CN111307977A - 载药囊泡的载药量检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种检测载药囊泡的载药量的方法，将载药囊泡加入乙腈和氯仿的混合溶液，混匀，离心得到待测样品；再通过高效液相色谱方法分析待测样品中的药物含量，其中色谱柱为C18柱；流动相为：体积比为8:1～10:1的0.01M磷酸二氢钾溶液‑乙腈混合溶液，pH 6.40～6.80，检测波长为304nm，单针运行时间为10min。该色谱方法在1μg/mL至50μg/mL浓度范围内线性关系良好。本发明的检测方法与传统方法相比，前处理程序简单高效，色谱分析方法快速，准确，灵敏度高，在工业生产中有广阔的应用前景。

Description

载药囊泡的载药量检测方法
技术领域
本发明涉及设计生物技术领域，尤其涉及一种包裹药物的来自凋亡细胞的载药囊泡的样品处理及利用高效液相色谱仪进行载药量检测的方法。
背景技术
细胞外囊泡(Extracellular Vesicles EVs)是指从细胞膜上脱落或者由细胞分泌的双层膜结构的囊泡状小体，直径从40nm到1000nm不等。胞外囊泡主要由微囊泡(Microvesicles MVs)和外泌体(Exosomes Exs)组成，微囊泡是细胞激活、损伤或凋亡后从细胞膜脱落的小囊泡，直径约为100nm–1000nm；外泌体由细胞内的多泡小体(multivesicular bodies)与细胞膜融合后以外分泌的形式释放到细胞外，直径约为40nm-100nm。本发明涉及的囊泡直径范围主要分布在100nm–300nm。囊泡广泛存在于细胞培养上清以及各种体液(血液、淋巴液、唾液、尿液、精液、乳汁)中，携带有细胞来源相关的多种蛋白质、脂类、DNA、mRNA、miRNA等，参与细胞间通讯、细胞迁移、血管新生和免疫调节等过程。在糖尿病、心血管疾病、艾滋病、慢性炎症疾病以及癌症中都发现细胞外囊泡水平的升高，它们很有可能成为这类疾病的诊断标志物，因此，对囊泡进行准确的定性和定量研究显得尤为重要。
中国专利CN102302784A公开了一种肿瘤化疗药物制剂及其制备方法，该制剂是以源自凋亡肿瘤细胞的细胞囊泡为载体，用其包裹肿瘤化疗药制备而成。该制剂直接到达肿瘤部位，提高了化疗药的药效，同时克服了因外源载体给药而对机体产生的毒副作用。所述肿瘤化疗药物制剂的一种制备方法可以通过紫外光照射诱导细胞凋亡并收集细胞囊泡，然后将所述细胞囊泡与作为有效成分的化疗药物进行孵育，使化疗药被细胞囊泡包裹，形成药物制剂。另一种制备方法则直接利用化疗药物诱导细胞凋亡，收集凋亡肿瘤细胞所释放的微颗粒，该微颗粒即为细胞囊泡包裹化疗药物后形成的所述药物制剂。载药囊泡具有毒性低、靶向性强等特点，在制药领域有广阔的应用前景。而载药囊泡的制剂研究中，其载药量是一项重要衡量指标，直接影响载药囊泡制剂的用药量以至疗效。研究高效、准确的检测载药量的方法具有积极的应用价值。目前暂没有针对囊泡载药量检测的统一方法。一般采取类似于细胞裂解的方法进行囊泡前处理，然后利用高效液相色谱法进行药物含量的检测。但该方法的样品前处理方法步骤繁琐，耗时较长，且样品浓度会稀释4倍以上，影响方法的检测限。
发明内容
本发明的目的是提供一种高效快速检测载药囊泡的药物含量的方法。具体地包括两步操作：
1、载药囊泡浓悬液加入乙腈和氯仿混合溶液，涡旋混匀，10000g离心，取上层溶液作为待测样品；
2、将待测样品注入高效液相色谱仪进行分析检测，再通过仪器分析软件进行数据采集及计算处理，得到载药囊泡的载药量。
具体地，第1步操作步骤为：首先取待测载药囊泡浓悬液(浓度约为108至1010个囊泡/毫升)，加入2-5倍体积的乙腈和氯仿混合溶液，置涡旋振荡器上混匀，置高速离心机中10000g离心，取上层溶液作为检测样品，其中待测载药囊泡浓悬液的体积为：100-300μL，乙腈和氯仿的混合溶液为乙腈：氯仿体积比为1:1～1:3。
第2步为将上述检测样品过滤后注入高效液相色谱仪分析检测。色谱柱可选地为C18柱；泵流速为0.8～1.5mL/min，柱温为25～35℃；流动相为：体积比8:1～10:1的0.01M磷酸二氢钾溶液-乙腈混合溶液，pH 6.4～6.80，进样体积为40μL，检测波长为304nm，单针运行时间为10min。同时用外标法进行定量分析，再通过仪器分析软件进行数据采集及计算处理，得到载药囊泡的载药量。
本发明所述的载药囊泡，其所包裹的药物可以是任何被临床使用的对治疗肿瘤有效的药物，包括但不限于各种化疗剂、生物制剂、某些中药制剂等。在本发明的一个优选实施方案中，其中所述的肿瘤治疗药为化疗药。
具体地所述化疗药可以是临床上用于治疗各类肿瘤的化疗药，如：肺癌、白血病、卵巢癌、结肠癌、乳腺癌、膀胱癌、胃癌、肝癌或胶质瘤等的化疗药，可以是单一化疗药或多种化疗药联合。选自治疗肺癌、结肠癌、卵巢癌、白血病、胃癌、肝癌、乳腺癌、膀胱癌和胶质瘤肿瘤的化疗药中的一种或几种。
更具体地，所述化疗药选自甲氨蝶呤、环磷酰胺、5-氟尿嘧啶、吉西他滨、多柔吡星、吡柔比星、紫衫醇、羟基喜树碱、长春新碱、安西他滨、卡铂和顺铂。
在其中的一个实施方式中，本方法应用于检测甲氨蝶呤载药囊泡的载药量。首先取待测载药囊泡浓悬液200μL，加入三倍体积的乙腈：氯仿(1:2，V:V)溶液，置涡旋振荡器上混匀20s，置高速离心机中10000g离心5min，取上层溶液作为检测样品。
将上述上层溶液过滤后注入高效液相色谱仪Thermo UltiMate 3000进行分析检测，色谱柱型号规格为：Thermo AcclaimTM 120，C18(5μm，4.6*250mm)；泵流速为1.0mL/min，柱温为30℃，流动相为：体积比9:1的0.01M磷酸二氢钾溶液-乙腈混合溶液(pH 6.60)，进样体积为40μL，检测波长为304nm，单针运行时间为10min。同时用外标法进行定量分析，再通过仪器分析软件进行数据采集及计算处理，得到甲氨蝶呤囊泡载药量。
进一步地，通过对比本发明的前处理载药囊泡的方法和传统的对囊泡进行裂解的处理方法，本发明的前处理方法简化了操作步骤，高效经济，且对甲氨蝶呤的提取效果令人满意，具有和传统方法相当的技术效果。
进一步地，本发明分别采用高效液相色谱检测甲氨蝶呤样品的色谱方法，以及《中国药典2015》收录的甲氨蝶呤含量检测方法对上述前处理方法的样品溶液进行检测，两种方法的峰面积基本一致，本发明方法的单针时间为10min，药典方法的单针时间为20min，且本发明色谱方法的出峰时间快，峰高响应值高，检测限更低，小于1ppm。
更进一步地，本发明对所述高效液相色谱方法进行方法验证，结果表明其适用性及专属性良好；甲氨蝶呤囊泡载药量在1μg/mL至50μg/mL浓度范围内线性关系良好，R2为0.9999；精密度及中间精密度良好，回收率RSD值4.3％；在不同检测条件下，样品及对照溶液的检测结果比值基本不变，本发明色谱方法的耐用性良好。
本发明提供的检测载药囊泡载药量的技术方案大大简化了样品前处理步骤，缩短处理时间。通过比较本发明的液相色谱方法与现有药典方法，检测结果基本一致，但是本发明的色谱方法操作简便，缩短检测时间，重现性好，灵敏度高。本发明的检测方法高效、经济，适应与工业生产的大规模应用。
附图说明
图1高效液相色谱检测中甲氨蝶呤色谱峰面积对应甲氨蝶呤浓度的线性曲线。
具体实施方式
以下实施例仅具体举例说明本发明的实施方式，不对本发明的范围做任何的限定。其中所采用的细胞、试剂与原料来源如下：
实施例中所使用的细胞的人肺腺癌细胞购自于中国典型培养物保藏中心。实施例中所使用的化疗药物，即甲氨蝶呤(MTX)购自于大连美仑生物技术有限公司。1640培养基购自于Biological Industries；其余试剂均为市售产品。
实施例1.甲氨蝶呤载药囊泡的制备
取无菌、无支原体、生长速度快的的人肺癌细胞用PBS洗两遍，1000rpm，4℃至25℃，离心8min并计数。用1640培养液重悬细胞，置于150×25mm培养皿中，摇匀。打开培养皿盖子，放在紫外灯正下方靠中间处照射50min。加入甲氨蝶呤溶液和适量1640培养液，使甲氨蝶呤终浓度为2mg/ml，置于37℃,5％CO2培养箱培养。
上述与药物孵育的凋亡细胞培养16-20h后收集培养皿内所有液体于50ml离心管内，并用20ml PBS冲洗培养皿，合并所有液体于离心管内，使总体积达到40ml。先将上清液于1500rpm,2℃至8℃条件下离心10min，弃沉淀。然后将上清液在14000g，2℃至8℃的条件下离心2min，弃沉淀。再取上清液在14000g，2℃至8℃条件下离心1h，弃上清。用10ml生理盐水润洗囊泡沉淀一遍，去掉润洗囊泡的生理盐水，另取1ml生理盐水将囊泡沉淀重悬。
实施例2甲氨蝶呤囊泡载药量的检测
首先取待测载药囊泡浓悬液100-300μL，加入三倍体积的乙腈：氯仿(1:2，V:V)溶液，置涡旋振荡器上混匀20s，置高速离心机中10000g离心5min，取上层溶液作为检测样品。
将上述上层溶液过滤后注入高效液相色谱仪Thermo UltiMate 3000进行分析检测，色谱柱型号规格为：Thermo AcclaimTM 120，C18 5μm 4.6*250mm；泵流速为1.0mL/min，柱温为30℃，流动相为：0.01M磷酸二氢钾溶液-乙腈9:1(pH 6.60)，进样体积为40μL，检测波长为304nm，单针运行时间为10min。同时用外标法进行定量分析，再通过仪器分析软件进行数据采集及计算处理，得到甲氨蝶呤囊泡载药量。
实施例3载药囊泡检测前处理方法的对比
为检测本发明囊泡前处理方法的有效性，将均匀的囊泡浓悬液样品分为两份，对比常用的细胞裂解方法与本发明方法的检测结果。具体地，取300μL囊泡浓悬液，加入400μL细胞裂解液(主要成分为SDS、EDTA)，吹打均匀，冰上孵育20min；使用超声波细胞粉碎机粉碎1min，破坏囊泡的膜结构，10000g离心5min；取上清液500μL加入到1mL乙腈中，剧烈震荡，10000g离心5min；取上清液1.4mL加入到6mL氯仿中，剧烈震荡，2000rpm离心10min；上清液即为待检测的样品A；同时，用相同方法处理25μg/mL的甲氨蝶呤标准品对照溶液。
取同一囊泡浓悬液200μL，加入乙腈：氯仿(1:2)溶液600μL，置涡旋振荡器上混匀20s，置高速离心机中10000g离心5min，取上层溶液作为待测样品B，同时，用相同方法处理25μg/mL的对照溶液；
用《中国药典2015》收录的甲氨蝶呤含量检测方法对上述样品溶液进行检测，两种处理方法检测的囊泡浓悬液浓度分别为：样品A：20.01μg/mL及样品B：19.84μg/mL，百分比差异为0.8％，说明本发明所述的囊泡前处理方法与传统的裂解方法无明显差异。
实施例4高效液相色谱检测方法的对比
将本发明所述的高效液相色谱检测方法与《中国药典2015》收录的方法进行对比，具体的，本发明的液相方法所用色谱柱为C18，流动相为：0.01M磷酸二氢钾溶液-乙腈9:1(pH 6.60)，检测波长为304nm，进样体积为40μL，检测波长为304nm，单针运行时间为10min。《中国药典2015》收录的方法所用色谱柱为C18，流动相为乙腈-7.0％枸橼酸溶液-2.0％无水磷酸氢二钠溶液(8.5：10：80)(用7.0％枸橼酸溶液或2.0％无水磷酸氢二钠溶液调节pH值至6.0)，检测波长为302nm，进样体积为40μL，检测波长为304nm，单针运行时间为20min。用两种方法检测分析同一份样品溶液，本发明方法检测的出峰时间为5.228min，峰面积为195.8873，峰高为1305.94；药典方法检测的出峰时间为12.416min，峰面积为197.2743，峰高为799.49；两种方法的峰面积基本一致，本发明方法的出峰时间快，且峰高响应值高。
实施例5高效液相色谱检测的方法验证
1、系统适用性及专属性试验：用实施例3所述的本发明的前处理方法处理空白囊泡，作为空白溶液进行检测，在目标出峰时间无明显干扰峰；重复检测同一对照溶液6次，相对标准偏差为：0.05％，第一针对照溶液的检测的主峰拖尾因子为1.14；分别取甲氨蝶呤与叶酸，用流动相溶解并稀释制成每l mL中各约含0.l mg的混合溶液，检测甲氨蝶呤与叶酸的分离度为22.39，结果表明本发明方法适用性及专属性良好。空白囊泡是不含药的囊泡，实验结果表明高效液相色谱检测的结果不受囊泡本身的影响，确保检测甲氨蝶呤的准确性。
2、线性试验：取6份空白囊泡溶液150μL，其中5份分别加入适量的甲氨蝶呤对照溶液，使甲氨蝶呤终浓度分别为1μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、50μg/mL，用生理盐水将各样品体积补至200μL，分别加入乙腈：氯仿(1:2)溶液600μL，置涡旋振荡器上混匀20s，置高速离心机中10000g离心5min，取上层溶液作为检测样品。经高效液相色谱仪检测分析，以样品浓度为横坐标，以甲氨蝶呤峰面积为纵坐标，得到直线方程为y＝1.9403x+0.0789(R2＝0.9999)。结果表明，甲氨蝶呤囊泡载药量在1μg/mL至50μg/mL浓度范围内线性关系良好。具体地，检测结果见表1和图1。
表1线性试验结果
样品甲氨蝶呤浓度μg/mL 峰面积
1 1.882
5 9.9571
10 19.0319
20 39.4449
50 96.9465
3、精密度及中间精密度试验：取同批次均匀载药囊泡悬液样品六份，各200μL，分别加入乙腈：氯仿(1:2)溶液600μL，置涡旋振荡器上混匀20s，置高速离心机中10000g离心5min，取上层溶液作为检测样品，检测结果用以评价精密度。进一步地，在第二天另一名试验员取同批次均匀载药囊泡样品六份，各200μL，分别加入乙腈：氯仿(1:2)溶液600μL，置涡旋振荡器上混匀20s，置高速离心机中10000g离心5min，取上层溶液作为检测样品，检测结果用以评价中间精密度。具体地，检测结果见表2。结果表明本发明方法精密度及中间精密度良好。
表2精密度及中间精密度检测结果
Figure BDA0002409228650000071
4、准确度试验：取均匀的囊泡浓悬液10份，制备样品浓度50％、100％、150％的甲氨蝶呤加标样品各三份，分别加入乙腈：氯仿(1:2)溶液600μL，置涡旋振荡器上混匀20s，置高速离心机中10000g离心5min，取上层溶液作为检测样品，计算各加标样品的回收率。具体地，准确度结果见表3。
表3准确度试验检测结果
Figure BDA0002409228650000072
5、方法耐用性：本发明方法涉及的方法耐用性包括流动相耐用性及柱温耐用性。具体地，流动相耐用性检测了pH 6.40及pH 6.80条件下的结果变化情况，进一步地，检测了水相与有机相比例为92:8、88:12时的结果变化情况。另外，柱温耐用性检测了柱温为28℃及32℃时的结果变化情况。具体的，耐用性结果见表4及表5。
表4.流动相耐用性检测结果
Figure BDA0002409228650000081
表5.柱温耐用性检测结果
Figure BDA0002409228650000082
结果表明，在不同检测条件下，样品及对照溶液的检测结果比值基本不变，说明在这些条件的变动对检测结果的影响不大，耐用性良好。
本发明的快速检测甲氨蝶呤囊泡载药量的方法，快速、准确、操作简单，对样品目标物浓度稀释比例小，灵敏度高，样品溶液在1μg/mL至50μg/mL浓度范围内线性关系良好，线性相关系数为0.9999；六次平行样检测的相对标准偏差为1.11％；中间精密度相对标准偏差为1.35％；九次样本加标平均回收率为98.44％；同时，检测方法的专属性良好，检测结果中甲氨蝶呤与叶酸分离度为22.39。

Claims (9)

1.一种载药囊泡的载药量检测方法，包括如下操作步骤：
1)将载药囊泡浓悬液加入乙腈和氯仿混合溶液，涡旋混匀，10000g离心，取上层溶液作为待测样品；
2)将待测样品注入高效液相色谱仪进行分析检测，得到载药囊泡的载药量。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述载药囊泡包裹的药物为临床上用于治疗各类肿瘤的化疗药，选自：治疗肺癌、白血病、卵巢癌、结肠癌、乳腺癌、膀胱癌、胃癌、肝癌或胶质瘤的化疗药中的一种或几种。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤1)中，将载药囊泡浓悬液加入其2～5倍体积的乙腈和氯仿混合溶液，所述载药囊泡浓悬液的浓度为108至1010个囊泡/毫升。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述乙腈和氯仿混合溶液中乙腈：氯仿体积比为1:1～1:3。
5.根据权利要求1-4任一项所述的检测方法，其特征在于，所述载药囊泡包裹的药物为甲氨蝶呤。
6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于：所述步骤1)中，取载药囊泡浓悬液100-300μL，加入其三倍体积的乙腈：氯仿体积比为1:2的混合溶液，置涡旋振荡器上混匀，置高速离心机中10000g离心，取上层溶液作为待测样品。
7.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述步骤2)中，高效液相色谱仪分析检测条件为：色谱柱为C18柱；泵流速为0.8～1.5mL/min，柱温为25～35℃；流动相为：体积比为8:1～10:1的0.01M磷酸二氢钾溶液-乙腈混合溶液，pH 6.40～6.80；检测波长为304nm，单针运行时间为10min。
8.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，包括以下操作步骤：
1)取载药囊泡浓悬液200μL，加入其三倍体积的乙腈：氯仿体积比为1:2的混合溶液，置涡旋振荡器上混匀20s，置高速离心机中10000g离心5min，取上层溶液作为待测样品；
2)将待测样品注入高效液相色谱仪进行分析检测，高效液相色谱条件为：色谱柱为C18柱；泵流速为1.0mL/min，柱温为30℃；流动相为：体积比为9:1的0.01M磷酸二氢钾溶液-乙腈混合溶液，pH 6.60；进样体积为40μL，检测波长为304nm，单针运行时间为10min。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，包裹甲氨蝶呤的载药囊泡载药量在1μg/mL至50μg/mL浓度范围内线性关系良好，R2为0.9999。
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