CN110320302A

CN110320302A - 快速测定甲氨蝶呤血药浓度的方法

Info

Publication number: CN110320302A
Application number: CN201910664218.XA
Authority: CN
Inventors: 王磊; 刘红星; 孙文利
Original assignee: Beijing Ludaoping Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Beijing Ludaoping Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2019-07-23
Filing date: 2019-07-23
Publication date: 2019-10-11

Abstract

本发明涉及一种快速测定甲氨蝶呤血药浓度的方法，包括如下步骤：首先取待测血浆样本，加入乙酸铵‑甲酸水溶液，然后加入含MTX‑d3的甲醇溶液并涡旋25s～35s，再离心分离，然后收集上清液；将所述上清液注入快速液相色谱系统中进行分离分析，然后注入三重四极质谱检测器中进行检测，再通过色谱软件进行数据采集和处理，得到甲氨蝶呤血药浓度。本发明的快速测定甲氨蝶呤血药浓度的方法，快速准确、灵敏度高、操作简单、成本低，适合临床常规血药浓度监测。样品预处理简单，所需样本量小，适用于临床常规检测和药动学研究。在样本预处理过程中加入内标，提高了MTX定量的准确性，专属性强且灵敏度高。

Description

快速测定甲氨蝶呤血药浓度的方法

技术领域

本发明属于药物分析检测技术领域，具体涉及一种快速测定甲氨蝶呤血药浓度的方法。

背景技术

甲氨蝶呤(Methotrexate，MTX)是一种叶酸还原酶抑制剂，为抗叶酸类抗肿瘤药物，主要通过对二氢叶酸还原酶的抑制达到阻碍肿瘤细胞DNA的合成，从而抑制肿瘤细胞的生长和繁殖。目前广泛用于治疗淋巴性白血病、淋巴瘤、绒毛上皮癌和骨肉瘤等恶性肿瘤。MTX血药浓度与不良反应和疗效之间存在密切关系且个体差异大、治疗窗窄、毒性大。为安全有效地实施MTX给药，监测MTX用药后的血药浓度尤为必要。

目前测定MTX血药浓度的方法有微生物法、荧光偏振免疫分析法、高效液相色谱法。微生物法费时、烦琐；荧光偏振免疫分析法成本昂贵，且专一性差，难以推广，而且由于代谢产物的存在，抗体可能交叉反应使测定结果偏高；高效液相分析法样品处理繁琐、灵敏度不够。

发明内容

本发明的一个目的在于提出一种快速测定甲氨蝶呤血药浓度的方法。

本发明的一种快速测定甲氨蝶呤血药浓度的方法，包括如下步骤：S101：首先取待测血浆样本，加入乙酸铵-甲酸水溶液90μL～110μL，然后加入490μL～510μL含MTX-d3的甲醇溶液并涡旋25s～35s，再在9800r·min^-1～11000r·min^-1的转速下离心分离8min～12min，然后收集上清液；S102：将所述上清液注入快速液相色谱系统中进行分离分析，然后注入三重四极质谱检测器中进行检测，再通过色谱软件进行数据采集和处理，得到甲氨蝶呤血药浓度。

本发明的快速测定甲氨蝶呤血药浓度的方法，快速准确、灵敏度高、操作简单、成本低，适合临床常规血药浓度监测。样品预处理简单，所需样本量小，适用于临床常规检测和药动学研究。在样本预处理过程中加入内标，提高了MTX定量的准确性。专属性强，在本发明方法测定条件下，人体内源性物质以及常用合并用药均不干扰测定。灵敏度高，本发明在0.022μmol·L^-1～2.200μmol·L^-1范围内线性良好，平均回收率为96.87％，日内和日间精密度均小于9％。

另外，本发明上述的快速测定甲氨蝶呤血药浓度的方法，还可以具有如下附加的技术特征：

进一步地，在所述步骤S101中，所述乙酸铵-甲酸水溶液中，所述乙酸铵的含量为1.8mMol·L^-1～2.2mMol·L^-1，所述甲酸的质量浓度为0.08％～0.12％。

进一步地，在所述步骤S102中，所述快速液相色谱系统中色谱柱的型号为Ultimate XB-C18，所述色谱柱的直径为4.6mm，所述色谱柱的长度为50mm。

进一步地，在所述步骤S102中，在所述快速液相色谱系统中，流速为0.8mL·min^-1，柱温为60℃；流动相为2mMoL·L^-1乙酸铵-0.1％甲酸水溶液-0.1％甲酸甲醇溶液，采用梯度洗脱，且进样量为3μL。

进一步地，在所述步骤S102中，所述三重四极质谱检测器的质谱条件为：甲氨蝶呤m/z 454.7→308.0(DP 90V,CE 29V)，MTX-d3m/z 458.1→311.1(DP 90V,CE 25V)。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

图1是本发明的MTX二级扫描碎片离子图；

图2是MTX-d3二级扫描碎片离子图；

图3是空白血浆色谱图；

图4是空白血浆+标准品色谱图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

如图1-4所示，本发明提出一种快速测定甲氨蝶呤血药浓度的方法，包括如下步骤：

(1)首先取待测血浆样本，加入乙酸铵-甲酸水溶液90μL～110μL，然后加入490μL～510μL含MTX-d3的甲醇溶液并涡旋25s～35s，再在9800r·min^-1～11000r·min^-1的转速下离心分离8min～12min，然后收集上清液。

(2)将所述上清液注入快速液相色谱系统中进行分离分析，然后注入三重四极质谱检测器中进行检测，再通过色谱软件进行数据采集和处理，得到甲氨蝶呤血药浓度。

有利地，在所述步骤(1)中，所述乙酸铵-甲酸水溶液中，所述乙酸铵的含量为1.8mMol·L^-1～2.2mMol·L^-1，所述甲酸的质量浓度为0.08％～0.12％。

有利地，在所述步骤(2)中，所述快速液相色谱系统中色谱柱的型号为UltimateXB-C18，所述色谱柱的直径为4.6mm，所述色谱柱的长度为50mm。

有利地，在所述步骤(2)中，在所述快速液相色谱系统中，流速为0.8mL·min^-1，柱温为60℃；流动相为2mMoL·L^-1乙酸铵-0.1％甲酸水溶液-0.1％甲酸甲醇溶液，采用梯度洗脱，且进样量为3μL。

有利地，在所述步骤(2)中，所述三重四极质谱检测器的质谱条件为：甲氨蝶呤m/z454.7→308.0(DP 90V,CE 29V)，MTX-d3m/z 458.1→311.1(DP 90V,CE 25V)。

色谱条件：岛津HPLC 20A型高效液相色谱仪(日本岛津公司，带自动进样器)，色谱柱Ultimate XB-C18(4.6mm×50mm，5μm)；流速0.8mL·min^-1；柱温60℃；流动相：2mMoL·L^-1乙酸铵-0.1％甲酸水溶液(B)-0.1％甲酸甲醇溶液(A)，进样量3μL。

质谱条件：Qtrap 4000离子阱检测器(美国AB公司)，色谱化学工作站(美国AB公司)。采用电喷雾离子源(ESI)；正离子模式；离子喷射电压(IS)：5500V；离子源温度(TEM)：500℃；源内气体l(GSl，N2)压力：50；气体2(GS2，N2)压力：60；气帘气体(CUR,N2)：30；扫描方式为多重反应监测(MRM)；碰撞气(N2)压力：Medium。MTX m/z 454.7→308.0(DP 90V,CE29V)，MTX-d3m/z 458.1→311.1(DP 90V,CE 25V)。

血浆样品预处理：取100μL血浆待测样品，加入2mMol·L^-1乙酸铵-0.1％甲酸水溶液100μL，再加入含内标MTX-d3的甲醇溶液500μL，涡旋30s，10000r·min^-1离心10min。吸取上清液进样。

线性试验：取空白血浆90μL 7份，分别加入浓度为0.220,0.550,1.100,2.200,5.500,11.000,22.000μmol·L^-1的MTX对照品溶液10μL，加入2mMol·L^-1乙酸铵-0.1％甲酸水溶液100μL，加入含内标MTX-d3的甲醇溶液500μL，涡旋30s，10000r·min^-1离心10min。取上清3μL进样。经HPLC-MS/MS分析，以甲氨蝶呤峰面积与内标峰面积之比(Y)作纵坐标，以血浆MTX浓度(X)为横坐标，得到直线方程为Y＝4.56X+0.081(r＝0.9960)。结果表明，MTX血药浓度在0.022～2.200μmol·L^-1范围内线性关系良好。

精密度试验：取高、中、低(1.650、0.605、0.165μmol·L^-1)3种浓度的质量控制(QC)样品各5个，按“血浆样品预处理”方法操作，连续测定6h，连测3d，根据当天的标准曲线，计算QC样品的测定浓度，根据QC样品结果计算本法的精密度。见表2。

表2测定HPLC-MS/MS方法的日内及日间精密度结果(n＝5，)

回收率试验

取高、中、低(1.650、0.605、0.165μmol·L^-1)3种浓度的质量控制(QC)样品各5个，按“血浆样品预处理”项下操作，每一样品连续测定3次。分别加入各浓度的80％，100％，120％MTX，计算沉淀蛋白后的待测物色谱峰面积，考察样品的高、中、低3个浓度的提取回收率分别为93.6％，101.0％，96.0％，平均回收率为96.87％。结果见表3。

表3测定HPLC-MS/MS方法的回收率结果(n＝5，)

综上，本发明的快速测定甲氨蝶呤血药浓度的方法，快速准确、灵敏度高、操作简单、成本低，适合临床常规血药浓度监测。样品预处理简单，所需样本量小，适用于临床常规检测和药动学研究。在样本预处理过程中加入内标，提高了MTX定量的准确性。专属性强，在本发明方法测定条件下，人体内源性物质以及常用合并用药均不干扰测定。灵敏度高，本发明在0.022μmol·L^-1～2.200μmol·L^-1范围内线性良好，平均回收率为96.87％，日内和日间精密度均小于9％。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims

1.一种快速测定甲氨蝶呤血药浓度的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S101：首先取待测血浆样本，加入乙酸铵-甲酸水溶液90μL～110μL，然后加入490μL～510μL含MTX-d3的甲醇溶液并涡旋25s～35s，再在9800r·min^-1～11000r·min^-1的转速下离心分离8min～12min，然后收集上清液；

S102：将所述上清液注入快速液相色谱系统中进行分离分析，然后注入三重四极质谱检测器中进行检测，再通过色谱软件进行数据采集和处理，得到甲氨蝶呤血药浓度。

2.根据权利要求1所述的快速测定甲氨蝶呤血药浓度的方法，其特征在于，在所述步骤S101中，所述乙酸铵-甲酸水溶液中，所述乙酸铵的含量为1.8mMol·L^-1～2.2mMol·L^-1，所述甲酸的质量浓度为0.08％～0.12％。

3.根据权利要求1所述的快速测定甲氨蝶呤血药浓度的方法，其特征在于，在所述步骤S102中，所述快速液相色谱系统中色谱柱的型号为Ultimate XB-C18，所述色谱柱的直径为4.6mm，所述色谱柱的长度为50mm。

4.根据权利要求1所述的快速测定甲氨蝶呤血药浓度的方法，其特征在于，在所述步骤S102中，在所述快速液相色谱系统中，流速为0.8mL·min^-1，柱温为60℃；流动相为2mMoL·L^-1乙酸铵-0.1％甲酸水溶液-0.1％甲酸甲醇溶液，采用梯度洗脱，且进样量为3μL。

5.根据权利要求1所述的快速测定甲氨蝶呤血药浓度的方法，其特征在于，在所述步骤S102中，所述三重四极质谱检测器的质谱条件为：甲氨蝶呤m/z 454.7→308.0(DP 90V,CE29V)，MTX-d3 m/z 458.1→311.1(DP 90V,CE 25V)。