JP6773446B2 - ２次元液体クロマトグラフ分析装置および分析法 - Google Patents

Description

本発明は、液体クロマトグラフに関し、特に、複数の分離カラムを有する２次元液体クロマトグラフ分析装置および分析法に関する。

液体クロマトグラフは、移動相を送液しながら試料の目的成分を分離カラムで分離し、分離された順に流れてくる成分を分光光度計等の検出器で検出して、試料の成分を分析する装置である。

液体クロマトグラフには、試料中のイオン性成分、親水性成分、疎水性成分などを分離するため、イオン交換モード、順相モード、逆相モードなどの様々な分離モードの分離カラムが使用されており、分離モードにより移動相の種類が異なる。

移動相には、分離の向上や分析時間の短縮化のため、二種類以上の移動相の混合比率を変化させながら送液するグラジエント溶離が一般的に用いられている。

一方、分離カラムの温度を変化させることで分離の向上や分析時間の短縮化を行う方法も知られている。たとえば、代表的な逆相系分離カラムとして官能基にオクタデシルシリル（ＯＤＳ）基を使用する逆相クロマトグラフでは、分離カラムの温度が高くなると、溶出が早くなることが一般的に知られている。

また、特許文献１には、表面に０〜８０℃の温度範囲内で水和力が変化するポリマーを被覆した充填剤を分離カラムとして用い、分離カラムの温度制御を行うことで目的成分を分離し、測定する簡便な薬物代謝能評価システムが報告されている。

しかしながら、液体クロマトグラフを用いて血清等の生体試料中の成分を分析する場合、生体試料中には複数の成分が混在しており、１つのカラムでは分離が不十分あるいは分析に長時間を要することがある。

特許文献１では生体試料を固相抽出用のカラムを用いて前処理した後、目的成分を分離カラムで分析している。
具体的な分離の方法としては、流路切り替えバルブを用い、２種類の異なる分離モードのカラムを組み合わせて、１つ目（１次元目）の分離カラムで分離した目的成分を分画し、その後、２つ目（２次元目）のカラムに導入し、さらに分離する２次元液体クロマトグラフ分析法方法が使用されている。

２次元液体クロマトグラフィーでは１次元目のカラムとしてイオン交換系カラムを用い、２次元目に逆相系カラムを用いて分析を行うことが一般的である。

１次元目のイオン交換系のカラムでは移動相の緩衝液の塩濃度あるいはｐＨにより目的成分の分離を行い、分離された目的成分を２次元目の逆相カラムへ導入する。２次元目の逆相系カラムでは有機溶媒を含む移動相を用いてさらに分離を行う。

１次元目の分離と２次元目の分離を実施する２次元液体クロマトグラフ分析装置の例としては、特許文献２に記載されている。
特許文献２に記載された技術は、系内の移動相の置換を効率よく行うために、１次元目で分離された成分を一旦トラップカラムで捕捉、濃縮し、トラップカラムで補足された成分を２次元目でさらに分離し分析するというものである。その構成として、トラップカラムを最少の３つとして幾らの成分でも分析できる２次元液体クロマトグラフが報告されている。

特許文献２は、試料注入部から注入された試料を分離用移動相により分離カラムに導いて分離する１次元目分離流路と、３つのトラップカラムと、分析用移動相を供給する分析用移動相流路と、トラップカラムに捕捉された成分を分析用移動相により分析カラムに導いて分析する２次元目分析流路と、脱塩用移動相を供給する脱塩用移動相流路と、一のトラップカラムに１次元目分離流路を接続し、他の一のトラップカラムに脱塩用移動相流路を接続し、さらに他の一のトラップカラムに１次元目分析流路を接続するとともに、トラップカラムとそれらの流路との接続を切り替える流路切替え機構とを備え、流路切替え機構は、３つのトラップカラムの一端と他端が接続される第１及び第２の２ポジションバルブと、１次元目分離流路、脱塩用移動相流路、分析用移動相流路が接続されるとともに一端が第１の２ポジションバルブと接続される３つの流路の他端が接続される第３の２ポジションバルブと、一端が第２の２ポジションバルブと接続される３つの流路の他端及び２次元目分析流路が接続される第４の２ポジションバルブとからなることを特徴とする２次元液体クロマトグラフである。
３つのトラップカラムが独立して動作を行なうことができるようにバルブにより流路が接続されている。一のトラップカラムで濃縮、他の一のトラップカラムで脱塩、さらに他の一のトラップカラムで溶出が同時に行なわれるように流路が接続されることで、バルブにより濃縮動作、脱塩動作及び溶出動作をそれぞれ異なるトラップカラムで同時に進めていくので、３つのトラップカラムで成分の数に制限されることなく２次元目の分析を続けていくことが可能である。

特許第５３６２９４３号 特開２００８−９６４５５

一般的な２次元液体クロマトグラフでは、１次元目のイオン交換系のカラムの移動相に緩衝液を用いている。

イオン交換系のカラムでは移動相に緩衝液を用い、緩衝液のイオン強度（塩濃度）を高めるか、あるいはｐＨを変えて目的成分を分離する。そのため、イオン交換系のカラムでは二種類以上の移動相の混合比率を変化させながら送液するグラジエント溶離が用いられている。

この緩衝液と２次元目の逆相系カラムの移動相に含まれる有機溶媒との混和により塩が析出し、配管や２次元目の逆相系カラムに詰りを生じさせてしまう。この詰りを防止するために、脱塩用の移動相を通液するためのトラップカラムが必要となり、トラップカラム用の切替バルブなどを設けることにより、システム構成が複雑化するという課題がある。

本発明は塩の析出を防止することにより、脱塩用の移動相を通液するためのシステムを不要とした簡易な構成で、生体などの試料中の目的成分の高感度分析を行うことができる２次元液体クロマトグラフ分析装置および分析方法を提供する。

本発明の２次元液体クロマトグラフは次のように構成される。

移動相を送液する送液部と、試料を注入する注入部と、複数の分離カラムと、分離カラムの温度を制御する温度制御部と、分離された成分を検出する検出部と、を有する液体クロマトグラフ分析装置において、複数の成分を含む試料を分離、分画する第１分離カラムと、分画された成分を分離する第２分離カラムと、第２分離カラムで分離した目的成分を検出する検出器と、を有する２次元液体クロマトグラフ分析装置であって、
温度制御部は、一定の設定温度から別の一定の設定温度に切り替わる過渡期間を短縮し、かつ高速に切替え、分離カラムの温度を設定した温度に変化することができるよう、分離カラムの周囲に分離カラムの外周を被う熱伝導率の良い金属製のホルダーを設けている。ホルダーの内部構造は分離カラムの外部構造に合わせており、ホルダーが分離カラムに密着して保持している。
温度制御部は、ペルチェ素子により温度制御されるヒートブロックを設けており、ペルチェ素子により、ホルダーの温度制御を行う。

第１分離カラムは温度の変調により表面の性質が親水性・疎水性に可逆的に変化する機能性高分子層を有する温度応答性ゲル修飾カラムもしくは水系１００％の移動相を送液することが可能な逆相系のカラムであり、第２分離カラムは逆相系のカラムであることを特徴とする。

また、本発明の２次元液体クロマトグラフ分析方法において、第１分離カラムに通液する移動相は水系の移動相であり、更に第１分離カラムに通液する移動相は目的成分の分離、分画をするときに組成を変更しないことを特徴とする。
本装置を用いることにより、生体試料などの成分を簡易なシステムで分析することが可能となる。

１次元目の第１分離カラムに温度応答性ゲル修飾分離カラムを採用することにより、水系移動相のみで血清などの生体試料中の主要夾雑成分と薬物群とを分離可能である。

前記温度応答性ゲル修飾分離カラムは、温度制御によって１次元目の第１分離カラムにおける薬物の溶出時間をコントロールすることが可能である。前記温度応答性ゲル修飾分離カラムを使用することにより、複数の薬物を同時に分析する際、温度変調によって薬物群の溶出時間を制御し、任意の薬物を２次元目の第２分離カラムに導入することができる。

１次元目の第１分離カラムの移動相は一定組成の水系移動相であり、２次元目のカラムへの導入時に有機溶媒を含む第２分離カラムの移動相との混和により塩が析出する緩衝液を必要としない。このため、脱塩用の移動相を通液する必要がなく、トラップカラムや切替バルブなどが不要となり、システム構成が簡易になる。簡易なシステム構成により、操作性及び保守性も向上する。

次に、水系移動相が目的成分とともに２次元目の第２分離カラムに導入される。第２分離カラムは逆相系カラムであり、目的成分は２次元目の第２分離カラムからすぐに溶出せず、第２分離カラム内にとどまる。
第２分離カラムの移動相には有機溶媒と水系移動相のグラジエント溶離が用いられる。

第２分離カラムにとどまった目的成分はカラム内で一旦収束され、第２分離カラムの移動相に含まれる有機溶媒により溶出されるため、溶出された目的成分のピークはシャープに検出される。
これにより、２次元目のクロマトグラムにおいては、目的成分のピークはシャープになり高感度分析が可能である。

液体クロマトグラフ分析装置の概略構成図 温度制御部構造図 温度設定と溶出時間の関係を示すグラフ 液体クロマトグラフ分析装置により濃縮効果を示すクロマトグラム 液体クロマトグラフ分析装置により血清中の薬物を分析したクロマトグラム 一定の設定温度から別の一定の設定温度に変化させる温度曲線を示すグラフ

以下、本発明の実施形態を図１〜５を参照して説明する。
図１は、本発明の第１の実施形態である２次元液体クロマトグラフ分析装置の概略構成図である。

２次元液体クロマトグラフ装置は、溶出液を送液するためのポンプ１，２と、試料を系に注入する試料注入装置５と、系に送られた試料を分離するための分離カラム３，４と、分離カラムの温度を制御する温度制御部６，７と、分離カラム３，４により分離された試料成分を検出する検出器８，９と、各流路を接続・分離するバルブ１０とを備えている。

２次元液体クロマトグラフ装置に於いて、ポンプ（ａ）１は、溶出液容器１１から溶出液Ａ１１ａを、試料注入装置５に送液する。試料注入装置５は、ポンプ１からの溶出液Ａ１１ａとともに試料を流路に注入する。
流路に注入された試料中の成分は、分離カラム（第１分離カラム）３に送られ、この分離カラム３との相互作用の小さい順に流路２１に溶出される。
分離カラム３，４は、温度制御部（Ａ）６、（Ｂ）７により、分離に適切な設定温度に制御されている。

流路２１に溶出された試料中の成分は、六方バルブ１０と流路２２を介して、検出器（ａ）８に送られ、夾雑成分のみが廃液として流路２６から排出される。夾雑成分の分離が完了すると、分離カラム３からの流路２１は、六方バルブ１０を介して流路２３に接続される。この時、ポンプ（ｂ）２により、溶出液容器１２、１３から溶出液Ｂ（１２ａ、１３ａ）が流路２４、六方バルブ１０を介して、流路２３に送液され、分離カラム３からの試料を含む溶出液Ａ１１ａと共に分離カラム（第２分離カラム）４に送液される。
分離カラム４で分離された成分は、分離カラム４との相互作用の小さい順に溶出され、検出器（ｂ）９により、各成分の測定が行われる。

六方バルブ１０による流路２１から２２の経路が、流路２１から２３の経路に切り替わるタイミングは、予め夾雑成分の溶出時間を求めて決められ、測定時にはその時間を元に流路の切替が設定される。

溶出液Ｂ（１２ａ、１３ａ）はポンプ２により送液されるが、分離カラム３からの試料溶液を分離カラム４に送液する流路２１と流路２３が接続されている以外の時間帯は、六方バルブ１０により、流路２４と流路２５が接続され廃液として排出される。

分離カラム３および４はそれぞれ温度制御部（Ａ）６、（Ｂ）７に設置されており、分離カラム３の温度制御部６は分離カラム３を設定した温度に切り替えることができるよう、分離カラム３の周囲にホルダー６ａを設けて分離カラム３を保持している。ホルダー６ａは熱伝導率の良いアルミニウム合金、銅合金等の金属製等であり、分離カラム３の外形に合わせており、分離カラム３を密着して保持する構成となっている。

分離カラム３には、ゲル修飾法を用いてシリカゲルビーズ表面にポリＮ−イソプロピルアクリルアミド（ＰＮＩＰＡＡｍ）層およびＰＮＩＰＡＡｍ鎖に疎水性コモノマーであるメタクリル酸ブチル（ＢＭＡ）を導入した高分子層をもつ温度応答性ゲル修飾カラムを用いる。
分離カラム３の温度応答性ゲル修飾カラムの高分子層の表面は、温度変化によって表面の高分子鎖の構造を変化させることにより、親水性・疎水性変化が起こる。

分離カラム３は温度制御部６により、温度応答性ゲル修飾カラムの高分子層表面の高分子鎖の構造が変化することにより親水性・疎水性の特性が変化し、溶出液との相互作用による目的成分の分離に適した温度に設定される。
温度制御部６は、熱源としてペルチェ素子により温度制御されるヒートブロック６ｂを設けている。ヒートブロック６ｂの温度をホルダー６ａに直接伝達し、分離カラム３の温度制御を行うことにより設定温度に短時間で到達させる構造となっている。
一般的な液体クロマトグラフでは、一定の設定温度から別の一定の設定温度に切り替得る場合の温度の変化は図５の曲線Ｂのように上昇して過渡期間必要となり、また設定温度に安定するまでの数分程度の待機時間経過後に測定を始めることでリテンションタイムの再現性を維持しているが、前記構造の温度制御部６では、温度変化を示す曲線は図５Ａに示すような急角度で温度変化し、過渡時間も短く設定温度での安定も早い。本発明の温度制御部６では、例えば室温から約４分で４０℃に到達する。温度制御部６の設定温度範囲は前記の温度範囲に限らない。

あるいは、分離カラム３は温度応答性ゲル修飾カラムの高分子層の表面に、測定試料中の特定物を吸着させ、一定時間後に温度を変調し、温度応答性ゲル修飾カラムの高分子層表面の特性を変化させることで、その特定物を遊離させるために適切な温度変調を行うように温度制御部６により温度設定および変調される。

図２は分離カラム３の温度を変調させた場合のバルビタール系薬物の保持時間である。任意の時間に分離カラム３の温度を高温から低温に変化させることで、温度応答性ゲル修飾カラムの高分子層の表面を疎水性から親水性にすることで、目的成分の保持時間を変化させ、分離・分画することが可能である。

分離カラム４はオクタデシルシリル（ＯＤＳ）基を代表とする逆相クロマトグラフィーで用いられる逆相系分離カラムである。
分離カラム４に送液される溶出液Ｂ（１２ａ、，１３ａ）は溶出液Ａ１１ａもしくは溶出液Ａ１１ａに有機溶媒（一般的に液体クロマトグラフで用いられるメタノール、アセトニトリル、テトラヒドロフランなど）を含んでもよい。また、分離カラム４に通液する溶出液Ｂ（１２ａおよび１３ａ）は一定の組成ではなく、分析時間により、その組成を変化させるグラジエント溶離を行ってもよい。

逆相系カラムは目的成分と溶出液との疎水性相互作用により分離する。より具体的には、溶出液中の有機溶媒の比率が高くなれば、目的成分の溶出時間は短縮され、溶出液中の有機溶媒の比率が低くなれば、目的成分は逆相カラム内にとどまり、濃縮される。
分離カラム４は六方バルブ１０と接続され、一定時間毎に分離カラム３により溶出された成分が溶出液Ａ １１ａとともに供給される。
分離カラム３に送液される溶出液Ａ１１ａは水系の移動相である。
分離カラム４に供給された成分は溶出液Ａ１１ａが水系の移動相であることから分離カラム４にとどまり、濃縮される。

六方バルブ１０は分離カラム３により溶出された成分が溶出液Ａ１１ａとともに分離カラム４に供給された後、切り替わり、分離カラム４には溶出液Ｂ（１２ａ、１３ａ）を供給する。

溶出液Ｂ（１２ａ、１３ａ）には有機溶媒が含まれている。分離カラム４で濃縮された目的成分は六方バルブ１０切り替え後、有機溶媒を含む溶出液Ｂ（１２ａ、１３ａ）により、速やかに溶出されることから、検出されるピークはよりシャープになる。

図３は液体クロマトグラフ分析装置により濃縮効果を示すクロマトグラムである。１次元目の分離カラムで分離したピークが、２次元目の分離カラムでは濃縮効果によりシャープになっている。

一方、溶出液Ａ１１ａは一定組成の水系溶媒であり、また、溶出液Ｂ（１２ａ，１３ａ）は溶出液Ａ１１ａもしくは溶出液Ａ１１ａに有機溶媒を含んだ溶媒である。溶出液Ａ１１ａは六方バルブ１０切り替え後、液体クロマトグラフ分析装置の配管および分離カラム４で、溶出液Ｂ（１２ａ、１３ａ）と接した時に塩が析出することはない。

図４はサンプルとして、フェノバルビタール、シクロバルビタール、ペントバルビタールを含む血清を実施例に示す液体クロマトグラフ分析装置および分析方法により分析したクロマトグラムである。直接注入された試料は１次元目で夾雑物であるタンパクが除去され、２次元目において薬物の明確な分離が行われている。

測定条件
サンプル：向精神薬のフェノバルビタール、シクロバルビタールおよびペントバルビタールをテトラヒドロフラン溶液にしたものを標品とした。
標品を窒素乾固し、凍結乾燥プール血清に再溶解したものをサンプルとした。
＜一次元目＞
前処理カラム：Ｐ（ＮＩＰＡＡｍ−ｃｏ−ＢＭＡ５％）ゲル修飾カラム（４．６ｍｍＩ．Ｄ．×１５０ｍｍＬ）
移動相：１０ｍＭ 酢酸アンモニウム（ｐＨ６．５）
流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
検出波長：２２０ｎｍ
注入量：１０μＬ
＜二次元目＞
分離カラム：ＬａＣｈｒｏｍ ＩＩＣ１８（５μｍ）（４．６ｍｍＩ．Ｄ．×１５０ｍｍＬ），
移動相：アセトニトリル／１０ｍＭ 酢酸アンモニウム（ｐＨ６．５）＝７５／２５（ｖ／ｖ）
流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
検出波長：２００−４００ｎｍ
スイッチング時間：５．５〜９．２ｍｉｎ

なお、本発明では、分離カラム３に温度応答性ゲル修飾カラムを用いているが、これに限定するものではない。そのほかの部分も上述した実施形態に限定されるものではなく、適宜、変形、改良などが可能である。上述した実施形態における各構成要素の材質、形状、寸法、数値、形態、数、配置、などは本発明を達成できるものであれば任意であり、限定されない。

１：ポンプａ
２：ポンプｂ
３：分離カラム（第１分離カラム）
４：分離カラム（第２分離カラム）
５：試料導入装置
６：温度制御部Ａ
６ａ：ホルダー
６ｂ：ヒートブロック
７：温度制御部Ｂ
８：検出器ａ
９：検出器ｂ
１０：六方バルブ
１１：溶出液Ａ容器
１１ａ：溶出液Ａ
１２：溶出液Ｂ１容器
１２ａ：溶出液Ｂ１
１３：溶出液Ｂ２容器
１３ａ：溶出液Ｂ２
２１：流路（第１分離カラムから六方バルブ）
２２：流路（六方バルブから検出器ａ）
２３：流路（六方バルブから第２分離カラム）
２４：流路（ポンプｂから六方バルブ）
２５：流路（六方バルブから廃液）
２６：流路（検出器ａから廃液）

Claims (8)

1. 移動相を送液する送液部と、
   試料を注入する注入部と、
   複数の成分を含む試料を分離、分画する第１分離カラムと、
   分画された成分を分離する第２分離カラムと、
   前記第１分離カラムと前記第２分離カラムをそれぞれ保持するホルダと、
   前記第１分離カラムの温度を制御する第１温度制御部と、
   前記第２分離カラムの温度を制御する第２温度制御部と、
   前記第１温度制御部と前記第２温度制御部は熱源により温度制御される第１ヒートブロックと第２ヒートブロックをそれぞれ設けており、
   分離された成分を検出する検出部と、
   を有する液体クロマトグラフ分析装置において、
   前記第１温度制御部は、前記分離カラムに密着して設置されるホルダによって前記第１分離カラムを保持し、かつ、前記ヒートブロックの温度を前記ホルダに直接伝達することにより設定温度を切替え、
   前記第１分離カラムの温度を設定した温度に変化することができるように構成され、
   前記第１分離カラムは、温度の変調により表面の性質が親水性・疎水性に可逆的に変化する機能性高分子層を有する温度応答性ゲル修飾カラムもしくは水系１００％の移動相を送液することが可能な逆相系のカラムであり、
   前記第２分離カラムは逆相系のカラムである
   ことを特徴とする２次元液体クロマトグラフ分析装置。
2. 前記第１分離カラムは、高温から低温に変調することにより表面の性質が疎水性から親水性に変化する機能性高分子層を有する温度応答性ゲル修飾カラムであることを特徴とする、
   請求項１に記載の２次元液体クロマトグラフ分析装置。
3. 前記第１分離カラムに通液する移動相は水系の移動相であり、
   更に前記第１分離カラムに通液する移動相は目的成分の分離、分画をするときに組成を変更しないことを特徴とする、請求項１に記載の２次元液体クロマトグラフ分析装置。
4. 前記第１分離カラムに温度応答性ゲル修飾カラムを用い、
   前記第２分離カラムにオクタデシルシリル（ＯＤＳ）カラムなど逆相系のカラムを用いることを
   特長とする、請求項１に記載の２次元液体クロマトグラフ分析装置。
5. ２次元液体クロマトグラフ分析方法であって、
   移動相を第１分離カラムに通液し、
   複数の成分を含む試料を前記第１分離カラムに注入し、
   前記第１分離カラムにより前記試料を分離、分画し、
   第２分離カラムにより前記分画された成分を分離し、
   前記分離された成分を検出する、２次元液体クロマトグラフ分析方法であって、
   前記第１分離カラムは、温度の変調により表面の性質が親水性・疎水性に可逆的に変化する機能性高分子層を有する温度応答性ゲル修飾カラムであり、もしくは水系１００％の移動相を送液することが可能な逆相系のカラムであり、
   前記第２分離カラムは逆相系のカラムである
   前記第１分離カラムに通液する移動相は水系の移動相であり、
   更に第１分離カラムに通液する移動相は目的成分の分離、分画をするときに組成を変更し
   ないことを特徴とする２次元液体クロマトグラフ分析方法。
6. 前記第１分離カラムに温度応答性ゲル修飾カラムを用い、
   前記第２分離カラムにオクタデシルシリル（ＯＤＳ）カラムなど逆相系のカラムを用いることを
   特長とする、請求項５に記載の２次元液体クロマトグラフ分析方法。
7. 前記第１分離カラムの温度を設定した温度に変化させることをさらに含む、請求項５に記載の２次元液体クロマトグラフ分析方法。
8. 請求項１記載の２次元液体クロマトグラフ分析装置を用いて、生体試料中の成分の分離分析を行う、請求項５記載の２次元液体クロマトグラフ分析方法。

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