JP2007000687A - 生体試料中のペプチド分析方法及び装置 - Google Patents

Abstract

【課題】
煩雑な前処理を行なうことなく生体試料中のペプチドを分析できるようにする。
【解決手段】
表面にタンパク質は入り込めず分析対象のペプチドが入り込める大きさの細孔をもつ細孔性担体の外表面がタンパク質に対して不活性になる処理が施され、細孔内部のみにペプチド分子に対して吸着性をもつ反応基を化学修飾した充填材が充填されたカラムを前処理カラム２として用いる。そして、（１）タンパク質含有試料をトラップ用移動相により前処理カラム２に通してその試料中のペプチド分子を捕捉し、タンパク質を排出させ、その後、（２）前処理カラム２に捕捉されたペプチド分子を分析用移動相により溶出させ分析計に導いて分析する。
【選択図】 図１

Description

本発明は高速液体クロマトグラフィーなどの液体クロマトグラフィーを用いて血漿、血清、尿などタンパク質を含有する生体試料中のペプチドを分析する方法と装置に関するものである。

ペプチドは２個以上のアミノ酸がペプチド結合したものであり、ペプチドとタンパク質は結合しているアミノ酸の数によって区別される。狭義にはアミノ酸の数が１００以下のものがペプチドと呼ばれており、アミノ酸の数が２〜１０のものをオリゴペプチド、１０〜５０のものをポリペプチド、５０以上になると広義のタンパク質に含められる。

生体試料の分析には分離カラムとして逆相カラムを使用した高速液体クロマトグラフィーが広く用いられている。しかし、血漿、血清、尿などの生体試料中にはペプチドとタンパク質が混在するので、そのような生体試料中におけるペプチドの分析を行なうために試料を分離カラムに直接導入すると、試料中のタンパク質が分離カラムの充填材に吸着するなどして分離カラムの分離能力を阻害する。そのため、試料を分離カラムに導入する前に試料からタンパク質を除く除タンパクという前処理操作を行なうことが一般的である。

ヒドロキシ安息香酸や遊離薬物などの低分子化合物をそれとは化学的性質の異なるタンパク質から分離するための前処理として、細孔を有する担体の表面に親水性高分子物質を結合させ、細孔中に炭素鎖を化学的に結合させた充填材を充填した前処理カラムを使用して、低分子化合物を細孔内に捕捉し、タンパク質を排除することにより除タンパク操作を行なうことが提案されている（特許文献１，２参照。）。
ＷＯ０１／０５９４４４号公報 特開２００４−２４５６２０号公報

提案されている前処理カラムを使用する方法は、タンパク質から分離される対象物質がタンパク質とは化学的性質の異なる物質であるため、前処理カラムの充填材での分離が効率よく行なわれるものと推定される。しかしながら、ペプチドとタンパク質が混在する生体試料に対してもそのような前処理カラムで分離が可能であるかどうかは予想することは難しい。それは、ペプチド分子の化学的特性が基本的にタンパク質と同じであるために、ペプチドも充填材の表面の親水性高分子物質によってタンパク質とともに排除されてしまうことが懸念されるからである。そのため、これまでそのような前処理カラムによってペプチドとタンパク質を分離することは行なわれていない。

ペプチドとタンパク質はその化学的性質の同質性のために、単に有機溶媒による凝集を用いた前処理方法では分離できないことは明らかであることから、イオン交換膜を用いた遠心濃縮等の複雑な前処理が必要となっている。
本発明は、そのような煩雑な前処理を行なうことなく生体試料中のペプチドを分析できるようにすることを目的とするものである。

本発明のペプチド分析方法は、表面にタンパク質は入り込めず分析対象のペプチドが入り込める大きさの細孔をもつ細孔性担体の外表面がタンパク質に対して不活性になる処理が施され、細孔内部のみにペプチド分子に対して吸着性をもつ反応基を化学修飾した充填材が充填されたカラムを前処理カラムとして用いる。そして、（１）タンパク質含有試料をトラップ用移動相により前記前処理カラムに通してその試料中のペプチド分子を捕捉し、タンパク質を排出させる分離ステップと、（２）前記分離ステップで前記前処理カラムに捕捉されたペプチド分子を分析用移動相により溶出させ分析計に導いて分析するステップと、を備えている。

担体としてはシリカゲル、セルロース、アガロース又は合成ポリマーなどを使用することができる。
前処理カラムとして担体の細孔が２〜３０ｎｍの範囲で分析対象のペプチドの分子量に応じて設定されたものを使用するのが好ましい。本発明は、ペプチド分子と細孔内表面との吸着作用だけでなく、充填材の細孔径の大きさによるゲルろ過作用により、ある分子量以下のペプチドのみをトラップして分析することができる。例えば、６ｎｍの細孔径をもつ担体を使用すれば、分子量が約５０００をこえるペプチド分子は細孔に入ることができないため、分子量５０００以下程度のペプチドのみを選択的に濃縮して分析することができるようになる。

また、処理カラムとして担体の細孔が２〜３０ｎｍの範囲で互いに異なる大きさに設定されたものを複数本用意して流路に切替え可能に接続しておき、分析対象のペプチドの分子量に応じて最適なカラムを選択するようにしてもよい。

ペプチド分子に対して吸着性をもつ反応基の好ましいものは、オクタデシル基、スルフォン基（−ＳＯ₂ＯＨ）又は４級アミノ基であり、ペプチドの性質によって選択すればよい。例えば、オクタデシル基に吸着されにくい親水性のペプチドを分析対象にする場合は、細孔内を化学修飾する官能基としてオクタデシル基に替えてスルフォン基を導入した前処理カラムを使用することにより、親水性のペプチドを濃縮して分析することができるようになる。

タンパク質に対して不活性になるようにする担体の外表面処理の好ましい例は、親水性ポリマーによるコーティングである。そのコーティングに使用する親水性ポリマーとしては、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン又はヘキサジメチリンブロマイドなどを挙げることができる。

本発明のペプチド分析装置は、上に記載した本発明の前処理カラムを使用してペプチドとタンパク質を分離するものであり、その前処理カラムを備えた前処理部と、試料をトラップ用移動相により供給する試料導入部と、前処理カラムに捕捉されたペプチドを溶出させる分析用移動相を供給する分析用移動相供給部と、前処理カラムから分析用移動相により溶出されたペプチドを検出する分析計と、試料導入部を前処理カラムに接続する分離用流路及び分析用移動相供給部を前処理カラムに接続しその前処理カラムからの溶出液を分析計に導く分析用流路の間で切り替える流路切替え部と、を備えている。

本発明では、ペプチド分子を捕捉しタンパク質を排除するように調製された前処理カラムを用いるので、生体試料中のタンパク質を除去して分析対象のペプチドのみを分析カラムに導入することができるようになり、簡便な操作で安定したペプチドの分析を行なうことが可能となる。これまでイオン交換膜を用いた遠心濃縮等の複雑な前処理を必要としたタンパン質含有生体試料中のペプチド成分の分析が、そのような前処理なしで行なうことができるようになる。試料を希釈する程度の処理は行なった方が好ましいことが多いが、希釈などの操作は従来の前処理と比べると比較にならないくらい簡便な操作である。

次に、図１を参照して一実施例を具体的に説明する。
２は前処理カラムであり、一例としてシリカゲルの外表面を親水性ポリマーでコーティングし細孔内面のみをオクタデシル基で化学修飾した充填材を充填したものを使用する。前処理カラム２は流路切替え部を構成する六方バルブ４の２つのポート間に接続されている。

六方バルブ４の他の１つのポートには前処理カラム２に試料をトラップ用移動相により導入するための試料導入部が接続され、その試料導入部はトラップ用移動相を供給する送液ポンプ６と、その移動相流路に配置された試料注入用オートサンプラ８を備えている。

六方バルブ４のさらに他の１つのポートには、分析用移動相を供給するための分析用移動相供給部が接続されており、その分析用移動相供給部は２台の移動相用送液ポンプ１０,１２と、それらの送液ポンプ１０,１２から供給される移動相を混合するミキサー１４を備えている。分析用移動相は目的対象物に応じて種々の溶媒を使用することができ、この実施例では２種類の溶媒を混合してグラジエント分析を行なえるようにしている。

六方バルブ４のさらに他のポートには分析計として高速液体クロマトグラフの分析用カラム１６が接続されている。分析用カラム１６の下流には分析用カラム１６からの溶出液からペプチドを検出するために、ＵＶ（紫外線）検出器１８が設けられ、更にその下流にはスプリッタ２０を介して質量分析計２２が接続されている。分析用カラム１６からの溶出液の量によってはスプリッタを備えないで質量分析計２２に直接供給するものであってもよい。
六方バルブ４のさらに他の１つのポートは前処理カラム２から流出する液をドレインに排出する排出用ポートである。

図１の実施例において、まず六方バルブ４を図示の流路に設定し、ポンプ６からトラップ用移動相を供給し、オートサンプラ８から分析対象試料、例えば血漿を注入する。注入された試料は前処理カラム２を通り、試料中のタンパク質は排出用ポートからドレインへ排出され、ペプチドが前処理カラム２に捕捉される。

その後、六方バルブ４を切り替える。ポンプ１０,１２を作動させ、ミキサー４で混合した分析用移動相を六方バルブ４から前処理カラム２に供給し、前処理カラム２に捕捉されていたペプチドを溶出して六方バルブ４から分析用カラム１６に導入する。分析用カラム１６では供給された溶液中のペプチドを夾雑物から分離し、溶出してＵＶ検出器１８と質量分析計２２に導き、定性と定量を行なう。

検出計としては、実施例ではＵＶ検出器１８と質量分析計２２を備えているが、ＵＶ検出器１８だけでもよく、あるいは質量分析計２２だけでもよい。
また、実施例では分析用カラム１６を備えているが、分析用カラム１６を省略し、前処理カラム２で捕捉されたペプチドを質量分析計２２に直接導入するようにしてもよい。
さらに、質量分析計２２としてはＭＳ／ＭＳ（タンデム質量分析法）を用いてもよい。

次に、この実施例における実測結果を示す。
前処理：
試料マトリクスとしてＳＤラット血漿を使用し、モデルペプチドとしてアンジオテンシンＩ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社の製品；ＵＳＡ）を使用した。
試料調製は次のように行なった。
（ブランク血漿）：ＳＤラット血漿を、０．４ｍｏｌ／Ｌのグアニジンと５ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡを含む水にて２倍希釈し、ブランク血漿とした。
（試料溶液）：ブランク血漿にアンジオテンシンＩを添加し、試料溶液（濃度：３０・ｇ／ｍＬ）とした。
（標準液）：アンジオテンシンＩ（濃度：３０・ｇ／ｍＬ）を含む５０％アセトニトリルを標準液とした。

前処理カラムとして、Shim-pack ＭＡＹＩ−ＯＤＳ（株式会社島津製作所の製品）で、内径が４．６ｍｍ、長さが１０ｍｍのものを使用し、カラム温度を３５℃に保った。前処理カラムの充填材の細孔径は約１２ｎｍである。
トラップ用移動相は酢酸アンモニウム（２０ｍｍｏｌ／Ｌ）：アセトニトリル＝９５：５（ｖ／ｖ）の溶液を流速３ｍＬ／ｍｉｎで２分間供給した。試料注入量は１００・Ｌであった。

分析：
分析用カラムとして前処理カラムと同じ充填材が充填されたＭＡＹＩ−ＯＤＳ（株式会社島津製作所の製品）であるが、内径が２．０ｍｍ、長さが１５０ｍｍのものを使用、カラム温度を３５℃に保った。
分析用移動相として以下の２種類の溶液を用意し、その混合割合を時間とともに変化させてグラジエント分析を行なった。
（Ａ）ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸；０．１％）：アセトニトリル＝９９：１（ｖ／ｖ）
（Ｂ）ＴＦＡ（０．１％）：アセトニトリル＝１：９９（ｖ／ｖ）

グラジエント条件は、（Ａ）液と（Ｂ）液の混合液中の（Ｂ）液の割合を、最初５％から初め、徐々に増やして３０分後には（Ｂ）液の割合が８０％になるようにした。分析用移動相の流速は０．２ｍＬ／ｍｉｎとした。
検出はＵＶ検出器１８を使用して波長２２０ｎｍで行なった。

その結果のクロマトグラムを図２に示す。１）はブランク血漿、２）はアンジオテンシンＩ標準液、３）はアンジオテンシンＩを添加した血漿試料である。
この結果によれば、アンジオテンシンＩは前処理カラム（ＭＡＹＩ−ＯＤＳ）２に保持濃縮され、血漿マトリクスから分離された。またアンジオテンシンピーク付近には、マトリクス由来の妨害ピークはなく、アンジオテンシンピークの特異性が確認された。

前処理カラムの充填材の細孔径としては、種々のものが入手できる。例えば、Kaseisorb ＬＣ ＯＤＳ（東京化成工業の製品）はオクタデシル基を化学結合したＯＤＳ充填剤であるが、その細孔径が６〜３０ｎｍの範囲のものが種々用意されている。

分析対象のペプチドに応じて適当な細孔径の充填材を選択して使用することができる。
また、図１の前処理カラム２の位置に細孔径の異なる充填材を充填した複数の前処理カラムを互いに並列に接続し、切替えバルブによりいずれかを選択できるようにしてもよい。その場合は、分析対象のペプチドに応じて最適な細孔径の充填材をもつ前処理カラムを選択できるようになる。

本発明は、血漿、血清、尿などタンパク質を含有する生体試料中のペプチドを測定するのに利用することができる。

一実施例を示す流路図である。 同実施例における分析結果を示すクロマトグラムである。

符号の説明

２ 前処理カラム
４ 六方バルブ
６，１０，１２ 送液ポンプ
８ 試料注入用オートサンプラ
１６ 分析用カラム
１８ ＵＶ検出器
２２ 質量分析計

Claims (8)

1. 表面にタンパク質は入り込めず分析対象のペプチドが入り込める大きさの細孔をもつ細孔性担体の外表面がタンパク質に対して不活性になる処理が施され、細孔内部のみにペプチド分子に対して吸着性をもつ反応基を化学修飾した充填材が充填されたカラムを前処理カラムとして用い、タンパク質含有試料をトラップ用移動相により前記前処理カラムに通してその試料中のペプチド分子を捕捉し、タンパク質を排出させる分離ステップと、
   前記分離ステップで前記前処理カラムに捕捉されたペプチド分子を分析用移動相により溶出させ分析計に導いて分析するステップと、を備えたことを特徴とするペプチド分析方法。
2. 前記担体はシリカゲル、セルロース、アガロース又は合成ポリマーである請求項１に記載のペプチド分析方法。
3. 前記前処理カラムとして担体の細孔が２〜３０ｎｍの範囲で分析対象のペプチドの分子量に応じて設定されたものを使用する請求項１又は２に記載のペプチド分析方法。
4. 前記前処理カラムとして担体の細孔が２〜３０ｎｍの範囲で互いに異なる大きさに設定されたものを複数本用意して流路に切替え可能に接続しておき、分析対象のペプチドの分子量に応じて最適なカラムを選択する請求項１又は２に記載のペプチド分析方法。
5. ペプチド分子に対して吸着性をもつ前記反応基はオクタデシル基、スルフォン基又は４級アミノ基である請求項１から４のいずれかに記載のペプチド分析方法。
6. タンパク質に対して不活性になるようにする担体の外表面処理は親水性ポリマーによるコーティングである請求項１から５のいずれかに記載のペプチド分析方法。
7. 前記親水性ポリマーはメチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン又はヘキサジメチリンブロマイドである請求項６に記載のペプチド分析方法。
8. 請求項１，２，５，６又は７に記載された前処理カラムを備えた前処理部と、
   試料をトラップ用移動相により供給する試料導入部と、
   前記前処理カラムに捕捉されたペプチドを溶出させる分析用移動相を供給する分析用移動相供給部と、
   前記前処理カラムから分析用移動相により溶出されたペプチドを検出する分析計と、
   前記試料導入部を前記前処理カラムに接続する分離用流路及び前記分析用移動相供給部を前記前処理カラムに接続しその前処理カラムからの溶出液を前記分析計に導く分析用流路の間で切り替える流路切替え部と、を備えたことを特徴とするペプチド分析装置。

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