JP4573471B2

JP4573471B2 - 高速液体クロマトグラフ

Info

Publication number: JP4573471B2
Application number: JP2001178213A
Authority: JP
Inventors: 庸助岩田; 栄一山本; 薫村田; 泰石濱; 武司大伴; 直樹浅川
Original assignee: Shimadzu Corp; Eisai R&D Management Co Ltd
Current assignee: Shimadzu Corp; Eisai R&D Management Co Ltd
Priority date: 2001-06-13
Filing date: 2001-06-13
Publication date: 2010-11-04
Anticipated expiration: 2021-06-13
Also published as: JP2002372522A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、試料成分を分離する分離カラムと、この分離カラムに移動相を供給する移動相供給部と、この移動相供給部から分離カラムに至る流路に試料を注入する試料注入部と、分離カラムにより分離された試料成分を検出する検出器とを備えた高速液体クロマトグラフに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
高速液体クロマトグラフを用いた分析では、分離カラムにより分離された試料成分を検出器により検出する。その際、試料を分離カラムに導いて分離する方法として、試料注入部から注入した試料を移動相により分離カラムに直接導いて成分に分離させるか、又はいったんトラップカラムなどに注入試料の所望成分を吸着させて濃縮などを行なった後、別の移動相によりトラップカラムより離脱させて分離カラムに導いて成分に分離させる。
分析の対象となる試料は合成物であることや、代謝物や天然物であることもある。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
分析対象試料が合成物である場合は、試料中に含まれる混合成分の挙動は同じであることが多いが、代謝物や天然物となるとさまざまな性質のものが混合されている。そのため、代謝物や天然物を一度に分析することが非常に難しい。
【０００４】
性質の異なった成分を分析する際は、通常、性質ごとに複数回にわけて分析を行なわざるをえない。しかし、例えば代謝物など限られた試料量しか得られないものの場合、複数回に分けて分析を行なうことも難しくなる。
そこで、本発明は、代謝物や天然物のようにさまざまな性質の成分が混合されている試料であっても、一度の分析ですませることのできる高速液体クロマトグラフを提供することを目的とするものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明の高速液体クロマトグラフでは、試料注入部は性質の異なる２以上のトラップカラムと、それらのトラップカラムを直列に接続した状態でそれらのトラップカラムに試料を送り込む１つの試料導入用移動相流路と、それらのトラップカラムのいずれかを試料導入用移動相流路から分析用移動相流路に切り替えて接続するとともに、分析用移動相流路に接続されるトラップカラムを切り替える流路切替え機構とを備えているものとした。
【０００６】
異なるトラップカラムはそれぞれ異なる所望の試料成分を吸着してトラップできる性質のものである。例えば、トラップカラムが２個設けられている場合について説明すると、何れも逆相カラムで固定相の性質の異なるものの組合わせ、又は一方がイオン交換カラムで他方が逆相カラムであるような組合わせなどを用いることができる。
【０００７】
トラップカラムに試料を送り込む移動相は、それぞれのトラップカラムに所望の試料成分が吸着してトラップされるような特性のものを使用する。一方、移動相供給部から分離カラムに送られる移動相は、トラップカラムに吸着してトラップされていた試料成分をトラップカラムから離脱させて分離カラムに送ることのできる溶媒である。
【０００８】
【作用】
注入された試料をトラップカラムに送り込むことにより、試料中の所望の成分がそれぞれのトラップカラムに吸着してトラップされる。その後、別の移動相（分析用移動相）を移動相供給部から何れかのトラップカラムを経て分離カラムに流すことにより、そのトラップカラムにトラップされていた試料成分を脱離させて分離カラムに導き、分離分析を行なうことができる。分析用移動相の移動相供給部とトラップカラムとの接続を切り替えることにより、他のトラップカラムにトラップされていた試料成分も同様にして分離カラムに導き、分離分析を行なう。
【０００９】
このように、性質の異なった成分を含む代謝物や天然物などの試料であっても、複数のトラップカラムに成分をトラップさせた後、それらのトラップカラムにトラップされた成分を別々に分離カラムに導くことにより、一度の分析で性質の異なる試料成分を分析することができ、試料量は1回の注入量ですむ。
【００１０】
【発明の実施の形態】
（実施例）
図1は一実施例を示したものである。２は試料成分を分離する分離カラムであり、分離カラム２に分析用移動相を供給する移動相供給部４として２台の送液ポンプＰ３，Ｐ４が設けられている。この実施例では分析用移動相として２種類の溶媒の混合液を用い、その組成を時間とともに変化させるグラジエント分析を行なうために、２種類の溶媒を供給する２台の送液ポンプＰ３とＰ４が設けられている。６は分離カラム２により分離された試料成分を検出する検出器である。移動相供給部４から分離カラム２に至る流路に試料を注入するために試料注入部８が設けられている。本発明は試料注入部８に特徴をもっている。
【００１１】
試料注入部８では、２つの六方バルブＶ１とＶ２が設けられており、バルブＶ１には第１のトラップカラムＴＣ１が接続され、バルブＶ２には第２のトラップカラムＴＣ２が接続されている。トラップカラムＴＣ１とＴＣ２は性質の異なるトラップカラムであり、互いに異なった成分を吸着してトラップすることができる。バルブＶ１には試料注入用移動相を供給するための送液ポンプＰ１が接続され、その移動相流路に試料を注入するためのオートサンプラー１０が設けられている。移動相の送液ポンプＰ１と並列に洗浄液を供給する送液ポンプＰ２も接続されている。
Ｖ２には分析用移動相を供給する移動相供給部４が接続されている。バルブＶ１とＶ２が接続されて、カラム２はバルブＶ１に接続されている。
【００１２】
この実施例において、例えば、試料導入用の移動相として送液ポンプＰｌから水を送液し、洗浄液として送液ポンプＰ２からエタノールを送液する。トラップカラムＴＣｌとＴＣ２の組合せとして、例えば逆相−逆相（シアノプロピル−ＯＤＳ（オクタデシルシラン））やイオン交換一逆相の組合わせが有効である。ここでは、逆相−逆相（シアノプロピル−ＯＤＳ）での応用を考える。グラジエント分析用の移動相として、送液ポンプＰ３からは水、送液ポンプＰ４からアセトニトリルを送液するものとする。
【００１３】
次に、この実施例の動作について説明する。
（Ａ）トラップ工程：
試料注入部８で試料をトラップするために、バルブＶ１，Ｖ２を図1に実線で示される流路に設定する。
オートサンプラー１０により流路に試料を注入すると、送液ポンプＰｌより送られてくる水により試料が押し出され、トラップカラムＴＣｌにくる。トラップカラムＴＣｌのシアノプロピルはトラップカラムＴＣ２のＯＤＳに比べて親水性が弱く、脂溶性の高いものはトラップカラムＴＣｌで吸着されてトラップされるが、脂溶性の低い成分はそのままトラップカラムＴＣｌを素通りする。トラップカラムＴＣｌを素通りした残りの脂溶性の低い成分はトラップカラムＴＣ２に至り、トラップカラムＴＣ２で吸着されてトラップされる。試料のトラップ工程が終了したら送液ポンプＰｌからの送液を終了する。
このとき、分離カラム２に対しては、分析用移動相の有機溶媒濃度が低い状態で分離カラム２を安定化させるように、送液ポンプＰ３，Ｐ４から移動相を流しておく。
【００１４】
（Ｂ）トラップカラムＴＣ２にトラップされた成分の分析工程：
トラップカラムＴＣ２に吸着された脂溶性の低い成分の分析を行なう。流路は図２に実線で示されるように、バルブＶ1はそのままで、バルブＶ２を切り替える。分離カラム２は有機溶媒濃度が低い状態の移動相により安定化している。
【００１５】
バルブＶ２を切り替えたことにより、送液ポンプＰ３，Ｐ４の移動相がトラップカラムＴＣ２を通過して分離カラム２に入る。移動相組成を有機溶媒濃度が高くなる方向に変化させていくと、トラップカラムＴＣ２に吸着されていた成分はトラップカラムＴＣ２から離脱し、移動相とともに分離カラム２に搬送され、分離が行われる。分離カラム２で分離され溶出した成分が検出器６で検出される。
トラップカラムＴＣ２に吸着していた成分は脂溶性の低い成分であるため、有機溶媒濃度が比較的低い状態で全分析を終了することができる。
【００１６】
（Ｃ）トラップカラムＴＣ１にトラップされた成分の分析工程：
次にトラップカラムＴＣｌに吸着されていた脂溶性の高い成分の分析を行なう。流路は図３に実線で示されるように、バルブＶ１，Ｖ２をともに切り替える。
そして、バルブＶｌ，Ｖ２をともに切り替えたことにより、送液ポンプＰ３，Ｐ４からの移動相がトラップカラムＴＣｌを通過して分離カラム２に入る。移動相組成を有機溶媒濃度が高くなるように変化させていくと、トラップカラムＴＣｌに吸着されていた成分はトラップカラムＴＣｌから離脱し、移動相とともに分離カラム２に搬送され、分離が行われる。分離カラム２で分離され溶出した成分が検出器６で検出される。
【００１７】
トラップカラムＴＣｌに吸着されていた成分は脂溶性の高い成分であるため、有機溶媒濃度が比較的高い状態で全分析が終了する。
分析終了後、バルブＶ１，Ｖ２は図１の状態に戻し、送液ポンプＰ３，Ｐ４は初期状態に戻す。そして、オートサンプラー１０、トラップカラムＴＣｌ，ＴＣ２に送液ポンプＰ２から洗浄液を流して洗浄を行ない、その後、送液ポンプＰ２を停止し、送液ポンプＰ１からの水でパージして次の分析に備える。
トラップカラムＴＣｌ，ＴＣ２にトラップされていた成分の分析は、どちらを先に行なってもよい。
【００１８】
トラップカラムＴＣｌ，ＴＣ２、分析用移動相の例は上記のものに限られず、トラップカラムＴＣｌとＴＣ２で異なる成分をトラップすることができ、それらのトラップされた成分を分析用移動相で溶出して分離カラム２に導入できるものであればよい。そのような組合せの他の例として次のものを挙げることができる。
トラップカラムＴＣｌ ………逆相カラム
トラップカラムＴＣ２ ………カチオン交換カラム
分析用移動相 ………酢酸酸性水溶液
この分析条件で、逆相カラムのトラップカラムＴＣｌに酸性物質、カチオン交換カラムのトラップカラムＴＣ２に塩基性物質をそれぞれ選択的に吸着させてトラップ、濃縮することができる。
【００１９】
【発明の効果】
本発明の高速液体クロマトグラフでは、試料注入部は性質の異なる２以上のトラップカラムと、それらのトラップカラムに試料を送り込む移動相流路と、分析用移動相を供給する移動相供給部から分離カラムに至る流路をいずれかのトラップカラムに接続するとともにその接続を切り替える流路切替え機構とを備えているものとしたので、一度の分析でそれぞれのトラップカラムに異なる試料成分を吸着させてトラップすることができ、性質の異なる成分を含む代謝物のような試料量が少ない場合でも分析を行なうことができるようになる。
また、トラップカラムを用いることから試料成分の濃縮が行なわれるので、高感度な分析が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】一実施例の高速液体クロマトグラフを試料成分のトラップ動作の状態で示す流路図である。
【図２】同実施例をトラップＴＣ２にトラップされていた試料成分を溶出して分析する動作の状態で示す流路図である。
【図３】同実施例をトラップＴＣ１にトラップされていた試料成分を溶出して分析する動作の状態で示す流路図である。
【符号の説明】
２分離カラム
４移動相供給部
６検出器
８試料注入部
１０オートサンプラー
ＴＣｌ，ＴＣ２トラップカラム
Ｖ１，Ｖ２バルブ
Ｐｌ，Ｐ２，Ｐ３，Ｐ４送液ポンプ

Claims

試料成分を分離する分離カラムと、この分離カラムに分析用移動相を供給する移動相供給部と、この移動相供給部から前記分離カラムに至る分析用移動相流路に試料を注入する試料注入部と、前記分離カラムにより分離された試料成分を検出する検出器とを備えた高速液体クロマトグラフにおいて、
前記試料注入部は性質の異なる２以上のトラップカラムと、
それらのトラップカラムを直列に接続した状態でそれらのトラップカラムに試料を送り込む１つの試料導入用移動相流路と、
前記トラップカラムのいずれかを前記試料導入用移動相流路から前記分析用移動相流路に切り替えて接続するとともに、前記分析用移動相流路に接続される前記トラップカラムを切り替える流路切替え機構とを備えていることを特徴とする高速液体クロマトグラフ。