KR101795885B1 - 초고속 온라인 지질 추출기, 이를 이용한 생체 내 지질 추출과 분석 시스템 및 방법 - Google Patents

초고속 온라인 지질 추출기, 이를 이용한 생체 내 지질 추출과 분석 시스템 및 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 모세관; 모세관의 한쪽에 충진되는 제1충진제; 모세관의 다른 한쪽에 충진되고, 제1충진제와 극성이 다른 제2충진제; 및 모세관의 양단부에 설치되는 필터를 포함하는 지질 추출기를 제공하며, 또한 이를 이용한 생체 내 지질 추출과 분석 시스템 및 방법을 제공한다.

Description

초고속 온라인 지질 추출기, 이를 이용한 생체 내 지질 추출과 분석 시스템 및 방법{High speed on-line lipid extraction device, system and method for extracting and analyzing lipid from biological sample using the device}
본 발명은 액체크로마토그래피-질량분석기에 연결 가능한 초고속 온라인 지질 추출기에 관한 것으로, 뇨 또는 혈장시료를 개발된 온라인 지질 추출기에 직접 주입할 경우 신속한 지질 추출과 동시에 정성 및 정량분석을 수행할 수 있는 온라인 지질 추출기에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 개발된 온라인 지질 추출기를 이용한 생체 내 지질 추출과 분석 시스템 및 방법에 관한 것이다.
지질은 단백질 및 탄수화물과 더불어 생체에 반드시 필요한 3대 영양소로 불리며, 그 주요 역할은 에너지 저장 및 생체 내 각종 세포막 구성요소로 알려져 있다. 또한 생체 내에 존재하는 수백 가지의 호르몬 역시 지질의 한 분야이며, 몸의 기본 구성단위인 세포의 핵 수용체에서 각종 지질에 반응하여 유전자가 활성화되기도 하는 등, 지질은 신호전달물질로서 매우 중요한 역할을 하고 있는 것으로 알려져 있다.
지질은 대부분 양쪽성 성질을 갖고 있어 복잡한 지질 특성을 지니며, 지질을 추출하는 액체-액체 추출 방법의 경우 많은 시간이 소요되므로, 생체시료에서 지질만을 간단하게 추출을 할 수 있는 새로운 기술에 대한 수요가 지속적으로 늘어나고 있다.
Folch 방법은 1956년 메탄올과 클로로포름 유기용매 및 증류수를 이용하여 생체 시료에서 지질을 추출할 수 있는 최초의 방법으로서, 생물학 및 생화학 분야에서 현재까지 널리 쓰이고 있다. 이 방법은 액체-액체 추출법에 기반을 두고 있으며, 분석하고자 하는 지질의 종류에 적합하도록 유기 용매의 종류와 조성을 일부 변화시켜가면서 사용하고 있다.
본 발명자들도 식품분석 및 환경분석 분야에서 널리 사용되고 있는 퀘쳐스(QuECHERS) 방법을 지질 추출에 응용하여 간단한 추출법을 개발하고자 시도하였다. 이 추출법은 널리 쓰이는 액체-액체 추출법과 비교하여도 추출 효율이 뛰어나면서도 추출시간을 십여 분으로 크게 단축하는데 성공하였다. 하지만, 이 추출법의 경우 수분을 흡수하기 위한 황산마그네슘의 재사용이 불가능하여 크로마토그래피-질량분석법에 온라인으로 연결할 수 없다는 단점을 지니고 있으며, 수분을 흡수하는 과정이 발열과정으로 지질의 변형을 초래할 수 있는 위험성이 존재한다.
특허 문헌을 살펴보아도 대부분이 액체-액체 추출법을 기본으로 하여 확장되는 형태를 띠고 있음을 확인할 수 있다(US 8,383,845 B2; US 8,273,248 B1; US 8,211,308 B2).
본 발명의 목적은 신속한 지질 추출과 동시에 정성 및 정량분석을 수행할 수 있는 온라인 지질 추출기, 그리고 이를 이용한 생체 내 지질 추출과 분석 시스템 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 상술한 목적을 달성하기 위해, 모세관; 모세관의 한쪽에 충진되는 제1충진제; 모세관의 다른 한쪽에 충진되고, 제1충진제와 극성이 다른 제2충진제; 및 모세관의 양단부에 설치되는 필터를 포함하는 지질 추출기를 제공한다.
본 발명에서 제1충진제는 친수성 상호작용 액체크로마토그래피 비드(HILIC bead)일 수 있고, HILIC 비드는 화학식 1에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.
[화학식 1]
Figure 112015125553034-pat00001
본 발명에서 제2충진제는 부틸 사슬을 포함하는 C4 비드, 옥틸 사슬을 포함하는 C8 비드, 옥타데실 사슬을 포함하는 C18 비드 중에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.
본 발명에서 제1충진제 및 제2충진제의 평균 크기는 2 내지 10 ㎛일 수 있다.
본 발명에 따른 지질 추출기는 모세관의 양단부에 설치되고 0.1 내지 1.5 ㎛ 평균 크기의 포어를 포함하는 다공판을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 시료 주입기; 시료 주입기와 제1모세관을 통해 연결되는 제1포트를 구비하는 제1밸브; 제1밸브의 제2포트와 제2모세관을 통해 연결되는 제1이음부; 제1이음부와 제3모세관을 통해 입구측이 연결되고, 제1밸브의 제3포트와 제4모세관을 통해 출구측이 연결되는 지질 추출기; 제1밸브의 제4포트와 제5모세관을 통해 연결되는 제2이음부; 제2이음부와 제6모세관을 통해 연결되는 분석 칼럼; 분석 칼럼과 연결되는 질량 분석기; 및 제2이음부와 제7모세관을 통해 연결되는 제1포트, 제8모세관과 연결되는 제2포트, 제1이음부와 제9모세관을 통해 연결되는 제3포트, 제10모세관과 연결되는 제4포트를 구비하는 제2밸브를 포함하는 지질 추출과 분석 시스템을 제공한다.
본 발명에서 시료 주입기는 자동 시료 주입기이고, 고성능 액체크로마토그래피(HPLC)에 장착될 수 있다.
본 발명에서 제1밸브 및 제2밸브는 6포트 밸브이며, 제1밸브는 고성능 액체크로마토그래피(HPLC)에 장착되고, 제2밸브는 질량 분석기에 장착될 수 있다.
본 발명에서 제1모세관 내지 제9모세관의 내경은 50 내지 100 ㎛, 제10모세관의 내경은 5 내지 40 ㎛일 수 있다.
본 발명에서 제1이음부는 T 조인트이고, 제2이음부는 십자 조인트이며, 제2이음부에는 질량 분석기의 전극과 연결되는 와이어가 설치될 수 있다.
본 발명에서 분석 칼럼은 옥타데실 사슬을 포함하는 C18 비드를 포함하고, 말단에 테이퍼 구조를 가질 수 있다.
또한, 본 발명은 상술한 지질 추출과 분석 시스템을 이용하고, 시료 주입 단계, 표준물질 주입 단계, 분리 단계를 포함하는 지질 추출과 분석 방법을 제공한다.
본 발명에서 이동상으로 친수성의 제1용매 및 소수성의 제2용매를 사용하며, 시료 주입 단계 및 표준물질 주입 단계에서는 제1용매만을 사용하고, 분리 단계에서는 제2용매의 양을 점진적으로 변화시키는 기울기 용리법을 사용할 수 있다.
본 발명에서 제1용매는 부피비율로서 물 80 내지 100% 및 아세토니트릴 0 내지 20%를 포함하고, 제2용매는 부피비율로서 아세토니트릴 10 내지 30%, 메탄올 0 내지 30%, 이소프로판올 40 내지 70%의 혼합물을 포함하며, 제1용매 및 제2용매는 질량분석기로 시료가 들어갈 때 이온화를 도와주기 위한 포름산암모늄과 수산화암모늄을 포함할 수 있다.
본 발명의 시료 주입 단계에서 유체는 시료 주입기를 통해 유입된 후, 제1모세관, 제1밸브의 제1포트와 제2포트, 제2모세관, 제1이음부, 제3모세관, 지질 추출기, 제4모세관, 제1밸브의 제3포트와 제4포트, 제5모세관, 제2이음부, 제7모세관, 제2밸브의 제1포트와 제2포트를 거쳐 제8모세관으로 이동할 수 있다.
본 발명의 표준물질 주입 단계에서 유체는 시료 주입기를 통해 유입된 후, 제1모세관, 제1밸브의 제1포트와 제4포트, 제5모세관, 제2이음부, 제6모세관을 거쳐 분석 칼럼으로 이동할 수 있다.
본 발명의 분리 단계에서 유체는 시료 주입기를 통해 유입된 후, 제1모세관, 제1밸브의 제1포트와 제2포트, 제2모세관을 거쳐 제1이음부로 이동하고, 제1이음부에서 일부의 유체는 제3모세관, 지질 추출기, 제4모세관, 제1밸브의 제3포트와 제4포트, 제5모세관, 제2이음부, 제6모세관을 거쳐 분석 칼럼으로 이동하고, 제1이음부에서 나머지 유체는 제9모세관, 제2밸브의 제3포트와 제4포트를 거쳐 제10모세관으로 이동할 수 있다.
본 발명에서 제10모세관의 길이를 조절하여 제1이음부로부터 지질 추출기 쪽으로 흘러가는 유량을 300 내지 1000 nL/min로 조절할 수 있다.
본 발명의 방법은 시료 전처리 단계를 추가로 포함할 수 있고, 시료 전처리 단계는 시료와 알코올을 혼합하는 단계 및 혼합물을 원심분리한 후 상층액을 취하는 단계를 포함할 수 있으며, 또한 추출효율을 높이기 위하여 초음파 분해단계를 포함할 수 있다.
본 발명에 따르면, 신속한 지질 추출과 동시에 정성 및 정량분석을 수행할 수 있고, 적은 부피의 액상 생체 시료만으로도 지질의 정성적 및 정량적 분석을 수행할 수 있으며, 추출 과정에서 시료가 공기 중에 노출되지 않아 시료의 변성을 방지할 수 있고, 또한 추출 과정이 매우 간단하여 짧은 시간 이내에 여러 종류의 지질 시료들의 동시 추출이 가능하다.
도 1은 본 발명에 따른 지질 추출기의 단면도이다.
도 2는 본 발명에 따른 지질 추출과 분석 시스템의 구성도이다.
도 3은 본 발명에 따라 지질 표준물질을 이용하여 테스트해 본 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명과 종래 추출방법의 지질 추출효율을 비교한 결과를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
1. 지질 추출기
도 1은 본 발명에 따른 지질 추출기의 단면도로서, 본 발명의 지질 추출기(10)는 모세관(11), 제1충진제(12), 제2충진제(13), 필터(14), 다공판(15) 등을 구비할 수 있다.
모세관(11)은 가늘고 긴 관으로서, 내부에 지질 추출용 충진제를 수용하는 역할을 한다. 모세관(11)의 재질은 특별히 제한되지 않고, 예를 들어 용융 실리카, 천연 석영, 도핑된 용융 실리카 등을 사용할 수 있으며, 폴리이미드 등으로 코팅할 수도 있다. 모세관(11)의 크기는 특별히 제한되지 않고, 예를 들어 길이는 1 내지 10 ㎝, 외경은 250 내지 500 ㎛, 내경은 20 내지 200 ㎛일 수 있다.
제1충진제(12)는 고정상으로서 라이소 인지질 또는 산화 인지질 등과 같이 극성을 강하게 띠는 지질을 주로 흡착하는 역할을 한다. 제1충진제(12)는 극성 또는 친수성 충진제일 수 있다. 제1충진제(12)는 모세관(11)의 한쪽에, 예를 들어 모세관(11)의 입구 쪽에 충진될 수 있다. 제1충진제(12)의 평균 크기는 특별히 제한되지 않고, 예를 들어 고성능 액체 크로마토그래피의 성능에 따라 2 내지 10 ㎛, 바람직하게는 3 내지 5 ㎛일 수 있다. 제1충진제(12)의 충진량은 특별히 제한되지 않고, 예를 들어 모세관(11)의 길이를 기준으로 0.5 내지 5 ㎝, 바람직하게는 1 내지 3 ㎝일 수 있다. 제1충진제(12)의 종류는 특별히 제한되지 않고, 예를 들어 친수성 상호작용 액체크로마토그래피 비드(Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography(HILIC) bead)일 수 있다. HILIC 비드는 다공성 실리카 또는 폴리머 입자에 음이온, 양이온 또는 양쪽성 이온(zwitterion)이 직접 또는 링커 등을 통해 간접적으로 결합된 것일 수 있다. 폴리머로는 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA), 폴리스티렌-디비닐벤젠(PS-DVB), 폴리에틸렌글리콜, 폴리덱스트란 등을 사용할 수 있다. 양쪽성 이온으로는 술포베타인(sulfobetaine) 이온, 포스포릴콜린(phosphorylcholine) 이온, 암모늄-설폰산 리간드 등을 사용할 수 있다. HILIC 비드의 일 예는 화학식 1과 같다.
[화학식 1]
Figure 112015125553034-pat00002
제2충진제(13)는 고정상으로서 극성 지질 외 다른 지질을 흡착하는 역할을 한다. 제2충진제(13)는 제1충진제(12)와 극성이 다를 수 있고, 예를 들어 비극성 또는 소수성 충진제일 수 있다. 제2충진제(13)는 모세관(11)의 한쪽에, 예를 들어 모세관(11)의 출구 쪽에 충진될 수 있다. 제2충진제(13)의 평균 크기는 특별히 제한되지 않고, 예를 들어 역시 고성능 액체 크로마토그래피의 성능에 따라 2 내지 10 ㎛, 바람직하게는 3 내지 5 ㎛일 수 있다. 제2충진제(13)의 충진량은 특별히 제한되지 않고, 예를 들어 모세관(11)의 길이를 기준으로 0.5 내지 5 ㎝, 바람직하게는 1 내지 3 ㎝일 수 있다. 제2충진제(13)의 종류는 특별히 제한되지 않고, 예를 들어 C4 비드, C8 비드, C18 비드 중에서 선택되는 1종 이상일 수 있다. C4 비드, C8 비드, C18 비드는 다공성 실리카 또는 폴리머 입자에 각각 부틸, 옥틸, 옥타데실 탄소 사슬이 직접 또는 링커 등을 통해 간접적으로 결합된 것일 수 있다. 바람직하게는, 차후 분리과정에서 분리 피크의 너비를 줄일 수 있는 C4 비드를 사용할 수 있다.
필터(14)는 모세관(11)의 양단부에 설치되어 모세관(11)에 채워진 충진제(12, 13)가 빠져나가지 않도록 막아주는 역할을 한다. 필터(14)로는 예를 들어 인라인 필터(in-line filter)를 이용할 수 있다.
다공판(15)은 모세관의 양단부에 설치되어 실질적으로 충진제(12, 13)의 이탈을 방지하는 역할을 한다. 다공판(15)은 필터(14)에 장착될 수 있다. 다공판(15)은 다수의 포어를 갖는데, 이 포어의 평균 크기는 충진제(12, 13)의 크기보다 작아야 하며, 예를 들어 0.1 내지 1.5 ㎛일 수 있다.
지질 추출기(10)의 입구 측은 제1밸브(40) 방향과 연결될 수 있고, 출구 측은 분석 칼럼(60) 방향과 연결될 수 있다.
지질 추출기(10)의 제조방법은 다음과 같다. 모세관(11)에 충진제(12, 13)를 채워주기 위하여, 모세관(11)의 한쪽 끝에만 필터(14)를 연결한 후, 다른 한쪽 끝은 제2충진제(13) 및 용매를 이용하여 만든 슬러리에 담그고 고압의 가스를 밀어 넣어 충진제가 빨려 올라가도록 한다. 용매는 예를 들어 물과 알코올(메탄올 등)의 혼합물일 수 있고, 혼합비율은 부피 비율로서 물 20 내지 40% 및 알코올 60 내지 80%일 수 있다. 가스는 예를 들어 비활성 가스(헬륨 등)일 수 있고, 가스 압력은 예를 들어 500 내지 1500 psi일 수 있다. 제2충진제(13)를 0.5 내지 5 ㎝의 모세관 길이만큼 채운 후, 제1충진제(12)도 같은 방식으로 슬러리를 만들어 모세관(11)의 다른 쪽에 채워주고, 모세관(11)의 반대쪽 끝도 필터(14)로 막아준다.
종래에는 본 발명과 같이 질량분석기에 온라인으로 연결하여 사용할 수 있는 칼럼 형태의 지질 추출기가 아예 없었으며, 본 발명에서는 충진제를 포함하는 칼럼 형태의 지질 추출기를 최초로 개발하였다.
2. 지질 추출과 분석 시스템
도 2는 본 발명에 따른 지질 추출과 분석 시스템의 구성도로서, 본 발명의 시스템은 지질 추출기(10), 시료 주입기(20), 제1모세관(30), 제2모세관(31), 제3모세관(32), 제4모세관(33), 제5모세관(34), 제6모세관(35), 제7모세관(36), 제8모세관(37), 제9모세관(38), 제10모세관(39), 제1밸브(40), 제1이음부(50), 제2이음부(51), 분석 칼럼(60), 질량 분석기(70), 와이어(71), 제2밸브(80) 등을 구비할 수 있다.
시료 주입기(20)는 시료를 주입하는 역할을 한다. 시료 주입기(20)는 예를 들어 자동 시료 주입기(autosampler)일 수 있고, 고성능 액체크로마토그래피(HPLC: High Performance Liquid Chromatography)에 장착될 수 있다. 시료 주입기(20) 이전에는 펌프가 연결될 수 있다.
제1모세관(30)은 시료 주입기(20)와 제1밸브(40)의 제1포트를 연결하는 역할을 하고, 제2모세관(31)은 제1밸브(40)의 제2포트와 제1이음부(50)를 연결하는 역할을 하며, 제3모세관(32)은 제1이음부(50)와 지질 추출기(10)를 연결하는 역할을 하고, 제4모세관(33)은 지질 추출기(10)와 제1밸브(40)의 제3포트를 연결하는 역할을 하며, 제5모세관(34)은 제1밸브(40)의 제4포트와 제2이음부(51)를 연결하는 역할을 하고, 제6모세관(35)은 제2이음부(51)와 분석 칼럼(60)을 연결하는 역할을 하며, 제7모세관(36)은 제2이음부(51)와 제2밸브(80)의 제1포트를 연결하는 역할을 하고, 제8모세관(37)은 제2밸브(80)의 제2포트와 연결되어 폐액(waste)을 배출하는 역할을 하며, 제9모세관(38)은 제1이음부(50)와 제2밸브(80)의 제3포트를 연결하는 역할을 하고, 제10모세관(39)은 제2밸브(80)의 제4포트와 연결되어 지질 추출기(10) 및 분석 칼럼(60) 쪽으로 흘러가는 유량을 조절하는 역할을 한다.
제1모세관(30), 제2모세관(31), 제3모세관(32), 제4모세관(33), 제5모세관(34), 제6모세관(35), 제7모세관(36), 제8모세관(37), 제9모세관(38)의 내경은 예를 들어 50 내지 100 ㎛일 수 있다. 제10모세관(39)의 내경은 제1모세관(30) 내지 제9모세관(38)의 내경보다 작아야 하며, 예를 들어 5 내지 40 ㎛일 수 있다. 제10모세관(39)은 시료와 용매를 분석 칼럼(60) 쪽으로 보내기 위한 압력 모세관(pressure capillary tube)일 수 있고, 제10모세관(39)의 길이를 조절하여 지질 추출기(10) 및 분석 칼럼(60) 쪽으로 흘러가는 유량을 조절할 수 있다. 모세관을 이용함에 따라 압력이 많이 걸리므로, LC로는 약 400 기압을 견디는 HPLC보다는, 600 기압 이상을 견딜 수 있는 초고압 LC(UPLC)를 사용하는 것이 바람직하다.
제1밸브(40) 및 제2밸브(80)는 지질 추출기(10), 시료 주입기(20), 분석 칼럼(60) 등과 연결됨으로써, 유로를 변경하는 역할을 한다. 이 두 밸브(40, 80)를 통해 본 발명의 온라인 지질 추출기(10)를 액체 크로마토그래피 및 질량 분석기(70)에 연결 가능하도록 구성할 수 있다. 제1밸브(40) 및 제2밸브(80)는 복수의 포트를 구비할 수 있고, 예를 들어 6포트(port) 밸브일 수 있다. 도 2에서, 제1밸브(40)의 제1포트는 좌측 상부, 제2포트는 좌측 중앙, 제3포트는 우측 중앙, 제4포트는 우측 상부, 제5포트는 좌측 하부, 제6포트는 우측 하부에 위치할 수 있다. 도 2에서, 제2밸브(80)의 제1포트는 좌측 상부, 제2포트는 우측 상부, 제3포트는 좌측 하부, 제4포트는 우측 하부, 제5포트는 좌측 중앙, 제6포트는 우측 중앙에 위치할 수 있다. 제1밸브(40) 및 제2밸브(80)의 제5포트 및 제6포트는 각각 막혀 있다. 제1밸브(40)는 HPLC에 장착될 수 있고, 제2밸브(80)는 질량 분석기(70)에 장착될 수 있다.
제1이음부(50) 및 제2이음부(51)는 유로 변경을 위한 분기점 역할을 한다. 제1이음부(50)는 예를 들어 T 조인트(T joint)로 구성되어 지질 추출기(10), 제1밸브(40), 제2밸브(80) 쪽으로 각각 분기될 수 있다. 제2이음부(51)는 예를 들어 십자 조인트(cross joint)로 구성되어 제1밸브(40), 분석 칼럼(60), 제2밸브(80) 쪽으로 각각 분기될 수 있다. 제2이음부(51)의 일측에는 와이어(71)가 설치될 수 있고, 이 와이어(71)를 통해 질량 분석기(70)의 전극을 연결할 수 있다.
분석 칼럼(60)은 지질을 정량 및/또는 정성 분석하는 역할을 하며, 지질 추출기(10)에서 포집된 지질을 극성에 따라 분리할 수 있다. 분석 칼럼(60)은 별도로 자체 제작한 칼럼일 수 있고, 또한 HPLC에 장착될 수 있다. 분석 칼럼(60)은 지질 추출기(10)와 유사하게 모세관에 고정상으로서 충진제를 충진한 칼럼일 수 있다. 모세관의 재질은 예를 들어 용융 실리카, 천연 석영, 도핑된 용융 실리카 등을 사용할 수 있고, 모세관의 길이는 5 내지 30 ㎝, 외경은 250 내지 500 ㎛, 내경은 20 내지 200 ㎛일 수 있다. 분석 칼럼(60)에 사용되는 충진제로는 온라인 지질 추출기에 사용된 비드보다 더 큰 비극성을 가지는 비드를 자유롭게 사용할 수 있고, 바람직하게는 C18 비드를 사용할 수 있다. 충진제의 평균 크기는 예를 들어 2 내지 10 ㎛, 충진량은 예를 들어 모세관의 길이를 기준으로 5 내지 30 ㎝일 수 있다. 분석 칼럼(60)의 한쪽 끝은 충진제가 새어나가지 않도록 인라인 필터 등으로 막을 수 있고, 분석 칼럼(60)의 다른 한쪽 끝은 질량 분석기(70)를 향한 전자 분무 이온화가 잘 이루어지도록 바늘처럼 테이퍼(taper) 구조를 가질 수 있다. 말단의 테이퍼 구조의 길이는 예를 들어 5 내지 20 ㎛일 수 있다.
질량 분석기(70)는 지질을 정량 및/또는 정성 분석하는 역할을 하며, 시료를 기화하여 전자분무방식(Electrospray)으로 이온화하고 이온화된 물질을 그 질량에 따라 분석할 수 있다. 이온화를 위해 제2이음부(51)에 와이어(71)가 설치될 수 있다. 와이어(71)는 백금(Pt) 등의 금속으로 이루어질 수 있다. 도 2에서는 분석 칼럼(60)과 질량 분석기(70)가 붙어 있는 것으로 예시되었으나, 실제로는 일정 간격으로 떨어져 있으며, 이에 따라 시료 등은 질량 분석기(70)를 향해 공기 중으로 분무될 수 있다.
3. 지질 추출과 분석 방법
본 발명에 따른 지질 추출과 분석 방법은 도 2와 같은 지질 추출과 분석 시스템을 이용한다. 본 발명의 방법은 크게 3단계로 구성될 수 있는데, 구체적으로 시료 주입 단계, 표준물질 주입 단계, 분리 단계로 구성될 수 있다. 시료 주입 단계 및 표준물질 주입 단계의 순서는 바뀌어도 무방하다. 또한, 본 발명의 방법은 시료 주입 단계 이전에 시료 전처리 단계를 포함할 수 있다.
이동상인 용매는 제1용매 및 제2용매의 두 종류를 사용할 수 있다. 제1용매는 시료를 지질 추출기(10)에 주입하고 이온, 염 및 친수성 펩타이드 등의 불순물을 씻어내기 위한 친수성의 용매일 수 있다. 제2용매는 지질 추출기(10)에 남아있는 지질을 분석 칼럼(60)과 질량 분석기(70)에 이동시켜 분리 및 검출하기 위한 소수성의 용매일 수 있다. 제1용매(용매 A)는 극성 용매일 수 있고, 예를 들어 부피비율로서 물 80 내지 100% 및 아세토니트릴 0 내지 20%를 포함할 수 있다. 제2용매(용매 B)는 유기 용매일 수 있고, 예를 들어 부피비율로서 아세토니트릴 10 내지 30%, 메탄올 0 내지 30%, 이소프로판올 40 내지 70%의 혼합물을 포함할 수 있다. 각각의 용매에는 질량분석기로 시료가 들어갈 때 이온화를 도와주기 위한 1 내지 10 mM의 포름산암모늄과 0.01 내지 0.05% 수산화암모늄을 첨가할 수 있다. 시료 주입 단계 및 표준물질 주입 단계까지는 제1용매만을 사용할 수 있고, 분리 단계에서는 제2용매의 양을 점진적으로 변화시키는 기울기(gradient) 용리법을 사용할 수 있다.
표 1은 각 단계에서의 밸브 설정을 표기한 것으로, 유로변경 설정을 나타낸 것이다. 도 2를 참고하면, 6포트 밸브(40, 80)에서 A 모드는 실선, B 모드는 점선으로 표시되고, 밸브 모드의 조합에 따라 적어도 4가지 유로 모드가 가능하다.
제1밸브(40) 제2밸브(80)
제1단계: 시료 샘플 주입 A A
제2단계: 표준 물질 주입 B B
제3단계: 분리 A B
─ A, … B
먼저, 시료 주입 단계에서는 제1용매만 사용할 수 있다. 이 단계에서 유량은 예를 들어 0.1 내지 3 ㎕/min일 수 있다. 시료 주입 단계에서 제1밸브(40) 및 제2밸브(80)의 모드는 모두 A 모드이며, 이 경우 유체는 시료 주입기(20)로부터 제1모세관(30)을 통해 제1밸브(40)의 제1포트로 유입된 후, 제1밸브(40)의 제2포트 및 제2모세관(31)을 통해 제1이음부(50)에 도달한다. 이때, 제2밸브(80)의 제5포트가 막혀 있기 때문에, 유체는 제9모세관(38) 쪽으로 흐르지 못하고, 제3모세관(32)을 거쳐 지질 추출기(10) 쪽으로만 흐른다. 이후, 유체는 제4모세관(33), 제1밸브(40)의 제3포트 및 제4포트, 제5모세관(34)을 거쳐 제2이음부(51)에 도달한다. 제2이음부(51)에서 유체는 분석 칼럼(60) 쪽으로 흘러가지 않고, 제7모세관(36)을 통해 제2밸브(80) 쪽으로 흘러간 후, 제2밸브(80)의 제1포트와 제2포트를 거쳐 제8모세관(37)에서 배출된다. 분석 칼럼(60)은 C18 충진제로 채워져 있어 거의 막힌 상태인데 반해, 제7모세관(36)과 제8모세관(37) 쪽은 빈 모세관이기 때문에 유체가 칼럼 쪽으로 흐르지 못하기 때문에 나타나는 현상이다. 시료가 지질 추출기(10)에 흡착된 후 제1용매를 1 내지 20분 정도 흘려주어 시료 내에 존재하는 친수성 펩타이드, 저분자 물질, 무기 이온 등을 제거할 수 있다.
다음, 표준물질 주입 단계에서는 제1용매만 사용할 수 있다. 이 단계에서 유량은 예를 들어 0.1 내지 3 ㎕/min일 수 있다. 표준물질 주입 단계에서 제1밸브(40) 및 제2밸브(80)의 모드는 모두 B 모드이며, 이 경우 제1밸브(40)의 제1포트와 제2포트 구간이 막히고, 제1포트와 제4포트 구간이 연결되며, 제4포트와 제3포트 구간도 막히므로, 유체는 시료 주입기(20)로부터 제1모세관(30)을 통해 제1밸브(40)의 제1포트로 유입된 후, 지질 추출기(10) 쪽으로 흐르지 못하고, 제1밸브(40)의 제4포트와 제5모세관(34)을 통해 제2이음부(51)로만 흐르게 된다. 제2밸브(80)에서 제1포트와 제2포트 구간이 막히고, 제5포트도 막히므로, 유체는 제2밸브(80) 쪽으로 흐르지 못하고, 제2이음부(51)에서 제6모세관(35)을 통해 분석 칼럼(60)으로만 흐르게 된다. 이때 표준물질을 주입하여 분석 칼럼(60) 입구에 직접 흡착되도록 한다. 표준물질은 지질 추출기(10)가 아닌 분석 칼럼(60)에 직접 주입하여 표준물질이 시료 주입 및 불순물 제거 단계에 의해 영향을 받지 않을 수 있다.
다음, 분리 단계에서는 제1용매 및 제2용매를 모두 사용할 수 있다. 이 단계에서 유량은 이전 단계들보다 많아야 하며, 적어도 5 ㎕/min 이상일 수 있다. 유량 상한치는 제10모세관(39)의 규격에 따라 달라지는데, 예를 들어 50 ㎕/min일 수 있다. 분리 단계에서 제1밸브(40)는 A 모드이고 제2밸브(80)는 B 모드이며, 이 경우 유체는 시료 주입기(20), 제1모세관(30), 제1밸브(40)의 제1포트와 제2포트, 제2모세관(31), 제1이음부(50), 제3모세관(32), 지질 추출기(10), 제4모세관(33), 제1밸브(40)의 제3포트와 제4포트, 제5모세관(34), 제2이음부(51), 제6모세관(35)을 거쳐 분석 칼럼(60)으로 흐를 수 있다. 또한, 유체는 제1이음부(50)에서 제9모세관(38), 제2밸브(80)의 제3포트와 제4포트를 거쳐 제10모세관(39)으로 흐를 수 있다. 제2밸브(80)의 제1포트와 제2포트 구간이 막히고 제5포트도 막히므로, 제2이음부(51)에서 제2밸브(80) 쪽으로는 유체가 흐르지 못한다.
이와 같이, 제1이음부(50)에서는 용매가 분산되어 이동하게 되는데, 용매의 일부는 지질 추출기(10)와 분석 칼럼(60)을 차례대로 지난 후 질량 분석기(70) 입구까지 흘러가고, 나머지 용매는 제9모세관(38), 제2밸브(80)를 지난 후 제10모세관(39)으로 흘러간다. 제10모세관(39)의 길이 조절을 통해, 분기점인 제1이음부(50)로부터 지질 추출기(10) 쪽으로 흘러가는 유량은 전체 유량의 1 내지 20%일 수 있고, 제1이음부(50)로부터 제2밸브(80) 쪽으로 흘러가는 유량은 전체 유량의 80 내지 99%일 수 있다. 시료 주입기(20)에서 흘려나오는 유체의 유량은 수 내지 수십 ㎕/min 단위일 수 있지만, 제10모세관(39)의 길이를 조절하여 분석 칼럼(60)과 질량 분석기(70) 방향으로는 300 내지 1000 nL/min 정도의 유체가 흘러가도록 유량을 조절함으로써, 질량 분석 시 용매를 최소화하여 이온화 효율을 높일 수 있다.
분리 단계에서는 기울기 용리법을 사용하는데, 이전 단계까지 제1용매가 100% 사용되었다가, 분리 단계가 시작됨에 따라서 제2용매의 비율을 점차적으로 증가시킨다. 예를 들어 분리 단계의 시작부터 0.1 내지 3분간 제2용매의 비율을 60 내지 80%로 높이고, 이후 5 내지 20분간 제2용매의 비율을 81 내지 94%로 서서히 증가시키며, 이후 0.1 내지 5분간 제2용매의 비율을 95 내지 99%로 상승시킨 뒤, 이후 10 내지 30분간 제2용매의 비율을 95 내지 99%로 유지시킬 수 있다. 하지만, 자세한 기울기 용리법의 내용은 분석하고자 하는 지질의 성질에 따라 실험적으로 다르게 결정될 수 있다.
이와 같이, 분리 단계에서 기울기 용리법을 사용하여 제2용매의 비율이 95 내지 99%까지 높아지도록 시간에 따라 조절할 경우, 지질 추출기(10)에 흡착된 시료가 탈착되어 분석 칼럼(60)으로 이동하게 되고, 분석 칼럼(60)에서 지질의 소수성 정도에 따라 분리될 수 있다. 지질 추출기(10)에 채워진 충진제가 HILIC 및 C4이고, 분석 칼럼(60)의 충진제는 C18일 경우, 소수성의 지질은 제2용매 조성이 낮은 단계에서부터 지질 추출기(10)에서 흘러나와 분석 칼럼(60)의 끝에 다시 흡착되며, 제2용매의 비율이 높아질 때 분석 칼럼(60)에서 용리된 뒤 질량 분석기(70)에서 검출될 수 있다.
시료의 전처리 단계는 시료와 알코올을 혼합하는 단계 및 혼합물을 원심분리한 후 상층액을 취하는 단계를 포함할 수 있으며, 또한 추출효율을 높이기 위하여 초음파 분해단계를 포함할 수 있다. 시료에 일정량의 알코올을 첨가하는 이유는 시료에 포함된 단백질을 응집 또는 석출시킴과 동시에, 생체 시료 내에 존재하는 효소 등의 구조변화를 유발하여 그 활성을 억제하거나, 서로 뭉쳐있는 지질분자들을 분산시켜 충진제에 잘 흡착되도록 하려는 목적 때문이다. 알코올로는 메탄올, 에탄올 등을 사용할 수 있다. 시료와 알코올의 혼합비율은 예를 들어 부피비율로서 시료 50 내지 90% 및 알코올 10 내지 50%일 수 있다. 혼합시간은 예를 들어 1 내지 10분일 수 있다. 원심분리는 예를 들어 1000 내지 10000 g의 속도에서 1 내지 10분간 수행될 수 있으며, 지질 추출 효율을 높이기 위하여 원심 분리 이전 단계에서 초음파 분해를 3 내지 10분간 수행할 수 있다. 본 발명에서는 시스템에 온라인으로 연결되는 지질 추출기를 사용하기 때문에, 종래의 액체-액체 추출법과 비교하여 시료의 전처리가 매우 간단하다.
4. 유리한 효과
본 발명은 액체-고체 추출법에 근간을 두고 있으며, 소수성의 성질을 띠는 충진제를 채운 모세관(온라인 지질 추출기)을 자동 시료 주입기가 탑재된 고성능 액체 펌프, 액체 크로마토그래피(분석 칼럼), 그리고 전자 분무 이온화법을 이용한 질량 분석기 사이에 온라인으로 연결하는 구성을 가질 수 있다. 또한, 본 발명에서는 두 개의 6포트 밸브를 이용하여 시료는 온라인 추출기에 주입하고, 정량을 위한 표준물질은 온라인 추출기가 아닌 분석 칼럼(액체 크로마토그래피)에 직접 주입하여 표준물질이 시료 주입 및 불순물 제거 단계에 의해 영향을 받지 않을 수 있다. 이러한 온라인 추출법은 적은 부피(수 내지 수십 ㎕)의 액상 생체 시료만으로도 지질의 정성적 및 정량적 분석을 수행할 수 있다는 장점, 추출 과정에서 시료가 공기 중에 노출되지 않아 시료의 변성을 방지할 수 있다는 장점, 또한 추출 과정이 매우 간단하여 10분 이내에 여러 종류의 지질 시료들의 동시 추출이 가능하다는 장점을 지닌다.
전술한 바와 같이, 생체 내 지질의 역할이 하나씩 밝혀짐에 따라서 지질체학(lipidomics)이라고 통용되는 용어가 등장하는 등, 이 기술분야가 활발하게 성장하는 추세이다. 일례로 관상동맥질환은 인지질과 콜레스테롤을 지닌 지단백 입자 등이 혈관 내벽에 축적되어 혈액 흐름을 막는 등의 문제를 일으켜 발생하는 질병인 만큼, 지질과 매우 밀접한 관련을 가지고 있는 것으로 알려져 있다. 이러한 콜레스테롤을 운반하는 저밀도 지단백이나 고밀도 지단백의 주요 구성 성분은 인지질 및 트리아실글리세롤 등으로, 상위 개념인 지질에 대한 광범위한 연구는 관상동맥질환을 이해하는데 있어 필수적이라고 할 수 있으며, 최근 연구에 따르면 지단백 중에서도 산화된 지단백의 수가 지나치게 많게 되면 혈관 내벽에 플라그를 형성하여 혈관벽을 좁게 만드는 주요 원인으로 지목되었고, 이를 구성하고 있는 산화된 인지질에 대한 연구 역시 매우 중요한 과제 중 하나로 다루고 있다.
이러한 산화된 인지질의 경우 현재까지 in vivo에서의 연구는 상당히 미진한 실정인데, 가장 큰 이유로는 산화된 지질의 종류가 매우 다양하고, 일반 지질에 비해 미량이어서 질량분석기로도 쉽게 분석하기 힘든 점과, 지질 추출 과정에서 지질이 산소와 접촉하여 쉽게 산화되는 점 등을 들 수 있으나, 본 발명을 통하여 이러한 문제점을 단번에 극복할 수 있어 최종적으로 산화된 지단백 연구에 커다란 기여를 할 수 있을 것으로 기대된다.
또한, 지질이 생체 내 신호 전달 체계와 밀접한 연관을 지니고 있어 바이오마커로서 활용될 수 있는 가능성을 지니고 있으며, 이에 따라 진단 의학에서 사용하고자 많은 연구가 수행되고 있다. 하지만 환자에게서 채혈 및 채뇨를 할 수 있는 양이 한정되어 있고, 이를 모두 한 두 가지의 검사에 사용할 수 없다는 현실적인 문제를 감안한다면, 단 수 내지 수십 ㎕의 시료만으로 수백 가지의 지질을 동시 검출 및 정량에 이용할 수 있는 본 발명이 진단 의학 분야에서 매우 큰 잠재력을 지니고 있음을 알 수 있다.
마지막으로, 본 발명의 경우 실험자가 시료에 직접적으로 관여하는 부분은 시료를 메탄올 등의 유기용매와 섞은 후 원심분리하여 상층액을 떼어내는 것이 전부이기 때문에 숙련도가 필요하지 않다는 점, 온라인 추출을 하는데 걸리는 시간이 수 분으로 매우 짧다는 측면에서 진단 의학 분야에 활용할 수 있는 가치는 매우 크다고 볼 수 있다.
[실시예]
1. 온라인 지질 추출기 및 분석 칼럼 제작
온라인 지질 추출기의 경우, 용융 실리카 모세관(외경 365 ㎛, 내경 100 ㎛, Polymicro Technologies 제조, Phoenix, AZ, USA)에 제1충진제로서 HILIC 비드(입자 평균 크기 5 ㎛, 상표명 Nucleodur HILIC, Macherey-nagel 제조, Duren, Germany), 제2충진제로서 C4 비드(포어 크기 100 Å, 입자 평균 크기 5 ㎛, 상표명 Magic C4, Bruker-Michrom 제조, Auburn, CA, USA)를 각각 2 ㎝의 길이로 총 4 ㎝가 되도록 충진하였다. 충진제를 채워주기 위하여, 모세관 한쪽 끝에만 인라인 필터(IDEX Health & Science 제조, Oak Harbor, WA)를 연결한 후, 다른 한쪽 끝은 C4 비드와 용매(물 30%(v/v) 및 메탄올 70%(v/v))를 이용하여 만든 슬러리에 담그고, 1000 psi 압력의 헬륨 가스를 밀어 넣어 충진제가 빨려 올라가도록 하였다. 2 ㎝ 정도 채운 후, HILIC 슬러리를 이용하여 같은 방식으로 채워주고, 모세관의 반대쪽 끝도 인라인 필터로 막아주었다. 인라인 필터에 장착된 다공판의 포어 평균 크기는 약 0.5 ㎛이었다.
분석 칼럼의 경우, 용융 실리카 모세관(외경 365 ㎛, 내경 100 ㎛, Polymicro Technologies 제조, Phoenix, AZ, USA)의 한쪽 끝을 약 10 ㎛ 정도가 되도록 바늘 끝처럼 가늘게 뽑은 후, C18 비드(포어 평균 크기 100 Å, 입자 평균 크기 3 ㎛, Watchers ODS-P C18 resin, ISU Industry Co. 제조, Seoul, Korea)를 상술한 방법대로 압력용기에서 7 ㎝ 가량 충전하였다. 모세관의 다른 한쪽 끝은 충진제가 새어나가지 않도록 인라인 필터로 막아주었다.
2. 지질 추출과 분석 시스템 구성
도 2와 같이, 2개의 6포트 밸브, 1개의 지질 추출기, 1개의 분석 칼럼, 시료 주입기, 질량 분석기 등을 사용하였고, 두 개의 밸브를 이용하여 전자동으로 구동되도록 하였다. 제1밸브의 한쪽 끝은 고성능 펌프(HPLC)와 함께 자동 시료 주입기를 연결하여 시료가 이송되도록 구성하였고, 자동 시료 주입기에는 분석하고자 하는 시료들과 정량 분석 시 기준이 되는 표준물질 시료 용기들이 장착되었다. 질량분석기로는 Thermo Finnigan(San Jose, CA, USA)사의 TSQ vintage를 사용하였고, LC로는 Waters(Milford, MA, USA)사의 자동 시료 주입기가 장착된 NanoAcquity UPLC를 연결하여 사용하였다. 도 2의 제1밸브는 UPLC 내에 장착된 밸브이었고, 제2밸브는 질량분석기에 장착된 밸브이었다. 제1모세관 내지 제10모세관으로는 용융 실리카 모세관(Polymicro Technologies, Phoenix, AZ)을 사용하였고, 제10모세관의 내경은 약 20 ㎛이었고, 다른 모세관의 내경은 약 80 ㎛이었다. 제1이음부(T joint) 및 제2이음부(microcross)는 IDEX Health & Science(Oak Harbor, WA)사에서 구입하여 사용하였다. 제2이음부에는 Pt 와이어를 연결하여 질량분석기의 전극을 연결할 수 있도록 하였다.
3. 지질 추출과 분석 방법
모든 지질 표준물질은 Avanti Polar Lipid, Inc.(Alabaster, AL)에서 구매하였고, LC에 사용된 모든 HPLC grade 용매는 J. T. Baker(Phillipsburg, NJ)에서 구입하였으며, 이온화 효율을 높이기 위하여 용매에 같이 섞어준 수산화 암모늄과 포름산 암모늄 등의 modifier는 Sigma-Aldrich Co.(St.Louis, MO)에서 구입하였다.
용매는 대부분 물로 이루어진 극성용매와 유기용매를 포함한 2종류를 사용하였다. 제1용매(용매 A)는 물 90%(v/v) 및 아세토니트릴 10%(v/v)로 구성하였고, 제2용매(용매 B)는 아세토니트릴 20%(v/v), 메탄올 20%(v/v), 이소프로판올 60%(v/v)로 구성하였다. 각각의 용매에 10 mM의 포름산암모늄과 0.05% 수산화암모늄을 첨가하였다. 시료는 제1용매가 100% 흐를 때 주입하였고, 분석(분리 단계)이 시작됨에 따라서 제2용매의 비율을 점차적으로 증가시켰다. 구체적으로, 제2용매의 비율을 0.5분간 70%로 높였고, 이후 10분간 90%로 서서히 증가시켰으며, 이후 1분간 97%로 상승시킨 뒤, 20분간 97%에서 유지하였다.
시료의 추출 및 분석은 총 3단계로 구성하였고, 각 단계마다 두 개의 밸브가 유기적으로 움직여 유체의 흐름을 제어할 수 있도록 설정하였다.
먼저, 두 개의 밸브를 모두 (A, A) 모드로 설정함으로써, 분석하고자 하는 생체 시료를 자동 시료 주입기를 통하여 온라인 지질 추출기에 주입하였다. 이때 유체는 극성 용매(제1용매) 100%를 이용하였고, 이 용매는 지질 추출기를 지나 Pt 와이어가 연결된 마이크로크로스에서 분석 칼럼 쪽으로 빠지지 않고 제2밸브의 제8모세관으로 흘러나갔다. 시료가 온라인 지질 추출기에 흡착된 후 극성 용매를 5분 정도 흘려주어 시료 내에 존재하는 친수성 펩타이드와 저분자 물질 및 무기 이온 등을 제거하였다.
다음, 밸브를 조절하여 (B, B) 모드로 설정함으로써, 자동 시료 주입기에서 흘러나온 유체가 분석 칼럼으로만 100% 흐르게 하였다. 이때 표준물질을 주입하여 분석 칼럼 입구에 직접 흡착되도록 하였다.
마지막으로, 밸브를 (A, B) 모드로 설정하였다. 지질 추출기 입구에서 용매가 분산되어 이동하였는데, 용매 일부(약 10%)는 지질추출기와 분석 칼럼을 차례대로 지난 후 질량분석기 입구까지 흘러갔고, 나머지 용매(약 90%)는 제10모세관으로 흘러갔다. 이때 자동 시료 주입기에서 흘려 나온 용매는 수 ㎕/min 단위이지만, 제10모세관의 길이를 조절하여 분석 칼럼과 질량분석기 방향으로는 300 내지 1000 nL/min 정도가 흘러가도록 하였다. 또한, 이 단계에서 기울기 용리법을 사용하여 제2용매의 비율이 97%까지 높아지도록 시간에 따라 조절하였다.
[시험예]
1. 표준물질 테스트
도 3은 본 발명의 장치를 이용하여 10종의 지질 표준물질을 검출한 크로마토그램으로서, a는 분석 칼럼에 바로 주입한 것이고, b는 지질 추출기에 표준물질이 흡착되도록 한 것이다. 지질 표준물질은 각 3 pmol씩 2번 주입하여 테스트하였으며, 표준물질의 종류는 도 3의 우측에 기록하였다. 도 3의 a는 밸브를 (B, B) 모드로 설정하여 분석 칼럼에 바로 주입한 것이고, 도 3의 b는 밸브를 (A, A) 모드로 설정하여 지질 추출기에 표준 물질을 주입한 후 분석한 것이다. 분리 및 검출 시에는 모두 밸브를 (A, B) 모드로 설정하였다.
도 3에서 a가 b보다 전체적인 머무름 시간이 조금 빠른 것을 확인할 수 있으며, 이는 지질추출기와 분석 칼럼 사이의 연결구간을 통과하는데 추가 소요시간이 걸리기 때문으로 파악된다. 두 크로마토그램의 피크간 분리능이 크게 다르지 않은 것으로 보아, 지질 추출기와 분석 칼럼 사이의 연결 부분의 불용체적(dead volume)을 통과하는 동안 시료의 퍼짐 현상에 의한 분리능 저하가 일어나지 않는다는 것을 확인할 수 있다. 또한 피크의 높이 역시 크게 차이 나지 않는 것을 확인할 수 있으며, 이 사실로부터 시료가 지질 추출기에도 상당히 잘 흡착된다는 사실도 어림잡아 확인 가능하다. 이 결과는 뒤의 도 4에서 다시 한 번 다루도록 한다. 1번부터 3번의 피크는 라이소인지질을 나타낸 것으로, 두 가지 구조 이성질체가 존재하는 특성 때문에, 두 가지 이성질체가 완전히 분리되지 않아 숄더 피크(shoulder peak) 형태로 나타난 것이다.
2. 지질 추출효율 비교
도 4는 본 발명의 추출방법과 기존의 다양한 지질 추출방법의 지질 추출효율을 비교한 것이다. 표준물질을 뇨 시료에 섞은 후, 각각의 추출방법으로 추출한 뒤, 제1용매(용매 A)에 녹인 후, 질량분석기로 검출하여 피크면적을 계산하되, 질량분석기에 바로 주입한 표준물질의 양을 100으로 하여 상대적인 양을 비교하였다. 도 4에서 m/z는 mass/charge로서 질량으로 보면 되고, SpeedVac 및 under N2는 액체 용매의 증발 방법을 구분한 것으로, SpeedVac은 진공을 이용하여 증발한 경우이고, under N2는 산화 방지를 위해 질소를 사용한 경우이다.
기존에 널리 사용되고 있는 Folch 방법, 본 발명자의 연구실에서 변형시킨 변형된(modified) Folch & MeOH 방법, QuCHERS 방법 등을 본 발명에서 제시하는 온라인 추출방법(on-line extraction)과 서로 비교하기 위해, 표준물질을 500 fmol/㎕가 되도록 뇨 시료에 섞고 추출이 끝난 후 표준물질의 양을 측정하였다. 기준이 되는 시료는 제1용매에 같은 농도가 되도록 표준물질을 섞은 뒤 추출 과정을 거치지 않은 것으로, 직접 질량분석기에 주입한 뒤 검출되는 피크의 면적을 100으로 놓았다. 각각의 이온화 효율을 보정하기 위하여, 검출된 모든 피크는 15:0/15:0-PG 3 pmol을 분석 칼럼에 따로 주입한 후, 나타나는 상대적인 정량 값을 이용하였다. 분석 시료로는 뇨 시료와 물을 5:3의 부피비율로 섞은 시료를 이용하여 본 발명에 따른 온라인 추출방법을 제외한 나머지 추출방법에 사용하였다.
먼저, Folch 방법의 경우, 200 ㎕ 시료에 40 ㎕ 메탄올과 100 ㎕ 클로로포름을 섞고 30분 후, 원심분리(5000 g, 10 min)하고 분리된 상층액을 회수하여 SpeedVac으로 건조시켰으며, 동일한 시료를 같은 방법으로 준비한 후 건조한 질소 가스가 흐르는 기기에서 건조시켰다.
변형된 Folch & MeOH 추출방법의 경우, 200 ㎕의 시료를 40 ㎕의 메탄올 및 100 ㎕의 MTBE와 30분간 섞어준 후, 위와 같은 조건에서 원심 분리하여 아래층을 떼어내었다. 그 후 상층액에 100 ㎕의 메탄올을 넣어 다시 한번 섞고 원심분리 후, 상층액만을 떼어 앞선 아래층과 혼합한 뒤에 SpeedVac으로 건조시켰다. 같은 방법으로 동일한 시료를 전처리하되, 건조한 질소 가스가 흐르는 기기에서 건조시켰다. 준비된 4개의 시료는 20 ㎕의 클로로포름과 80 ㎕의 유기용매(아세토니트릴:메탄올=1:9, v/v), 그리고 100 ㎕의 제1용매로 희석하여 총 200 ㎕가 되도록 준비하였다.
QuECHERS 추출방법의 경우, 우선 200 ㎕의 뇨 시료를 300 mg의 추출 키트(MgSO4:CH3COONa=5:1, m/m) 및 400 ㎕의 혼합액(클로로포름:메탄올=2:1, v/v)과 1분간 섞은 후, 10000 g에서 10분간 원심분리하고 상층액을 회수한 뒤, 다시 한 번 50 mg의 C18 비드에 섞고 원심 분리한 후, 상층액만을 떼어서 최종 부피가 200 ㎕가 되도록 제1용매로 희석하였다.
마지막으로 본 발명인 온라인 추출방법의 경우, 시료 전처리는 125 ㎕의 뇨 시료와 75 ㎕의 메탄올을 5분간 섞어준 후, 5000 g에서 5분간 원심 분리하여 상층액을 떼어내면 되었다.
준비된 모든 시료는 20 ㎕씩 질량분석기에 주입하였다. 본 발명의 추출방법을 제외한 다른 추출 시료는 밸브를 (B, B) 모드로 설정한 상태에서 주입하였고, 다시 한번 15:0/15:0-PG 3 pmol을 주입한 뒤, 밸브를 (A, B) 모드로 바꾸어 검출하였다. 본 발명의 온라인 추출방법의 경우 (A, A) 모드에서 시료 주입 후, (B, B) 모드에서 15:0/15:0-PG를 주입한 뒤, 밸브를 (A, B) 모드로 바꾸어 검출하였다.
도 4를 보면, 라이소인지질 부분에서 Folch 방법의 추출효율이 70 내지 80% 정도로서, 다른 추출법과 비교하여 효율이 낮은 것을 확인할 수 있다. 이는 본 발명자의 연구실에서 변형된 Folch & MeOH 방법을 개발하게 된 이유로서, 먼저 발표된 논문과 유사한 경향을 보여준다(S.K. Byeon, J.Y. Lee, M.H. Moon Analyst 137 (2012) 451). 또한, Folch 방법은 기타 다른 지질의 경우에도 대부분 80%의 추출 효율을 보여, 최근 개발된 액-액 추출방법에 비해 전체적으로 낮은 수율을 나타냄을 확인할 수 있다. 반면에, 변형된 Folch & MeOH 및 QuCHERS 추출방법은 거의 대부분의 지질에 대하여 90%대의 높은 수율을 나타내고 있으며, 시료를 준비하는 과정에서 최종 건조시간이 보통 10시간 정도인 것을 감안한다면, QuCHERS 방법은 시료의 준비시간이 매우 짧음에도 불구하고 변형된 Folch & MeOH 방법과 비슷한 수준의 높은 수율을 나타내는 것을 알 수 있다. 마지막으로, 본 발명인 온라인 추출방법의 결과는 앞의 두 추출 방법과 비교하여 전체적으로 비슷하며, 오차의 범위가 5% 이내로 큰 차이가 없음을 알 수 있다. 준비시간을 고려하면 QuCHERS 방법보다 약간 짧은 수준으로 큰 차이가 나타나지 않으나, QuCHERS 방법의 경우 시료 전처리 과정에서 상당히 숙달된 기술이 필요하므로, 추출 과정 대부분이 자동화로 이루어져있는 본 발명의 장점이 크다고 판단된다.
10: 지질 추출기
11: 모세관
12: 제1충진제
13: 제2충진제
14: 필터
15: 다공판
20: 시료 주입기
30: 제1모세관
31: 제2모세관
32: 제3모세관
33: 제4모세관
34: 제5모세관
35: 제6모세관
36: 제7모세관
37: 제8모세관
38: 제9모세관
39: 제10모세관
40: 제1밸브
50: 제1이음부
51: 제2이음부
60: 분석 칼럼
70: 질량 분석기
71: 와이어
80: 제2밸브

Claims (16)

  1. 모세관;
    모세관의 한쪽에 충진되는 제1충진제;
    모세관의 다른 한쪽에 충진되고, 제1충진제와 극성이 다른 제2충진제; 및
    모세관의 양단부에 설치되는 필터를 포함하는 지질 추출기.
  2. 제1항에 있어서,
    제1충진제는 친수성 상호작용 액체크로마토그래피 비드(HILIC bead)인 것을 특징으로 하는 지질 추출기.
  3. 제2항에 있어서,
    친수성 상호작용 액체크로마토그래피 비드는 화학식 1에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 지질 추출기.
    [화학식 1]
    Figure 112015125553034-pat00003

  4. 제1항에 있어서,
    제2충진제는 부틸 사슬을 포함하는 C4 비드, 옥틸 사슬을 포함하는 C8 비드, 옥타데실 사슬을 포함하는 C18 비드 중에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 지질 추출기.
  5. 제1항에 있어서,
    제1충진제 및 제2충진제의 평균 크기는 2 내지 10 ㎛인 것을 특징으로 하는 지질 추출기.
  6. 제1항에 있어서,
    모세관의 양단부에 설치되고 0.1 내지 1.5 ㎛ 평균 크기의 포어를 포함하는 다공판을 추가로 포함하는 지질 추출기.
  7. 시료 주입기;
    시료 주입기와 제1모세관을 통해 연결되는 제1포트를 구비하는 제1밸브;
    제1밸브의 제2포트와 제2모세관을 통해 연결되는 제1이음부;
    제1이음부와 제3모세관을 통해 입구측이 연결되고, 제1밸브의 제3포트와 제4모세관을 통해 출구측이 연결되는 제1항에 따른 지질 추출기;
    제1밸브의 제4포트와 제5모세관을 통해 연결되는 제2이음부;
    제2이음부와 제6모세관을 통해 연결되는 분석 칼럼;
    분석 칼럼과 연결되는 질량 분석기; 및
    제2이음부와 제7모세관을 통해 연결되는 제1포트, 제8모세관과 연결되는 제2포트, 제1이음부와 제9모세관을 통해 연결되는 제3포트, 제10모세관과 연결되는 제4포트를 구비하는 제2밸브를 포함하는 지질 추출과 분석 시스템.
  8. 제7항에 있어서,
    시료 주입기는 자동 시료 주입기이고, 고성능 액체크로마토그래피(HPLC)에 장착되는 것을 특징으로 하는 지질 추출과 분석 시스템.
  9. 제7항에 있어서,
    제1밸브 및 제2밸브는 6포트 밸브이며, 제1밸브는 고성능 액체크로마토그래피(HPLC)에 장착되고, 제2밸브는 질량 분석기에 장착되는 것을 특징으로 하는 지질 추출과 분석 시스템.
  10. 제7항에 있어서,
    제1모세관 내지 제9모세관의 내경은 50 내지 100 ㎛, 제10모세관의 내경은 5 내지 40 ㎛인 것을 특징으로 하는 지질 추출과 분석 시스템.
  11. 제7항에 있어서,
    제1이음부는 T 조인트이고, 제2이음부는 십자 조인트이며, 제2이음부에는 질량 분석기의 전극과 연결되는 와이어가 설치되는 것을 특징으로 하는 지질 추출과 분석 시스템.
  12. 제7항에 있어서,
    분석 칼럼은 옥타데실 사슬을 포함하는 C18 비드를 포함하고, 말단에 테이퍼 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 지질 추출과 분석 시스템.
  13. 제7항의 지질 추출과 분석 시스템을 이용하고, 시료 주입 단계, 표준물질 주입 단계, 분리 단계를 포함하는 지질 추출과 분석 방법.
  14. 제13항에 있어서,
    시료 주입 단계에서 유체는 시료 주입기를 통해 유입된 후, 제1모세관, 제1밸브의 제1포트와 제2포트, 제2모세관, 제1이음부, 제3모세관, 지질 추출기, 제4모세관, 제1밸브의 제3포트와 제4포트, 제5모세관, 제2이음부, 제7모세관, 제2밸브의 제1포트와 제2포트를 거쳐 제8모세관으로 이동하는 것을 특징으로 하는 지질 추출과 분석 방법.
  15. 제13항에 있어서,
    표준물질 주입 단계에서 유체는 시료 주입기를 통해 유입된 후, 제1모세관, 제1밸브의 제1포트와 제4포트, 제5모세관, 제2이음부, 제6모세관을 거쳐 분석 칼럼으로 이동하는 것을 특징으로 하는 지질 추출과 분석 방법.
  16. 제13항에 있어서,
    분리 단계에서 유체는 시료 주입기를 통해 유입된 후, 제1모세관, 제1밸브의 제1포트와 제2포트, 제2모세관을 거쳐 제1이음부로 이동하고, 제1이음부에서 일부의 유체는 제3모세관, 지질 추출기, 제4모세관, 제1밸브의 제3포트와 제4포트, 제5모세관, 제2이음부, 제6모세관을 거쳐 분석 칼럼으로 이동하고, 제1이음부에서 나머지 유체는 제9모세관, 제2밸브의 제3포트와 제4포트를 거쳐 제10모세관으로 이동하는 것을 특징으로 하는 지질 추출과 분석 방법.
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