间体Z1及杂质含量的方法，使得中间体Z1与其相关杂质分离度较高，利于其定量分析，具体技术方案如下：
高效液相法分离测定磷酸芦可替尼中间体Z1及杂质含量的方法，其特征在于，流动相A为水，流动相B为甲醇，流动相C为乙腈；所述磷酸芦可替尼中间体Z1为
Figure BDA0003267876790000021
所述杂质包括：
Figure BDA0003267876790000022
进一步地，所述杂质还包括：
Figure BDA0003267876790000023
Figure BDA0003267876790000031
进一步地，洗脱比例为：
0min，流动相A与流动相B的体积比为55：30，
8min，流动相A与流动相B的体积比为55：30，
40min，流动相A与流动相B的体积比为25：60，
45min，流动相A与流动相B的体积比为5：80，
55min，流动相A与流动相B的体积比为5：80，
60min，流动相A与流动相B的体积比为55：30，
75min，流动相A与流动相B的体积比为55：30。
进一步地，洗脱过程中流动相C的体积占比为15％。
进一步地，其特征在于，色谱柱填充剂为十八硅烷键合硅胶。
进一步地，其特征在于，检测波长为220±5nm。
进一步地，其特征在于，流速为1.2±0.05ml/min。
进一步地，其特征在于，柱温为25±0.5℃。
进一步地，其特征在于，供试品溶液浓度为2±0.05mg/ml。
进一步地，其特征在于，稀释剂为甲醇-乙腈。
具体的，所述稀释剂中甲醇与乙醇的体积比为1：1。
本发明的有益之处在于：本发明方法能在分离磷酸芦可替尼中间体Z1中N-乙酰-L-半胱氨酸、杂质SM1、杂质SM2、杂质SM1a、杂质SM1b、杂质SM1d、杂质SM2a、杂质Z1a、杂质Z1b、杂质Z1c、杂质Z1d、杂质Z2、三苯基氧膦、三苯基膦的同时，对其进行含量测定。本发明方法专属性好，各杂质间分离度均大于2.0，不受空白和其他未知杂质干扰。
附图说明
图1为空白溶剂HPLC图；
图2为混合溶液HPLC图；
图3为杂质N-乙酰-L-半胱氨酸定位溶液HPLC图；
图4为杂质SM2a定位溶液HPLC图；
图5为杂质SM1d定位溶液HPLC图；
图6为杂质SM1a定位溶液HPLC图；
图7为杂质Z1c定位溶液HPLC图；
图8为杂质Z1a定位溶液HPLC图；
图9为杂质Z2定位溶液HPLC图；
图10为杂质Z1b定位溶液HPLC图；
图11为杂质SM1b定位溶液HPLC图；
图12为杂质三苯基氧膦定位溶液液HPLC图；
图13为杂质SM2定位溶液HPLC图；
图14为杂质SM1定位溶液HPLC图；
图15为杂质三苯基膦定位溶液HPLC图；
图16为杂质Z1d定位溶液HPLC图；
图17为中间体Z1定位溶液HPLC图；
图18为实施例2中混合溶液1的HPLC图；
图19为实施例2中混合溶液2的HPLC图；
图20为实施例2中混合溶液3的HPLC图；
图21为实施例2中混合溶液4的HPLC图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行进一步详细说明，应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明，本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的结构思路、使用范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
本发明主要分离测定了表1所示的化合物，探寻了高效液相色谱法的相关洗脱条件参数，使得磷酸芦可替尼中间体Z1与相关杂质有较好的分离度，从而能准确测定各物质含量。
表1分离测定物质
Figure BDA0003267876790000051
Figure BDA0003267876790000061
Figure BDA0003267876790000071
实施例1
本实施例公开了一种利用高效液相色谱法分离测定磷酸芦可替尼中间体Z1及杂质含量的方法。
1、高效液相色谱法相关条件参数：具体如表2所示。
表2高效液相色谱法相关条件参数
Figure BDA0003267876790000072
Figure BDA0003267876790000081
2、溶液配制
杂质N-乙酰-L-半胱氨酸储备液：精密称取杂质N-乙酰-L-半胱氨酸25.03mg，置25ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
杂质SM1储备液：精密称取杂质SM1 25.19mg，置25ml量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
杂质SM2储备液：精密称取杂质SM2 25.80mg，置25ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
杂质SM2a储备液：精密称取杂质SM2a 25.26mg，置25ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
杂质SM1a储备液：精密称取杂质SM1a 25.06mg，置25ml量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
杂质SM1b储备液：精密称取杂质SM1b 25.84mg，置25ml量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
杂质SM1d储备液：精密称取杂质SM1d 25.43mg，置25ml量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
杂质Z1a储备液：精密称取杂质Z1a 25.12mg，置25ml量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
杂质Z1b储备液：精密称取杂质Z1b 25.13mg，置25ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
杂质Z1c储备液：精密称取杂质Z1c 25.75mg，置25ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
杂质Z1d储备液1#：精密称取杂质Z1d 20.61mg，置50ml量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
杂质Z2储备液：精密称取杂质Z2 50.13mg，置25ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
杂质三苯基氧膦储备液：精密称取杂质三苯基氧膦50.50mg，置25ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
杂质三苯基膦储备液：精密称取杂质三苯基膦50.12mg，置25ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
杂质定位溶液：取杂质SM1、杂质SM2、杂质SM2a、杂质SM1a、杂质SM1b、杂质SM1d、杂质Z1a、杂质Z1b、杂质Z1c、杂质Z1d、杂质Z2、三苯基氧膦、三苯基膦、N-乙酰-L-半胱氨酸储备液各0.1ml分别置不同的10ml容量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
供试品溶液：精密称取中间体Z120.25mg，置10ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。精密量取0.5ml，置100ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得供试品定位溶液。
混合溶液：精密称取中间体Z1 100.75mg，置50ml量瓶中，再精密量取杂质SM1、杂质SM2、杂质Z1a、杂质Z1b、杂质Z1c储备溶液各0.15ml，N-乙酰-L-半胱氨酸储备溶液0.5ml，杂质SM2a、杂质SM1a、杂质SM1b、杂质SM1d各0.1ml，杂质Z2、三苯基氧膦储备液、三苯基膦储备液各0.5ml，杂质Z1d储备液1#10.0ml，置同一50ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
3、分离结果：结合图1-17可得到表3的各物质的分离结果，由此可以知晓空白稀释剂不干扰样品测定，各杂质峰之间分离度均大于2.0，证明主峰与杂质峰分离良好。
表3相关杂质分离情况统计表
Figure BDA0003267876790000101
实施例2
本实施例记载了前期洗脱条件等参数探寻的实验结果，进一步说明本发明方法的专属性良好，各杂质间分离度较好，不受空白和其他未知杂质干扰。
1、采用甲醇流动相的等度洗脱结果
流动相选取甲醇进行等度洗脱(如表4所示)，其混合溶液1的HPLC图如图18所示，只有10个杂质出峰，且杂质1与杂质2、杂质7与杂质8，分离度不符合要求，多个杂质无法达到有效分离，该色谱条件不适合用于磷酸芦可替尼中间体Z1相关杂质的分离。
表4采用甲醇流动相的等度洗脱
Figure BDA0003267876790000111
2、采用甲醇流动相的梯度洗脱结果
采用甲醇流动相按照表5所示条件进行梯度洗脱时，得到其混合溶液2的HPLC图，如图19所示，只有14个杂质出峰，且杂质1与杂质2，杂质6与杂质7，杂质12与杂质13，中间体Z1与杂质15分离度均不符合要求，多个杂质无法有效分离。
表5采用甲醇流动相的梯度洗脱
Figure BDA0003267876790000121
3、流动相不同洗脱比例的洗脱结果
采用表6所示的色谱条件(乙腈/甲醇洗脱比例不同)进行高效液相洗脱，所得混合溶液3、4的HPLC图分别为图20和图21，杂质分离情况都不符合要求，故都不能将本发明的磷酸芦可替尼中间体Z1和相关杂质进行有效分离。
表6流动相不同洗脱比例的洗脱结果
Figure BDA0003267876790000131
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.高效液相色谱法分离测定磷酸芦可替尼中间体Z1及杂质含量的方法，其特征在于，流动相A为水，流动相B为甲醇，流动相C为乙腈；色谱柱填充剂为十八硅烷键合硅胶，所述色谱柱规格为4.6mm×250mm，5μm；检测波长为220±5nm；柱温为25℃；洗脱过程中，所述流动相C的体积占比为15％；
洗脱比例为：
0min，所述流动相A与所述流动相B的体积比为55：30，
8min，所述流动相A与所述流动相B的体积比为55：30，
40min，所述流动相A与所述流动相B的体积比为25：60，
45min，所述流动相A与所述流动相B的体积比为5：80，
55min，所述流动相A与所述流动相B的体积比为5：80，
60min，所述流动相A与所述流动相B的体积比为55：30，
75min，所述流动相A与所述流动相B的体积比为55：30；
所述磷酸芦可替尼中间体Z1为
Figure FDA0004074677160000011
所述杂质包括：
Figure FDA0004074677160000012
Figure FDA0004074677160000021
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，流速为1.2±0.05ml/min。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，供试品溶液浓度为2±0.05mg/ml。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，稀释剂为甲醇-乙腈。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述稀释剂中甲醇与乙醇的体积比为1：1。
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