JP2003149216A - 血清・血漿直接注入可能な高速液体クロマトグラフ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 試料注入部に設けた除タンパクカラムによる
試料の前処理を含む分析時間全体を短縮する。 【解決手段】 注入器１８から注入された試料は除タン
パクカラム１６ａへ導かれて試料成分がトラップされ、
濃縮されていく。一方、除タンパクカラム１６ｂに既に
トラップされていた試料成分は、送液ユニット６ａ，６
ｂから送られてきた分析用移動相により溶出して分離カ
ラム２へ送られ、検出器１２で検出されていく。次に切
替えバルブ１４ａと１４ｂが同時に破線の流路に切り替
えられ、今度は分析用移動相が除タンパクカラム１６ａ
に流され、トラップされていた試料成分が溶出して分離
カラム２に導かれ、検出器１２で検出されていく。同時
に、注入器１８から次の試料が注入され、試料注入用移
動相で希釈されながら除タンパクカラム１６ｂに送られ
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、試料成分を分離す
る分離カラムと、この分離カラムに移動相を供給する移
動相供給部と、この移動相供給部から分離カラムに至る
移動相流路に試料を注入する試料注入部と、分離カラム
により分離された試料成分を検出する検出器とを備えた
高速液体クロマトグラフに関するものである。

【０００２】

【従来の技術】高速液体クロマトグラフを用いた分析
で、血清や血漿などの生体試料中に含まれる薬物などの
微量成分を分析しようとした場合、試料に大量に含まれ
るタンパク質を除去する必要がある。

【０００３】通常は試料を高速液体クロマトグラフに注
入する前にタンパク質を除去するための前処理を施す。
しかし、その前処理操作は煩雑であるために、血清や血
漿を高速液体クロマトグラフに直接導入して分析するこ
とが試みられている。そのために、試料注入部にタンパ
ク質を排除して目的とする試料成分を吸着してトラップ
する除タンパクカラムを設けることが検討されている。

【０００４】血清や血漿からタンパク質を排除する除タ
ンパクカラムとして、シリカゲル外表面を親水性高分子
のメチルセルロースで修飾した後、更に内表面をオクタ
デシルシランで修飾したカラムが提案されている（Chro
matograph, Vol.21, No.4, 280-281(2000)参照）。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】そのような除タンパク
カラムを用いて血清や血漿などの生体試料を高速液体ク
ロマトグラフに直接注入する分析方法では、薬物などの
分析目的成分とタンパク質との間の結合を切断して除タ
ンパクカラムにトラップして濃縮するためには、試料を
緩衝液とアセトニトリルとの混合液などの移動相（以
下、試料注入用移動相という）で、例えば７倍程度に希
釈する必要がある。また、高感度に検出しようとすれ
ば、大量の試料を注入する必要がある。

【０００６】更に、試料注入部の流路内の試料を全て除
タンパクカラムへ送り出すためには、希釈された試料量
の、例えば５倍程度の試料注入用移動相を送液しなけれ
ばならない。その結果、試料を除タンパクカラムに送る
ための移動相を大量に送液しなければならず、そのため
に生体試料の除タンパクと濃縮のための前処理に長時間
を要する。

【０００７】そこで、本発明は試料注入部にタンパク質
を排除するための除タンパクカラムを設け、かつその除
タンパクカラムによる試料の前処理を含む分析時間全体
を短縮することを目的とするものである。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明は、試料成分を分
離する分離カラムと、分離カラムに分析用移動相を供給
する移動相供給部と、移動相供給部から分離カラムに至
る移動相流路に試料を注入する試料注入部と、分離カラ
ムにより分離された試料成分を検出する検出器とを備え
た高速液体クロマトグラフにおいて、試料注入部は、生
体試料からタンパク質を排除して試料成分をトラップ
し、そのトラップした成分を分析用移動相により溶出す
る２つのトラップ機構と、試料注入器から注入された試
料を希釈しながらトラップ機構に送り込む試料注入流路
と、試料注入流路を一方のトラップ機構に接続すると共
に移動相供給部から分離カラムに至る移動相流路の途中
に他方のトラップ機構を接続し、かつ試料注入流路及び
移動相流路と２つのトラップ機構との接続を同時に切り
替える流路切替え機構とを備えたものである。

【０００９】

【作用】試料注入部に２つのトラップ機構を設け、一方
のトラップ機構に試料を送り込んでタンパク質を排除し
つつ試料成分をトラップする前処理を行ななうのと同時
に、他方のトラップ機構では分析用移動相が供給され、
そのトラップ機構にトラップされていた試料成分が分析
用移動相により溶出して分離カラムに送られ、分離カラ
ムから溶出して検出器で検出される。

【００１０】次に、流路切替え機構により接続が切り替
えられると、今試料成分がトラップされたトラップ機構
に分析用移動相が供給されてトラップされた試料成分が
溶出して分離カラムに送られ、その成分が測定されると
共に、他方のトラップ機構では新たな試料が試料注入用
移動相によりそのトラップ機構に送られてタンパク質が
排除されながら試料成分がトラップされる前処理が行な
われる。

【００１１】このように、試料注入部に２つのトラップ
機構を設け、一方のトラップ機構で試料の前処理を行な
っているときに他方のトラップ機構では既にトラップさ
れた試料成分が溶出して分析に供される。このように、
試料の前処理と分析のための溶出が２つのトラップ機構
で同時に行なわれ、それが交互に繰り返されることによ
り、その高速液体クロマトグラフ全体としては連続して
分析を繰り返すことができ、試料の前処理のために分析
を中断することがなくなり、稼働率が向上する。

【００１２】

【発明の実施の形態】トラップ機構は除タンパクカラム
により構成することができる。その際、簡単な流路構成
としては、トラップ機構を単一の除タンパクカラムによ
り構成することができる。また、大量の試料を注入する
のに好都合なようにするために、トラップ機構として複
数の除タンパクカラムが並列に接続されたものを使用し
てもよい。図１は第１の実施例を表わす。２は試料成分
を分離する分離カラムで、分離カラム２の下流には分離
カラム２で分離され溶出してきた試料成分を検出する検
出器１２が設けられている。４は分離カラム２に分析用
移動相を供給する移動相供給部であり、高圧グラジエン
ト分析を行なうために２種類の移動相を送液する２台の
送液ユニット６ａ，６ｂを備えており、それぞれの送液
ユニット６ａ，６ｂの流路が混合器８で合流して設定さ
れた組成の移動相を供給する。送液ユニット６ａと６ｂ
の流量の調節により２種類の移動相の混合比を任意に設
定することができる。

【００１３】移動相供給部４から分離カラム２に至る移
動相流路に試料を注入する試料注入部１０が設けられて
いる。試料注入部１０には２つの流路切替えバルブ１４
ａ，１４ｂが設けられ、それらの流路切替えバルブ１４
ａ，１４ｂの間に２つのトラップ機構としてそれぞれ除
タンパクカラム１６ａ，１６ｂが接続されている。

【００１４】流路切替えバルブ１４ｂの他の１つのポー
トに移動相供給部４が接続され、さらに他の１つのポー
トは廃液用のドレインにつながっている。流路切替えバ
ルブ１４ａの他の１つのポートには分離カラム２が接続
されている。

【００１５】流路切替えバルブ１４ａのさらに他の１つ
のポートには試料として血清又は血漿をこの高速液体ク
ロマトグラフに直接注入するために、オートサンプラな
どの試料注入器１８が接続されている。試料注入器１８
により注入された試料を除タンパクカラム１６ａ又は１
６ｂに送り出すために試料注入用移動相として水又は緩
衝液を送り出す送液ユニット２０が試料注入器１８に接
続されており、試料注入器１８と並列に試料を希釈する
希釈流路２２が設けられている。試料は試料注入器１８
から注入されて試料注入用移動相で送り出されるととも
に、希釈流路２２からの試料注入用移動相で希釈され
る。

【００１６】除タンパクカラム１６ａ，１６ｂとしては
上記の参考文献に記載されているように、シリカゲル外
表面を親水性高分子のメチルセルロースで修飾した後、
更に内表面をオクタデシルシランで修飾したカラムを使
用する。除タンパクカラム１６ａ，１６ｂは、分離カラ
ム２と同程度のサイズをもつもの、例えば直径４．６ｍ
ｍで長さが１０ｍｍのものを使用することができる。

【００１７】試料注入用移動相としては、例えばリン酸
緩衝液とアセトニトリルとの混合液を用いる。試料注入
器１８に並列に設けられた希釈流路２２により試料が希
釈され、試料内の試料成分とアルブミンなどのタンパク
質との間にあるタンパク結合が切断され、除タンパクカ
ラム１６ａ，１６ｂにおける試料成分の回収率が高めら
れる。

【００１８】除タンパクカラム１６ａ，１６ｂでは、送
液ユニット２０からの試料注入用移動相で希釈されて送
られてきた試料の血清又は血漿からタンパク質など分子
量の大きい物質が吸着されずに廃液と一緒に流れ出し、
薬物などの分子量の小さい目的物質が吸着されてトップ
され、濃縮される。

【００１９】希釈流路２２による希釈率は、注入器１８
と希釈流路２２の流路抵抗を調節することにより任意に
設定することができる。試料の希釈は、例えば試料１に
対し、希釈のための試料注入用移動相を７というような
高倍率で希釈する。検出を高感度で行なうためには、試
料注入量としては２００μＬ程度の大量注入を行なうの
が好ましい。この場合、２００μＬの試料を８倍に希釈
し、流路にある希釈された試料を完全に除タンパクカラ
ム１６ａ又は１６ｂに導入するために、希釈試料の５倍
程度を送液するとすれば、試料注入用移動相の送液ユニ
ット２０は流速１ｍＬ／分の送液量で８分間の送液を行
なうことになる。

【００２０】次に、この実施例における動作を更に詳細
に説明する。今、除タンパクカラム１６ｂには既に試料
成分がトラップされているものとする。切替えバルブ１
４ａ，１４ｂを実線の流路になるように設定し、送液ユ
ニット２０から試料注入用移動相を送液し、注入器１８
から試料を注入する。それとともに、分析用移動相の送
液ユニット６ａ，６ｂも作動させ分析用移動相も送液す
る。これにより、注入器１８から注入された試料は除タ
ンパクカラム１６ａへ導かれて薬物などの試料成分が吸
着されてトラップされ、濃縮されていく。一方、除タン
パクカラム１６ｂに既にトラップされていた試料成分
は、送液ユニット６ａ，６ｂから送られてきた分析用移
動相により溶出して分離カラム２へ送られ、分離カラム
２で分離されて溶出した成分が検出器１２で検出されて
いく。

【００２１】除タンパクカラム１６ａによる試料成分の
トラップと、除タンパクカラム１６ｂにトラップされて
いた試料の分析が終了すると、切替えバルブ１４ａと１
４ｂが同時に破線の流路に切り替えられる。

【００２２】これにより、分析用移動相が今度は除タン
パクカラム１６ａに流され、除タンパクカラム１６ａに
トラップされた試料成分が溶出して分離カラム２に導か
れ、分離カラム２で分離されて溶出し検出器１２で検出
されていく。同時に、注入器１８から次の試料が注入さ
れ、試料注入用移動相で希釈されながら除タンパクカラ
ム１６ｂに送れ、除タンパクと試料成分のトラップが行
なわれる。

【００２３】このように、１つの分析が終了するごとに
切替えバルブ１４ａと１４ｂを同時に切り替えることに
より、一方の除タンパクカラムにトラップされていた試
料成分の分析と他方の除タンパクカラムによる試料の前
処理とが同時に行なわれていく。

【００２４】図２は第２の実施例を表わしたものであ
る。図１の実施例と同一の部分には同一の符号を付し、
説明は省略する。図１の実施例では動作の切替えのため
に２つの切替えバルブ１４ａと１４ｂが設けられている
が、この実施例ではそれに替わって１つの１０方バルブ
３０が設けられ、除タンパクカラム１６ａ，１６ｂ、分
離カラム２、移動相供給部４及び試料注入器１８は１０
方バルブ３０の各ポートに接続されている。３２は１０
方バルブ３０の２つのポート間を接続する流路である。

【００２５】図２の実施例では、１０方バルブ３０が実
線の流路に設定されたときは、試料注入器１８から注入
された試料が試料注入用移動相で希釈されながら除タン
パクカラム１６ｂに送られて除タンパクと試料成分トラ
ップの前処理が行なわれる。それと同時に分析用移動相
が他方の除タンパクカラム１６ａに送られ、除タンパク
カラム１６ａに既にトラップされていた試料成分が溶出
されて分離カラム２へ導かれ、分析が行なわれる。

【００２６】次に、１０方バルブ３０が破線の流路に切
り替えられ、除タンパクカラム１６ａで新たな試料の除
タンパクと試料成分トラップの前処理が行なわれ、除タ
ンパクカラム１６ｂにトラップされていた試料の分離分
析が行なわれる。実施例では高圧グラジエントによる分
析モードの例を示しているが、低圧グラジエントモード
でもよく、単一の移動相による分析でもよい。

【００２７】以上の実施例では、トラップ機構として単
一の除タンパクカラムを使用しているが、大量の試料を
容易に注入できるようにするために、トラップ機構とし
て２本又はそれ以上の除タンパクカラムが並列に接続さ
れたものを使用してもよい。

【００２８】図３は図１の実施例において、一方のトラ
ップ機構として２本の除タンパクカラム１６ａ−１と１
６ａ−２が並列に接続されたものを使用し、他方のトラ
ップ機構として２本の除タンパクカラム１６ｂ−１と１
６ｂ−２が並列に接続されたものを使用している。この
ように、除タンパクカラムを２本並列に配置することに
より、単一の除タンパクカラムを使用する場合に比べて
２倍の流量で試料を注入することができるようになる。
図２の実施例においても、トラップ機構として２本の除
タンパクカラムが並列に接続されたものを使用すること
ができる。

【００２９】

【発明の効果】本発明では、試料注入部に生体試料から
タンパク質を排除して試料成分をトラップし、そのトラ
ップした成分を分析用移動相により溶出する２つのトラ
ップ機構と、試料注入器から注入された試料を希釈しな
がらトラップ機構に送り込む試料注入流路と、試料注入
流路を一方のトラップ機構に接続すると共に移動相供給
部から分離カラムに至る移動相流路の途中に他方のトラ
ップ機構を接続し、かつ試料注入流路及び移動相流路と
２つのトラップ機構との接続を同時に切り替える流路切
替え機構とを備えた。これにより、試料の前処理と分析
のための溶出が２つのトラップ機構で同時に行なわれ、
それが交互に繰り返されることにより、その高速液体ク
ロマトグラフ全体としては連続して分析を繰り返すこと
ができ、試料の前処理のために分析を中断することがな
くなり、稼働率が向上する。

【図面の簡単な説明】

【図１】第１の実施例を表わす流路図である。

【図２】第２の実施例を表わす流路図である。

【図３】第３の実施例を表わす流路図である。

【符号の説明】

２ 分離カラム １２ 検出器 ４ 移動相供給部 １０ 試料注入部 １４ａ，１４ｂ 流路切替えバルブ １６ａ，１６ｂ，１６ａ−１，１６a−２，１６ｂ−
１，１６ｂ−２除タンパクカラム １８ 試料注入器 ３０ １０方バルブ

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） // Ｇ０１Ｎ 30/48 Ｇ０１Ｎ 30/48 Ｋ 33/50 33/50 Ｕ (72)発明者 岩田 庸助 京都府京都市中京区西ノ京桑原町１番地 株式会社島津製作所内 Ｆターム(参考） 2G045 AA13 CA26 FB06

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 試料成分を分離する分離カラムと、この
   分離カラムに分析用移動相を供給する移動相供給部と、
   この移動相供給部から前記分離カラムに至る移動相流路
   に試料を注入する試料注入部と、前記分離カラムにより
   分離された試料成分を検出する検出器とを備えた高速液
   体クロマトグラフにおいて、 前記試料注入部は、生体試料からタンパク質を排除して
   試料成分をトラップし、そのトラップした成分を前記分
   析用移動相により溶出する２つのトラップ機構と、 試料注入器から注入された試料を希釈しながら前記トラ
   ップ機構に送り込む試料注入流路と、 前記試料注入流路を一方の前記トラップ機構に接続する
   と共に前記移動相供給部から前記分離カラムに至る前記
   移動相流路の途中に他方の前記トラップ機構を接続し、
   かつ前記試料注入流路及び前記移動相流路と２つの前記
   トラップ機構との接続を同時に切り替える流路切替え機
   構とを備えていることを特徴とする高速液体クロマトグ
   ラフ。
2. 【請求項２】 前記トラップ機構は単一の除タンパクカ
   ラムである請求項１に記載の高速液体クロマトグラフ。
3. 【請求項３】 前記トラップ機構は複数の除タンパクカ
   ラムが並列に接続されたものである請求項１に記載の高
   速液体クロマトグラフ。