JP2020516901A - 検出方法および検出装置 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明の第2の態様によると、第1の態様の検出方法において、前記レニンのタンパク質分解の生成物はアンジオテンシンIであり、前記レニンのタンパク質分解の前記二次生成物はアンジオテンシンIIであることが好ましい。
本発明の第3の態様によると、第1または第2の態様の検出方法において、前記試料は、血漿または血清から調製されることが好ましい。
本発明の第4の態様によると、第1から第3までのいずれかの態様の検出方法において、前記液体クロマトグラフに前記試料が導入される前に、前記試料をオクタデシルシリルカラムに導入することをさらに備えることが好ましい。
本発明の第5の態様によると、第1から第4までのいずれかの態様の検出方法において、前記オクタデシルシリルカラムから出力される前記試料は、オンライン制御により前記液体クロマトグラフに導入されることが好ましい。
本発明の第6の態様によると、第1から第5までのいずれかの態様の検出方法において、アルドステロン、前記レニンのタンパク質分解の生成物、および、前記二次生成物が同時並行して検出され、前記方法は、前記試料に、前記レニンのタンパク質分解の生成物の第1内部標準を加えることと、前記試料に、前記レニンのタンパク質分解の前記二次生成物の第2内部標準を加えることとをさらに備え、前記第1内部標準は、分解された第1内部標準と前記第2内部標準とを分離して検出可能に設計されることが好ましい。
本発明の第7の態様によると、第6の態様の検出方法において、前記レニンのタンパク質分解の生成物は、アンジオテンシンIであり、前記レニンのタンパク質分解の前記二次生成物は、アンジオテンシンIの切断型であり、アンジオテンシンIの前記切断型に対応する前記第1内部標準の一部と、前記第2内部標準は安定同位体により異なって標識されることが好ましい。
本発明の第8の態様によると、第1から第7までのいずれかの態様の検出方法において、アルドステロン、および前記レニンのタンパク質分解の生成物、および/または前記レニンのタンパク質分解の前記二次生成物の検出量に基づいて、アルドステロン/レニン比を算出することをさらに備えることが好ましい。
本発明の第9の態様によると、第1から第8までのいずれかの態様の検出方法において、前記レニンのタンパク質分解の生成物は、アンジオテンシンIであり、前記方法は、 アンジオテンシンIのイオン化と、アルドステロンのイオン化との間に、正イオンモードから負イオンモードへとイオン化のモードを切り替えることをさらに備えることが好ましい。
本発明の第10の態様によると、検出装置は、アルドステロン、およびレニンのタンパク質分解の生成物、および/または前記レニンのタンパク質分解の二次生成物を含む試料が導入される入力部と、液体クロマトグラフと、前記試料における、アルドステロン、および前記レニンのタンパク質分解の生成物、および/または前記レニンのタンパク質分解の前記二次生成物を同時並行して検出する質量分析計とを備える。
本発明の第11の態様によると、第10の態様の検出装置において、前記液体クロマトグラフに接続されたオクタデシルシリルカラムであって、アルドステロン、および前記レニンのタンパク質分解の生成物、および/または前記レニンのタンパク質分解の前記二次生成物をオンライン方式で抽出する前記カラムを備えることが好ましい。
本発明の第12の態様によると、第10または第11の態様の検出装置において、アルドステロン、および前記レニンのタンパク質分解の生成物、および/または前記レニンのタンパク質分解の前記二次生成物の検出量に基づいて、アルドステロン/レニン比を算出する算出部と、前記算出部により算出された前記アルドステロン/レニン比を送信する送信部とをさらに備えることが好ましい。
本発明の第13の態様によると、第12の態様の検出装置において、前記アルドステロン/レニン比を出力する出力部をさらに備えることが好ましい。
本発明の第14の態様によると、第13の態様の検出装置において、前記出力部は、アルドステロン、および前記レニンのタンパク質分解の生成物、および/または前記レニンのタンパク質分解の前記二次生成物の量を、前記アルドステロン/レニン比と共に出力することが好ましい。
以下、図を参照して本発明の検出方法の第1実施形態を説明する。本実施形態の検出方法では、試料における、アルドステロン、およびレニンのタンパク質分解の生成物、および/または当該レニンのタンパク質分解の二次生成物が液体クロマトグラフおよび質量分析計を用いて同時並行して検出される。以下では、本実施形態の検出方法に係る検出装置が図に示される。なお、本実施形態の検出方法に用いられる検出装置の構成は、当該装置によりアルドステロン、およびレニンのタンパク質分解の生成物、および/または当該レニンのタンパク質分解の二次生成物(以下では、「アルドステロン、およびレニンのタンパク質分解の生成物、および/または当該レニンのタンパク質分解の二次生成物」は「ARR関連分子」と呼ぶ)の同時並行の測定が可能であれば限定されない。
(1)本実施形態の検出方法は、単一の試料における、アルドステロン、およびレニンのタンパク質分解の生成物、および/または当該レニンのタンパク質分解の二次生成物(ARR関連分子)を、液体クロマトグラフ20および質量分析計30を用いて同時並行して検出することを備える。これにより、これらのARR関連分子を別々の試料を用いて測定した場合と比較して、これらのARR関連分子のより精密な測定を行うことができる。
以下に、本発明の検出方法の第2の実施形態が説明される。本実施形態の検出方法において、前処理としてオンライン固相抽出が行われる。本実施形態の検出装置の構成は、検出装置100と類似しているが、オンライン方式による固相抽出カラム等が追加されている点が異なっている。構成において第1実施形態と同一の部分は同一の参照符号で参照し、関連する説明は適宜省略される。
(1)本実施形態の検出方法は、試料が液体クロマトグラフ20に導入される前に、試料をオクタデシルシリルカラム14に導入することを備える。これにより、ARR関連分子の測定の精度を高めることができる。
試料の調製
3つのレベルの既知のレニン活性と既知のアルドステロン活性を有する血清試料をバイオ・ラッド ラボラトリーズ株式会社から購入した。1つの試料は低温で保管し、参照(t0)として用い、他はレニンが活性を有する温度で3時間インキュベーションした。試料は2体積のアセトニトリル(ACN)を用いてタンパク質沈殿により抽出し、蒸発と再構成に供した。オンライン固相抽出は行わなかった。
調製された試料は、超高速液体クロマトグラフ(UHPLC)および多重反応モニタリング(MRM)モードのトリプル四重極質量分析計(トリプルQMS)を用いてLC/MS/MS測定に供した。
システム:Nexera X2(島津製作所)
カラム:Shim−Pack GIST(島津ジーエルシー)(オクタデシルシリルカラム、粒径;2μm、カラムの長さ;50mm、内径;2.1mm)
カラム温度:50℃
移動相:
(A)水+0.01% ギ酸
(B)メタノール
流速:0.4mL/分
グラジエント:
5%B(0−0.5分)、50%B(2分)、60%B(3分)、95%B(3.5−4分)、5%B(4.1分)
総測定時間(total run time):7(分)
ニードルのリンス(Needle Rinse):
R3(MeOH/ACN/イソプロピルアルコール(IPA)/HCOOH:33/33/33/1)
R1(水/ACN:9/1)
オートサンプラー温度:+5℃
注入量:15μL
システム:加熱ESI(Heated ESI)を備えるLCMS−8060(島津製作所)
取得モード:MRM
温度:
脱溶媒管(Desolvation Line;DL)温度: 150℃
ヒートブロック温度: 300℃
インターフェイス温度: 400℃
ガス流量:
ネブライザー; 3L/分
ドライング; 5L/分
ヒーティング; 15L/分
CID; 300kPa
インターフェイス電圧:+/− 1.5kV
正イオンモードのESIに関する分子のMRMトランジション
アンジオテンシンI; 433.0>647.2 433.0>619.3
13C11,15N2−アンジオテンシンI;437.3>660.4
アンジオテンシンII;524.2>263.1
13C6,15N1−アンジオテンシンII;527.2>110.3(1)
13C11,15N2−アンジオテンシンII;530.6>110.3(2)
負イオンモードのESIに関する分子のMRMトランジション
アルドステロン;359.4>331.4 359.4>189.3
2H7−アルドステロン;365.2>194.3
ウシ血清アルブミン/緩衝液に所定の量のアンジオテンシンIおよびアルドステロンを加え、アンジオテンシンIおよびアルドステロンの標準濃度溶液を得た。LC/MS/MS測定を行い、標準溶液の濃度と、測定された面積比との間の関係を導出した(アンジオテンシンIのピーク面積/その内部標準のピーク面積、および、アルドステロンのピーク面積/その内部標準のピーク面積)。
測定された血漿レニン活性およびアルドステロン濃度は以下に示される。測定値は8回の測定の平均値である。製造者により提供された参照値は異なる方法(免疫アッセイ)により得られたものであった。
参照PRA(ng/mL/hr) 測定PRA(ng/mL/hr) 精度
1.80 1.72 95.7%
5.60 5.25 93.7%
28.5 20.7 72.5%
参照濃度(pg/mL) 測定濃度(pg/mL) 精度
39.0 39.3 101%
86.0 101 118%
420 421 100%
試料の調製
インキュベーションでは、試料は37℃に保持し穏やかに1時間撹拌した。試料を、1体積のアセトンを用いてタンパク質沈殿により抽出し、オンラインSPE−UHPLC−MS/MSに供した。0.2M EDTAならびに、阻害剤であるSBTI(大豆トリプシン阻害剤)およびPMSF(フッ化フェニルメタンスルホニル(Phenylmethanesulfonylfluoride))を用いてアンジオテンシンIの分解を停止させた。実施例2で用いたオンライン固相カラムはガードカラムGISS C−18(島津ジーエルシー)(オクタデシルシリルカラム、粒径;3μm、カラムの長さ;10mm、内径;2.1mm)であり、その充填剤は実施例2で用いたUHPLCカラムの疎水性よりも低い疎水性を有していた。その他のオンラインSPE条件は以下の通りである:
カラム温度:50℃
移動相:
(A;投入する際の相)水/メタノール 90/10(v/v)+0.01% ギ酸(v/v)
(B;洗浄する際の相)アセトニトリル/イソプロパノール 1/1 (v/v)
流速: 1.5mL/分
注入量:15μL
UHPLCとMS/MSについては、実施例1と同様のシステムを用いた。
本発明の第2の態様は、アルドステロン、レニンによるタンパク質分解の生成物、および前記レニンによるタンパク質分解の二次生成物を含む試料が導入される入力部と、液体クロマトグラフと、前記試料における、アルドステロン、前記レニンによるタンパク質分解の生成物、および前記レニンによるタンパク質分解の前記二次生成物を同時並行して検出する質量分析計とを備える検出装置に関する。
Claims (14)
- 試料における、アルドステロン、およびレニンのタンパク質分解の生成物、および/または前記レニンのタンパク質分解の二次生成物を、液体クロマトグラフと質量分析計とを用い同時並行して検出することを備える検出方法。
- 請求項1に記載の方法において、
前記レニンのタンパク質分解の生成物はアンジオテンシンIであり、
前記レニンのタンパク質分解の前記二次生成物はアンジオテンシンIIである検出方法。 - 請求項1または2に記載の方法において、
前記試料は、血漿または血清から調製される検出方法。 - 請求項1から3までのいずれか一項に記載の方法において、
前記液体クロマトグラフに前記試料が導入される前に、前記試料をオクタデシルシリルカラムに導入することをさらに備える検出方法。 - 請求項4に記載の方法において、
前記オクタデシルシリルカラムから出力される前記試料は、オンライン制御により前記液体クロマトグラフに導入される検出方法。 - 請求項1から5までのいずれか一項に記載の方法において、
アルドステロン、前記レニンのタンパク質分解の生成物、および、前記二次生成物が同時並行して検出され、
前記方法は、
前記試料に、前記レニンのタンパク質分解の生成物の第1内部標準を加えることと、
前記試料に、前記レニンのタンパク質分解の前記二次生成物の第2内部標準を加えることとをさらに備え、
前記第1内部標準は、分解された第1内部標準と前記第2内部標準とを分離して検出可能に設計される検出方法。 - 請求項6に記載の方法において、
前記レニンのタンパク質分解の生成物は、アンジオテンシンIであり、
前記レニンのタンパク質分解の前記二次生成物は、アンジオテンシンIの切断型であり、
アンジオテンシンIの前記切断型に対応する前記第1内部標準の一部と、前記第2内部標準は安定同位体により異なって標識される検出方法。 - 請求項1から7までのいずれか一項に記載の方法において、
アルドステロン、および前記レニンのタンパク質分解の生成物、および/または前記レニンのタンパク質分解の前記二次生成物の検出量に基づいて、アルドステロン/レニン比を算出することをさらに備える検出方法。 - 請求項1から8までのいずれか一項に記載の方法において、
前記レニンのタンパク質分解の生成物は、アンジオテンシンIであり、
前記方法は、
アンジオテンシンIのイオン化と、アルドステロンのイオン化との間に、正イオンモードから負イオンモードへとイオン化のモードを切り替えることをさらに備える検出方法。 - アルドステロン、およびレニンのタンパク質分解の生成物、および/または前記レニンのタンパク質分解の二次生成物を含む試料が導入される入力部と、
液体クロマトグラフと、
前記試料における、アルドステロン、および前記レニンのタンパク質分解の生成物、および/または前記レニンのタンパク質分解の前記二次生成物を同時並行して検出する質量分析計とを備える検出装置。 - 請求項10に記載の検出装置において、
前記液体クロマトグラフに接続されたオクタデシルシリルカラムであって、アルドステロン、および前記レニンのタンパク質分解の生成物、および/または前記レニンのタンパク質分解の前記二次生成物をオンライン方式で抽出する前記カラムを備える検出装置。 - 請求項10または11に記載の検出装置において、
アルドステロン、および前記レニンのタンパク質分解の生成物、および/または前記レニンのタンパク質分解の前記二次生成物の検出量に基づいて、アルドステロン/レニン比を算出する算出部と、
前記算出部により算出された前記アルドステロン/レニン比を送信する送信部とをさらに備える検出装置。 - 請求項12に記載の検出装置において、
前記アルドステロン/レニン比を出力する出力部をさらに備える検出装置。 - 請求項13に記載の検出装置において、
前記出力部は、アルドステロン、および前記レニンのタンパク質分解の生成物、および/または前記レニンのタンパク質分解の前記二次生成物の量を、前記アルドステロン/レニン比と共に出力する検出装置。
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