JP3848991B2

JP3848991B2 - 血清・血漿直接注入可能な高速液体クロマトグラフ

Info

Publication number: JP3848991B2
Application number: JP2001346838A
Authority: JP
Inventors: 禎宏早川; 庸助岩田
Original assignee: Shimadzu Corp; Eisai R&D Management Co Ltd
Current assignee: Shimadzu Corp; Eisai R&D Management Co Ltd
Priority date: 2001-11-13
Filing date: 2001-11-13
Publication date: 2006-11-22
Anticipated expiration: 2021-11-13
Also published as: JP2003149216A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、試料成分を分離する分離カラムと、この分離カラムに移動相を供給する移動相供給部と、この移動相供給部から分離カラムに至る移動相流路に試料を注入する試料注入部と、分離カラムにより分離された試料成分を検出する検出器とを備えた高速液体クロマトグラフに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
高速液体クロマトグラフを用いた分析で、血清や血漿などの生体試料中に含まれる薬物などの微量成分を分析しようとした場合、試料に大量に含まれるタンパク質を除去する必要がある。
【０００３】
通常は試料を高速液体クロマトグラフに注入する前にタンパク質を除去するための前処理を施す。しかし、その前処理操作は煩雑であるために、血清や血漿を高速液体クロマトグラフに直接導入して分析することが試みられている。そのために、試料注入部にタンパク質を排除して目的とする試料成分を吸着してトラップする除タンパクカラムを設けることが検討されている。
【０００４】
血清や血漿からタンパク質を排除する除タンパクカラムとして、シリカゲル外表面を親水性高分子のメチルセルロースで修飾した後、更に内表面をオクタデシルシランで修飾したカラムが提案されている（Chromatograph, Vol.21, No.4, 280-281(2000)参照）。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
そのような除タンパクカラムを用いて血清や血漿などの生体試料を高速液体クロマトグラフに直接注入する分析方法では、薬物などの分析目的成分とタンパク質との間の結合を切断して除タンパクカラムにトラップして濃縮するためには、試料を緩衝液とアセトニトリルとの混合液などの移動相（以下、試料注入用移動相という）で、例えば７倍程度に希釈する必要がある。また、高感度に検出しようとすれば、大量の試料を注入する必要がある。
【０００６】
更に、試料注入部の流路内の試料を全て除タンパクカラムへ送り出すためには、希釈された試料量の、例えば５倍程度の試料注入用移動相を送液しなければならない。
その結果、試料を除タンパクカラムに送るための移動相を大量に送液しなければならず、そのために生体試料の除タンパクと濃縮のための前処理に長時間を要する。
【０００７】
そこで、本発明は試料注入部にタンパク質を排除するための除タンパクカラムを設け、かつその除タンパクカラムによる試料の前処理を含む分析時間全体を短縮することを目的とするものである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明は、試料成分を分離する分離カラムと、この分離カラムに分析用移動相を供給する移動相供給部と、この移動相供給部から前記分離カラムに至る移動相流路に試料を注入する試料注入部と、前記分離カラムにより分離された試料成分を検出する検出器とを備えた高速液体クロマトグラフにおいて、前記試料注入部は、生体試料からタンパク質を排除して試料成分をトラップし、そのトラップした成分を前記分析用移動相により溶出する除タンパクカラムからなる２つのトラップ機構と、タンパク質を含む生体試料を直接注入するための試料注入器及び該試料注入器に並列に設けられた希釈流路を備えて、該試料注入器から注入された試料を希釈しかつ試料成分とタンパク質との結合を切断しながら前記トラップ機構に送り込む試料注入流路と、前記試料注入流路を一方の前記トラップ機構に接続すると共に前記移動相供給部から前記分離カラムに至る前記移動相流路の途中に他方の前記トラップ機構を接続し、かつ前記試料注入流路及び前記移動相流路と２つの前記トラップ機構との接続を同時に切り替える流路切替え機構とを備えていることを特徴とするものである。
【０００９】
【作用】
試料注入流路で試料が試料注入用移動相で希釈されるので、薬物などの分子量の小さい目的物質とタンパク質など分子量の大きい物質との間の結合が切断され、除タンパクカラムでは、試料の血清又は血漿からタンパク質など分子量の大きい物質が吸着されずに廃液と一緒に流れ出し、分子量の小さい目的物質が吸着されてトラップされ、濃縮される。
試料注入部に２つのトラップ機構を設け、一方のトラップ機構に試料を送り込んでタンパク質を排除しつつ試料成分をトラップする前処理を行なうのと同時に、他方のトラップ機構では分析用移動相が供給され、そのトラップ機構にトラップされていた試料成分が分析用移動相により溶出して分離カラムに送られ、分離カラムから溶出して検出器で検出される。
【００１０】
次に、流路切替え機構により接続が切り替えられると、今試料成分がトラップされたトラップ機構に分析用移動相が供給されてトラップされた試料成分が溶出して分離カラムに送られ、その成分が測定されると共に、他方のトラップ機構では新たな試料が試料注入用移動相によりそのトラップ機構に送られてタンパク質が排除されながら試料成分がトラップされる前処理が行なわれる。
【００１１】
このように、試料注入部に２つのトラップ機構を設け、一方のトラップ機構で試料の前処理を行なっているときに他方のトラップ機構では既にトラップされた試料成分が溶出して分析に供される。このように、試料の前処理と分析のための溶出が２つのトラップ機構で同時に行なわれ、それが交互に繰り返されることにより、その高速液体クロマトグラフ全体としては連続して分析を繰り返すことができ、試料の前処理のために分析を中断することがなくなり、稼働率が向上する。
【００１２】
【発明の実施の形態】
トラップ機構は除タンパクカラムにより構成することができる。その際、簡単な流路構成としては、トラップ機構を単一の除タンパクカラムにより構成することができる。
また、大量の試料を注入するのに好都合なようにするために、トラップ機構として複数の除タンパクカラムが並列に接続されたものを使用してもよい。
図１は第１の実施例を表わす。
２は試料成分を分離する分離カラムで、分離カラム２の下流には分離カラム２で分離され溶出してきた試料成分を検出する検出器１２が設けられている。４は分離カラム２に分析用移動相を供給する移動相供給部であり、高圧グラジエント分析を行なうために２種類の移動相を送液する２台の送液ユニット６ａ，６ｂを備えており、それぞれの送液ユニット６ａ，６ｂの流路が混合器８で合流して設定された組成の移動相を供給する。送液ユニット６ａと６ｂの流量の調節により２種類の移動相の混合比を任意に設定することができる。
【００１３】
移動相供給部４から分離カラム２に至る移動相流路に試料を注入する試料注入部１０が設けられている。試料注入部１０には２つの流路切替えバルブ１４ａ，１４ｂが設けられ、それらの流路切替えバルブ１４ａ，１４ｂの間に２つのトラップ機構としてそれぞれ除タンパクカラム１６ａ，１６ｂが接続されている。
【００１４】
流路切替えバルブ１４ｂの他の１つのポートに移動相供給部４が接続され、さらに他の１つのポートは廃液用のドレインにつながっている。
流路切替えバルブ１４ａの他の１つのポートには分離カラム２が接続されている。
【００１５】
流路切替えバルブ１４ａのさらに他の１つのポートには試料として血清又は血漿をこの高速液体クロマトグラフに直接注入するために、オートサンプラなどの試料注入器１８が接続されている。試料注入器１８により注入された試料を除タンパクカラム１６ａ又は１６ｂに送り出すために試料注入用移動相として水又は緩衝液を送り出す送液ユニット２０が試料注入器１８に接続されており、試料注入器１８と並列に試料を希釈する希釈流路２２が設けられている。試料は試料注入器１８から注入されて試料注入用移動相で送り出されるとともに、希釈流路２２からの試料注入用移動相で希釈される。
【００１６】
除タンパクカラム１６ａ，１６ｂとしては上記の参考文献に記載されているように、シリカゲル外表面を親水性高分子のメチルセルロースで修飾した後、更に内表面をオクタデシルシランで修飾したカラムを使用する。除タンパクカラム１６ａ，１６ｂは、分離カラム２と同程度のサイズをもつもの、例えば直径４．６ｍｍで長さが１０ｍｍのものを使用することができる。
【００１７】
試料注入用移動相としては、例えばリン酸緩衝液とアセトニトリルとの混合液を用いる。試料注入器１８に並列に設けられた希釈流路２２により試料が希釈され、試料内の試料成分とアルブミンなどのタンパク質との間にあるタンパク結合が切断され、除タンパクカラム１６ａ，１６ｂにおける試料成分の回収率が高められる。
【００１８】
除タンパクカラム１６ａ，１６ｂでは、送液ユニット２０からの試料注入用移動相で希釈されて送られてきた試料の血清又は血漿からタンパク質など分子量の大きい物質が吸着されずに廃液と一緒に流れ出し、薬物などの分子量の小さい目的物質が吸着されてトップされ、濃縮される。
【００１９】
希釈流路２２による希釈率は、注入器１８と希釈流路２２の流路抵抗を調節することにより任意に設定することができる。試料の希釈は、例えば試料１に対し、希釈のための試料注入用移動相を７というような高倍率で希釈する。検出を高感度で行なうためには、試料注入量としては２００μＬ程度の大量注入を行なうのが好ましい。この場合、２００μＬの試料を８倍に希釈し、流路にある希釈された試料を完全に除タンパクカラム１６ａ又は１６ｂに導入するために、希釈試料の５倍程度を送液するとすれば、試料注入用移動相の送液ユニット２０は流速１ｍＬ／分の送液量で８分間の送液を行なうことになる。
【００２０】
次に、この実施例における動作を更に詳細に説明する。
今、除タンパクカラム１６ｂには既に試料成分がトラップされているものとする。切替えバルブ１４ａ，１４ｂを実線の流路になるように設定し、送液ユニット２０から試料注入用移動相を送液し、注入器１８から試料を注入する。それとともに、分析用移動相の送液ユニット６ａ，６ｂも作動させ分析用移動相も送液する。これにより、注入器１８から注入された試料は除タンパクカラム１６ａへ導かれて薬物などの試料成分が吸着されてトラップされ、濃縮されていく。一方、除タンパクカラム１６ｂに既にトラップされていた試料成分は、送液ユニット６ａ，６ｂから送られてきた分析用移動相により溶出して分離カラム２へ送られ、分離カラム２で分離されて溶出した成分が検出器１２で検出されていく。
【００２１】
除タンパクカラム１６ａによる試料成分のトラップと、除タンパクカラム１６ｂにトラップされていた試料の分析が終了すると、切替えバルブ１４ａと１４ｂが同時に破線の流路に切り替えられる。
【００２２】
これにより、分析用移動相が今度は除タンパクカラム１６ａに流され、除タンパクカラム１６ａにトラップされた試料成分が溶出して分離カラム２に導かれ、分離カラム２で分離されて溶出し検出器１２で検出されていく。同時に、注入器１８から次の試料が注入され、試料注入用移動相で希釈されながら除タンパクカラム１６ｂに送れ、除タンパクと試料成分のトラップが行なわれる。
【００２３】
このように、１つの分析が終了するごとに切替えバルブ１４ａと１４ｂを同時に切り替えることにより、一方の除タンパクカラムにトラップされていた試料成分の分析と他方の除タンパクカラムによる試料の前処理とが同時に行なわれていく。
【００２４】
図２は第２の実施例を表わしたものである。図１の実施例と同一の部分には同一の符号を付し、説明は省略する。
図１の実施例では動作の切替えのために２つの切替えバルブ１４ａと１４ｂが設けられているが、この実施例ではそれに替わって１つの１０方バルブ３０が設けられ、除タンパクカラム１６ａ，１６ｂ、分離カラム２、移動相供給部４及び試料注入器１８は１０方バルブ３０の各ポートに接続されている。３２は１０方バルブ３０の２つのポート間を接続する流路である。
【００２５】
図２の実施例では、１０方バルブ３０が実線の流路に設定されたときは、試料注入器１８から注入された試料が試料注入用移動相で希釈されながら除タンパクカラム１６ｂに送られて除タンパクと試料成分トラップの前処理が行なわれる。それと同時に分析用移動相が他方の除タンパクカラム１６ａに送られ、除タンパクカラム１６ａに既にトラップされていた試料成分が溶出されて分離カラム２へ導かれ、分析が行なわれる。
【００２６】
次に、１０方バルブ３０が破線の流路に切り替えられ、除タンパクカラム１６ａで新たな試料の除タンパクと試料成分トラップの前処理が行なわれ、除タンパクカラム１６ｂにトラップされていた試料の分離分析が行なわれる。
実施例では高圧グラジエントによる分析モードの例を示しているが、低圧グラジエントモードでもよく、単一の移動相による分析でもよい。
【００２７】
以上の実施例では、トラップ機構として単一の除タンパクカラムを使用しているが、大量の試料を容易に注入できるようにするために、トラップ機構として２本又はそれ以上の除タンパクカラムが並列に接続されたものを使用してもよい。
【００２８】
図３は図１の実施例において、一方のトラップ機構として２本の除タンパクカラム１６ａ−１と１６ａ−２が並列に接続されたものを使用し、他方のトラップ機構として２本の除タンパクカラム１６ｂ−１と１６ｂ−２が並列に接続されたものを使用している。このように、除タンパクカラムを２本並列に配置することにより、単一の除タンパクカラムを使用する場合に比べて２倍の流量で試料を注入することができるようになる。
図２の実施例においても、トラップ機構として２本の除タンパクカラムが並列に接続されたものを使用することができる。
【００２９】
【発明の効果】
本発明では、試料注入部に生体試料からタンパク質を排除して試料成分をトラップし、そのトラップした成分を分析用移動相により溶出する除タンパクカラムからなる２つのトラップ機構と、試料注入器から注入された試料を希釈しながらトラップ機構に送り込む試料注入流路と、試料注入流路を一方のトラップ機構に接続すると共に移動相供給部から分離カラムに至る移動相流路の途中に他方のトラップ機構を接続し、かつ試料注入流路及び移動相流路と２つのトラップ機構との接続を同時に切り替える流路切替え機構とを備えた。このように、試料が希釈されて除タンパクカラムからなるトラップ機構に導入されるために、トラップ機構では分子量の小さい目的物質が吸着されてトラップされて濃縮されるとともに、試料の前処理と分析のための溶出が２つのトラップ機構で同時に行なわれ、それが交互に繰り返されることにより、その高速液体クロマトグラフ全体としては連続して分析を繰り返すことができ、試料の前処理のために分析を中断することがなくなり、稼働率が向上する。
【図面の簡単な説明】
【図１】第１の実施例を表わす流路図である。
【図２】第２の実施例を表わす流路図である。
【図３】第３の実施例を表わす流路図である。
【符号の説明】
２分離カラム
１２検出器
４移動相供給部
１０試料注入部
１４ａ，１４ｂ流路切替えバルブ
１６ａ，１６ｂ，１６ａ−１，１６a−２，１６ｂ−１，１６ｂ−２除タンパクカラム
１８試料注入器
３０１０方バルブ

Claims

試料成分を分離する分離カラムと、この分離カラムに分析用移動相を供給する移動相供給部と、この移動相供給部から前記分離カラムに至る移動相流路に試料を注入する試料注入部と、前記分離カラムにより分離された試料成分を検出する検出器とを備えた高速液体クロマトグラフにおいて、
前記試料注入部は、
生体試料からタンパク質を排除して試料成分をトラップし、そのトラップした成分を前記分析用移動相により溶出する除タンパクカラムからなる２つのトラップ機構と、
タンパク質を含む生体試料を直接注入するための試料注入器及び該試料注入器に並列に設けられた希釈流路を備えて、該試料注入器から注入された試料を希釈しかつ試料成分とタンパク質との結合を切断しながら前記トラップ機構に送り込む試料注入流路と、
前記試料注入流路を一方の前記トラップ機構に接続すると共に前記移動相供給部から前記分離カラムに至る前記移動相流路の途中に他方の前記トラップ機構を接続し、かつ前記試料注入流路及び前記移動相流路と２つの前記トラップ機構との接続を同時に切り替える流路切替え機構とを備えていることを特徴とする高速液体クロマトグラフ。
前記トラップ機構は単一の除タンパクカラムである請求項１に記載の高速液体クロマトグラフ。
前記トラップ機構は複数の除タンパクカラムが並列に接続されたものである請求項１に記載の高速液体クロマトグラフ。
前記試料注入流路は前記試料注入器と希釈流路の流路抵抗の調節により希釈率を変更できるようになっている請求項１から３のいずれかに記載の高速液体クロマトグラフ。