JP5374769B2

JP5374769B2 - Ｎｍｒ測定用サンプルの製造方法、ｎｍｒ測定方法、ｎｍｒ測定用サンプルの製造装置、及び、分析システム

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Publication number: JP5374769B2
Application number: JP2009073992A
Authority: JP
Inventors: 順悦五十嵐; 知彦植田
Original assignee: Sumitomo Dainippon Pharma Co Ltd
Current assignee: Sumitomo Pharma Co Ltd
Priority date: 2009-03-25
Filing date: 2009-03-25
Publication date: 2013-12-25
Anticipated expiration: 2029-03-25
Also published as: JP2010223884A

Description

本発明は、高極性の成分のＮＭＲ（Nuclear Magnetic Resonance）測定用サンプルの製造が可能なＮＭＲ測定用サンプルの製造方法、該製造方法で製造されたサンプルのＮＭＲ測定方法、高極性の成分のＮＭＲ測定用サンプルを製造するＮＭＲ測定用サンプルの製造装置、及び、該装置で製造されたサンプルをＮＭＲ測定する分析システムに関する。

ＬＣ−ＮＭＲ（liquid chromatography-Nuclear Magnetic Resonance）装置は、高速液体クロマトグラフフィー（ＨＰＬＣ）で試料を分離しながら、単離することなく試料の各成分のＮＭＲスペクトルを測定することが可能な装置であり、医薬品の開発において繁用されている。ＬＣ−ＮＭＲは、極めて豊富な構造情報を与えることから、未知の不純物、副生成物、あるいは代謝物等の構造決定に大きな威力を発揮する。しかし、ＬＣ−ＮＭＲ装置による構造解析（ＮＭＲ測定）は、一般に、他の分析機器と比べて感度が低いのが弱点である。例えば、ＬＣ−ＭＳ（Liquid Chromatography-Mass Spectrometry）装置による構造解析と比べた場合は、感度が２−３桁低いといわれている。そのため、上述のＬＣ−ＮＭＲ装置による構造解析では、構造解析そのものより、むしろ、解析対象の試料が微量、即ち、該試料の成分が微量であることにより解析が困難になることが多い。

これを解決する手段の一つとして、ＨＰＬＣによって試料を各成分に分離し、分離した各成分を成分毎にトラップカラムに吸着するカラムスイッチング法が考案されている（例えば、非特許文献１〜３参照）。具体的には、溶媒に溶解した試料を構成する複数の成分を分離カラムで分離して、該分離カラムから順次溶媒に溶出させる。そして、溶出する成分に応じて、複数のトラップカラムの中から分離カラムと連通するトラップカラムを切り替えて、各成分が溶出した溶媒をトラップカラムの一端側から他端側に流し込むことにより、各成分を成分毎にトラップカラムに吸着させる方法である。

この方法によれば、各成分を分離カラムから繰り返し溶出させ、トラップカラムへの吸着量が適正なＮＭＲ測定に必要な量（以下、単に「ＮＭＲ測定に必要な量」という。）となった成分から順にトラップカラムから溶出させることで、各成分についてＮＭＲ測定に必要な量を得ることができる。しかし、高極性の成分は、従来用いられてきたトラップカラム（逆相カラムなど）に吸着し難い。このため、上述の方法では、高極性の成分については、ＮＭＲ測定に必要な量を得ることは困難であり、ＮＭＲ測定は事実上不可能であった。

グラファイトカーボンなどを充填剤とするカラムを用いてダイオキシン等の低極性成分を分離させることが特許文献１に開示されている。また、該カラムを用いて芳香族スルホン酸化合物を分離させることが非特許文献４に開示されている。グラファイトカーボンなどを充填剤とするカラムは、比較的吸着力が高いものとして知られている。しかし、このようなカラムであっても、高極性の成分、特に、芳香族スルホン酸化合物よりも極性の高い成分を充分に吸着することができない。従って、グラファイトカーボンなどを充填剤とするカラムをトラップカラムとして用いても、高極性の成分については、ＮＭＲ測定に必要な量を得ることは困難であり、ＮＭＲ測定は事実上不可能で有ることに変わりがない。

特開２０００−０２８５９８号公報

中村洋監修、「分析試料前処理ハンドブック」、丸善株式会社、2003年1月10日、P.14-17、P.205-209 工藤正純、大久保正、菅原和信、「カラムスイッチング法を用いたＨＰＬＣによる生体試料中ニューキノロン系抗菌剤の測定法の開発と薬物相互作用への応用に関する研究」、薬学雑誌、日本薬学会、2001年、第121巻、第5号、P.319-326 一ノ木進、滝戸奈津子、藤井洋一、森田俊博、家入一郎、大坪健司、斉藤憲輝、「カラムスイッチング法を用いた自動逆相ＨＰＬＣによる血清中および尿中のカルバリルとプロパニルの同時定量」、中毒研究、へるす出版、2003年、第16巻、P.171-178 グラファイトカーボンHPLCカラム：Hypercarb、［online］、［平成21年3月19日検索］インターネット<URL：http://www.chemco.jp/cn10/pg68.html〉

本発明は、ＮＭＲ測定に必要な量の高極性の成分のサンプルを製造可能なＮＭＲ測定用サンプルの製造方法、該製造方法で製造されたサンプルのＮＭＲ測定方法、ＮＭＲ測定に必要な量の高極性の成分のサンプルを製造するＮＭＲ測定用サンプルの製造装置、及び、該装置で製造されたサンプルをＮＭＲ測定する分析システムを提供することを目的とする。

本発明は、高速液体クロマトグラフィー装置を備えたＮＭＲ測定用サンプルの製造装置を用いて、溶媒に溶解した高極性の成分を含む試料を構成する複数の成分を分離カラムで分離して、各成分を該分離カラムから順次前記溶媒に溶出し、溶出した各成分に応じて、複数のトラップカラムの中から前記分離カラムと連通するトラップカラムを切り替えて、各成分が溶出した前記溶媒を前記各トラップカラムの一端側から他端側に流し込むことにより、各成分を前記各トラップカラムに吸着させ、前記各トラップカラムに吸着した各成分を重溶媒で溶出して、各成分のＮＭＲ測定用サンプルを製造する方法であって、前記分離カラムから溶出する成分のうち、高極性の成分を吸着する前記トラップカラムに活性炭カラム（ただし、グラファイトカーボンカラムを除く）を用い、前記活性炭カラムの前記他端側から前記一端側に前記重溶媒を流すことにより、前記高極性の成分を前記活性炭カラムから溶出させることを特徴とするＮＭＲ測定用サンプルの製造方法を提供する。

本発明に係るＮＭＲ測定用サンプルの製造方法は、背景技術に記載のカラムスイッチング法と同様に、溶媒に溶解した試料を構成する複数の成分を成分毎にトラップカラムに吸着させ、トラップカラムに吸着した成分を重溶媒で溶出することによりＮＭＲ測定用サンプルを製造するものである。本発明に係るＮＭＲ測定用サンプルの製造方法においては、高極性の成分を吸着するトラップカラムに活性炭カラムを用いている。活性炭カラムは吸着力が非常に高いため、高極性の成分であっても充分に吸着することができる。従って、本発明に係るＮＭＲ測定用サンプルの製造方法によれば、高極性の成分について、ＮＭＲ測定に必要な量を活性炭カラムに吸着することができる。
また、本発明に係るＮＭＲ測定用サンプルの製造方法においては、分離カラムから高極性の成分が溶出した溶媒をトラップカラムの一端側から他端側に流し込むことにより、該成分をトラップカラムに吸着させる。活性炭カラムは吸着力が非常に高いため、分離カラムから溶出した高極性の成分は、活性炭カラムの一端側に主として吸着する。本発明に係るＮＭＲ測定用サンプルの製造方法においては、重溶媒を活性炭カラムの他端側から一端側に流して高極性の成分を溶出させる。上述のように、高極性の成分は活性炭カラムの一端側に主として吸着しているため、活性炭カラムの他端側から一端側に重溶媒を流すと、少量の重溶媒で活性炭カラムに吸着した高極性の成分を溶出させることができる。従って、本発明に係るＮＭＲ測定用サンプルの製造方法によれば、少量の重溶媒でＮＭＲ測定に必要な量の高極性の成分のサンプルを製造することができる。
また、少量の重溶媒でＮＭＲ測定に必要な量の高極性の成分を溶出できるため、高極性の成分の濃度が高い重溶媒を得ることができる。従って、例え、ＬＣ−ＮＭＲ装置のＮＭＲ測定用のプローブの容積が小さい場合であっても、ＮＭＲ測定に必要な量の高極性の成分をＬＣ−ＮＭＲ装置に収容できる。このため、本発明に係るＮＭＲ測定用サンプルの製造方法によれば、このような場合であっても、高極性の成分について適正なＮＭＲ測定が可能である。

また、本発明は、上述のＮＭＲ測定用サンプルの製造方法によって製造されたＮＭＲ測定用サンプルをＮＭＲ測定することを特徴とするＮＭＲ測定方法を提供する。

本発明は、溶媒に溶解した高極性の成分を含む試料を構成する複数の成分を分離して、順次前記溶媒に溶出させる分離カラムと、前記分離カラムから溶出する各成分をぞれぞれ吸着する複数のトラップカラムと、重溶媒を供給する重溶媒供給部と、第１流路と、前記各トラップカラムがそれぞれ連通可能に取り付けられる複数の第２流路と、前記分離カラム及び前記重溶媒供給部の何れか一方を切替可能に前記第１流路の一端側に連通させる第１切替部と、前記第２流路の何れか１つを切替可能に前記第１流路の他端側に連通させる第２切替部とを備え、前記分離カラムを前記第１流路に前記第１切替部によって連通させ、前記分離カラムから前記溶媒に溶出する各成分に応じて、前記第１流路に連通させる前記トラップカラムを前記第２切替部によって切り替えて、各成分が溶出した前記溶媒を前記各トラップカラムに流し込むことにより各成分を前記トラップカラムに吸着させ、更に、前記重溶媒供給部を前記第１流路に前記第１切替部によって連通させ、前記第１流路に連通させる前記トラップカラムを前記第２切替部によって切り替えて、前記各トラップカラムに吸着した各成分を前記重溶媒供給部が供給する重溶媒で溶出させて、各成分のＮＭＲ測定用サンプルを製造する高速液体クロマトグラフィー装置を備えたＮＭＲ測定用サンプルの製造装置であって、前記分離カラムから溶出する成分のうち、高極性の成分を吸着する前記トラップカラムが、活性炭カラム（ただし、グラファイトカーボンカラムを除く）であり、前記活性炭カラムは、前記溶媒及び前記重溶媒の流れる向きが互いに逆になるように、一端側及び他端側のそれぞれが前記第２流路に着脱可能な構成とされていることを特徴とするＮＭＲ測定用サンプルの製造装置（以下、適宜、「第１のＮＭＲ測定用サンプルの製造装置」という。）を提供する。

第１のＮＭＲ測定用サンプルの製造装置においても、高極性の成分を吸着するトラップカラムに活性炭カラムが用いられている。従って、第１のＮＭＲ測定用サンプルの製造装置は、ＮＭＲ測定に必要な量の高極性の成分を活性炭カラムに吸着することができる。
また、活性炭カラムは、分離カラムから高極性の成分が溶出した溶媒及び活性炭カラムに吸着した該成分を溶出させる重溶媒の流れる向きが互いに逆になるように、一端側及び他端側のそれぞれが第２流路に着脱可能な構成とされている。例えば、活性炭カラムに溶媒を流すときは一端側を第２流路に取り付け、活性炭カラムに重溶媒を流すときは他端側を第２流路に取り付けると、溶媒及び重溶媒の流れる向きを互いに逆にすることができる。このように、溶媒を流すときに一端側を第２流路に取り付けていると、溶媒に溶出した高極性の成分は活性炭カラムの一端側に主として吸着される。このため、他端側を第２流路に取り付けて重溶媒を流せば、少量の重溶媒で活性炭カラムに吸着した高極性の成分を溶出させることができる。従って、第１のＮＭＲ測定用サンプルの製造装置は、少量の重溶媒でＮＭＲ測定に必要な量の高極性の成分のサンプルを製造することができる。
また、少量の重溶媒でＮＭＲ測定に必要な量の高極性の成分を溶出できるため、第１のＮＭＲ測定用サンプルの製造装置によって製造されたサンプルによれば、例え、ＬＣ−ＮＭＲ装置のＮＭＲ測定用プローブの容積が小さくても、高極性の成分について適正なＮＭＲ測定が可能である。

本発明は、溶媒に溶解した高極性の成分を含む試料を構成する複数の成分を分離して、順次前記溶媒に溶出させる分離カラムと、前記分離カラムから溶出する各成分をぞれぞれ吸着する複数のトラップカラムと、重溶媒を供給する重溶媒供給部と、第１流路と、前記各トラップカラムがそれぞれ連通可能に取り付けられる複数の第２流路と、前記分離カラム及び前記重溶媒供給部の何れか一方を切替可能に前記第１流路の一端側に連通させる第１切替部と、前記第２流路の何れか１つを切替可能に前記第１流路の他端側に連通させる第２切替部とを備え、前記分離カラムを前記第１流路に前記第１切替部によって連通させ、前記分離カラムから前記溶媒に溶出する各成分に応じて、前記第１流路に連通させる前記トラップカラムを前記第２切替部によって切り替えて、各成分が溶出した前記溶媒を前記各トラップカラムに流し込むことにより各成分を前記トラップカラムに吸着させ、更に、前記重溶媒供給部を前記第１流路に前記第１切替部によって連通させ、前記第１流路に連通させる前記トラップカラムを前記第２切替部によって切り替えて、前記各トラップカラムに吸着した各成分を前記重溶媒供給部が供給する重溶媒で溶出させて、各成分のＮＭＲ測定用サンプルを製造する高速液体クロマトグラフィー装置を備えたＮＭＲ測定用サンプルの製造装置であって、前記分離カラムから溶出する成分のうち、高極性の成分を吸着する前記トラップカラムが、活性炭カラム（ただし、グラファイトカーボンカラムを除く）であり、更に、前記活性炭カラムの一端側及び他端側の何れか一方を切替可能に前記第２流路に連通させる第３切替部を備えることを特徴とするＮＭＲ測定用サンプルの製造装置（以下、適宜、「第２のＮＭＲ測定用サンプルの製造装置」という。）を提供する。

第２のＮＭＲ測定用サンプルの製造装置においても、高極性の成分を吸着するトラップカラムに活性炭カラムが用いられている。また、第２のＮＭＲ測定用サンプルの製造装置は、活性炭カラムの一端側及び他端側の何れか一方を切替可能に第２流路に連通させる第３切替部を備える。例えば、分離カラムから高極性の成分が溶出した溶媒を活性炭カラムに流すときは一端側を第２流路に連通させ、活性炭カラムに吸着した成分を溶出させる重溶媒を活性炭カラムに流すときは他端側を第２流路に連通させることで、溶媒及び重溶媒が流れる向きを互いに逆にすることができる。
従って、第２のＮＭＲ測定用サンプルの製造装置は、第１のＮＭＲ測定用サンプルの製造装置と同様に、少量の重溶媒でＮＭＲ測定に必要な量の高極性の成分を得ることができ、第１のＮＭＲ測定用サンプルの製造装置と同様の効果を奏する。

本発明は、請求項３又は４に記載の高速液体クロマトグラフィー装置を備えたＮＭＲ測定用サンプルの製造装置と、請求項３又は４に記載のＮＭＲ測定用サンプルの製造装置と、該ＮＭＲ測定用サンプルの製造装置が製造したＮＭＲ測定用サンプルをＮＭＲ測定するＮＭＲ測定装置とを備える分析システムを提供する。

本発明は、ＮＭＲ測定に必要な量の高極性の成分のサンプルを製造可能なＮＭＲ測定用サンプルの製造方法、該製造方法で製造されたサンプルのＮＭＲ測定方法、ＮＭＲ測定に必要な量の高極性の成分のサンプルを製造するＮＭＲ測定用サンプルの製造装置、及び、該装置で製造されたサンプルをＮＭＲ測定する分析システムを提供できる。

図１は、本実施形態の分析システムの模式図である。図２は、第２流路、トラップカラム、第４流路の着脱構造を示す模式図である。図３は、本実施形態の分析システムの模式図である。図４は、成分が主としてトラップカラムの一端側に吸着した状態を示す模式図である。図５は、本実施形態の分析システムの模式図である。図６は、第３切替部の模式図である。図７は、実施例１における化合物Ａの測定結果を示すグラフである。図８は、実施例２における化合物Ａの測定結果を示すグラフである。

以下、図面を用いて、本実施形態の分析システムを説明する。図１は、本実施形態の分析システムの模式図である。本実施形態の分析システムは、ＮＭＲ測定用サンプルの製造装置１００（以下、単に「製造装置１００」という）とＮＭＲ測定装置２００とを備える。製造装置１００は、高速液体クロマトグラフィー装置（以下、「ＨＰＬＣ装置」という。）１１０を備える。

ＨＰＬＣ装置１１０は、溶媒タンク１と、第１ポンプ２と、インジェクター３と、分離カラム４と、第１検出器５とを有する。溶媒タンク１には、溶媒が貯留される。該溶媒には、軽溶媒や重溶媒を用いることができる。該溶媒として、経済的な観点から軽溶媒が好ましい。軽溶媒とは、分子中の水素原子が天然存在比以上に重水素で置換されていない溶媒である。軽溶媒の具体例として、アセトニトリル、水、メタノール等が挙げられる。また、溶媒タンク１に貯留される溶媒として、軽溶媒を複数混合したものを用いることもできる。

第１ポンプ２は、溶媒タンク１に貯留された溶媒をインジェクター３側に送液する。第１ポンプ２は、１個に限定されず、複数個であってもよい。インジェクター３は、第１ポンプ２で送液された溶媒に試料を注入する。分離カラム４は、インジェクター３によって溶媒に注入され、該溶媒に溶解した試料を構成する複数の成分を分離して、分離した各成分を順次（時間差をおいて）溶媒に溶出する。本実施形態では、分離カラム４には逆相カラムが用いられている。第１検出器５は、分離カラム４を通過した溶媒に試料を構成する成分が含まれているか否かに基づいて、分離カラム４から成分が溶出しているか否かを検出する。本実施形態では、第１検出器５には、紫外線検出器が用いられている。尚、第１検出器５は、紫外線検出器に限定されず、例えば、示差屈折計検出器や熱伝導度検出器等を用いることもできる。

また、製造装置１００は、重溶媒供給部６を備える。重溶媒供給部６は、重溶媒が貯留される重溶媒タンク７と、該重溶媒を送液する第２ポンプ８とを有する。第２ポンプ８は、１個に限定されず、複数個であってもよい。重溶媒とは、分子に含まれる水素原子の一部または全部を重水素に置き換えた溶媒である。重溶媒の具体例として、重水（Ｄ_２Ｏ）、重メタノール（メタノール−ｄ_４）、重アセトニトリル（アセトニトリル−ｄ_３）等が挙げられる。また、重溶媒タンク７に貯留される重溶媒として、重溶媒を複数混合したものを用いることもできる。

また、製造装置１００は第１切替部９を備え、第１切替部９は、第１検出器５を及び重溶媒供給部６の何れか一方を切替可能に第１流路１０の一端側に連通させる。また、第１流路１０の他端側は、第２切替部１１によって、各第２流路１２ａ〜１２ｅ及び第３流路１３の何れか１つの一端側と、切替可能に連通している。

各第２流路１２ａ〜１２ｅの他端側には、複数の各トラップカラム１４ａ〜１４ｅの一端側Ａがそれぞれ連通可能に取り付けられている。尚、本実施形態では、トラップカラムの数は５であるが、トラップカラムの数は限定されるものでなく、試料を構成する成分の数に応じて変更することができる。図２に示す第２流路１２ａのように、各第２流路１２ａ〜１２ｅの他端側は、外周面にネジ溝２１が形成されている。

各トラップカラム１４ａ〜１４ｅは、分離カラム４から溶出する各成分を吸着する。各トラップカラム１４ａ〜１４ｅのうち少なくとも１つのトラップカラムには、空カラムに充填される充填剤が活性炭である活性炭カラムが用いられている（本実施形態では、トラップカラム１４ａが活性炭カラムであり、適宜、トラップカラム１４ａを「活性炭カラム１４ａ」という。）。充填剤として用いられる活性炭には、木材、褐炭、泥炭などを活性化剤としての薬品（塩化亜鉛、リン酸など）で処理して乾留した炭、あるいは木炭などを水蒸気で活性化された炭を用いることができる。このような炭は、吸着力が強く、大部分が炭素質で形成されている。充填剤として用いられる活性炭は、細孔径が２５０Åよりも小さいか、比表面積が１２０ｍ^２／ｇよりも大きいことが好ましく、細孔径が１２〜２００Å及び／または比表面積が５００〜２５００ｍ^２／ｇであることが更に好ましい。活性炭の細孔径及び比表面積は、例えば、ＪＩＳ規格のＫ１４７４の方法で測定することができる。尚、本実施形態では、他のトラップカラム１４ｂ〜１４ｅの充填剤は、特に限定されず、公知の物を用いることができる。

図２に示すトラップカラム１４ａのように、各トラップカラム１４ａ〜１４ｅは、一端側Ａ及び他端側Ｂのそれぞれに接続部３１ａ、３１ｂが設けられている。接続部３１ａ、３１ｂは、トラップカラム１４ａの一端側Ａ及び他端側Ｂに設けられたトラップカラム１４ａの内部と外部とを連通させる連通孔３２ａ、３２ｂから、トラップカラム１４ａの内側に延びるように形成されている。接続部３１ａ、３１ｂの内側には、各第２流路１２ａ〜１２ｅに形成されたネジ溝２１と対応するネジ溝（図示しない）が形成されている。このような接続部３１ａ、３１ｂにより、各トラップカラム１４ａ〜１４ｅは、一端側Ａ及び他端側Ｂのそれぞれが各第２流路１２ａ〜１２ｅの他端側に着脱可能とされている。

図１に示すように、各トラップカラム１４ａ〜１４ｅの他端側Ｂには、複数の各第４流路１５ａ〜１５ｅの一端側がそれぞれ連通可能に取り付けられている。図２に示す第４流路１５ａのように、各第４流路１５ａ〜１５ｅの一端側には、各トラップカラム１４ａ〜１４ｅの接続部３１ａ、３１ｂに形成されたネジ溝に対応するネジ溝４１が外周面に形成されている。このようなネジ溝４１により、各第４流路１５ａ〜１５ｅは、各トラップカラム１４ａ〜１４ｅの一端側Ａ及び他端側Ｂのそれぞれに着脱可能とされている。

図１に示すように、各第４流路１５ａ〜１５ｅ及び第３流路１３の何れか１つの他端側が、第４切替部１６によって、切替可能に第５流路１７の一端側に連通している。第５流路１７の他端側は、第５切替部１８によって、廃液口１９及び第２検出器２０を介してＮＭＲ測定装置２００の何れか一方と切替可能に連通している。第２検出器２０は、第５流路１７から流れて来た溶媒に試料を構成する成分が含まれているか否かを検出する。ＮＭＲ測定装置２００は、第２検出器２０の検出タイミングに基づいてＮＭＲ測定を行う。本実施形態では、第２検出器２０には、紫外線検出器が用いられている。尚、第２検出器２０は、紫外線検出器に限定されず、例えば、示差屈折計検出器や熱伝導度検出器等を用いることもできる。

以上に説明した分析システムを用いて、ＮＭＲ測定を行うことについて説明する。まず、図１に示すように、第１切替部９によって第１検出器５と第１流路１０とを連通させ、第２切替部１１によって第１流路１０と第３流路１３とを連通させ、第４切替部１６によって第３流路１３と第５流路１７とを連通させ、第５切替部１８によって第５流路１７と廃液口１９とを連通させる。次に、第１ポンプ２で溶媒タンク１に貯留されている溶媒を送液し、インジェクター３で試料を該溶媒に注入する。注入された試料は、溶媒に溶解した状態で分離カラム４に送られる。送られた試料の各成分が分離カラム４から溶出するまでの間は、第１ポンプ２で送液された溶媒は、第１検出器５、第１流路１０、第３流路１３、及び、第５流路１７を介して廃液口１９に排出される。

分離カラム４から試料の成分が溶出し、第１検出器５が分離カラム４から成分が溶出していることを最初に検出すると、第２切替部１１は第１流路１０と第２流路１２ａとを連通させ、第４切替部１６は第４流路１５ａと第５流路１７とを連通させる。これにより、第１ポンプ２で送液された溶媒は、第１検出器５、第１流路１０、第２流路１２ａ、活性炭カラム１４ａの一端側Ａ、活性炭カラム１４ａの他端側Ｂ、第４流路１５ａ、及び、第５流路１７を介して廃液口１９に排出される。このように、活性炭カラム１４ａを溶媒が流れることで、最初に溶出した成分の吸着が活性炭カラム１４ａで行われることになる。

その後、最初に溶出した成分が分離カラム４から溶出しなくなり、第１検出器５が分離カラム４から成分が溶出していないことを検出すると、第２切替部１１は第１流路１０と第３流路１３とを連通させ、第４切替部１６は第３流路１３と第５流路１７とを連通させる。これにより、第１ポンプ２で送液された溶媒は、再び、第１検出器５、第１流路１０、第３流路１３、及び、第５流路１７を介して廃液口１９に排出される。

その後、再び第１検出器５が分離カラム４から成分が溶出したことを検出すると、この２回目の検出時においては、第２切替部１１は第１流路１０と第２流路１２ｂとを連通させ、第４切替部１６は第４流路１５ｂと第５流路１７とを連通させる。これにより、第１ポンプ２で送液された溶媒は、第１検出器５、第１流路１０、第２流路１２ｂ、活性炭カラム１４ｂの一端側Ａ、活性炭カラム１４ｂの他端側Ｂ、第４流路１５ｂ、及び、第５流路１７を介して廃液口１９に排出される。これにより、２番目に溶出した成分の吸着はトラップカラム１４ｂで行われることになる。

その後、２番目に溶出した成分が分離カラム４から溶出しなくなり、第１検出器５が分離カラム４から成分が溶出していないことを検出すると、第２切替部１１は第１流路１０と第３流路１３とを連通させ、第４切替部１６は第３流路１３と第５流路１７とを連通させる。

以上のように、分離カラム４から各成分が溶出すると、溶媒が流れる流路が第２切替部１１及び第４切替部１６によって切り替えられ、各成分の吸着が異なるトラップカラム１４ａ〜１４ｅで行われる。

上述のように、本実施形態では、分離カラム４に逆相カラムが用いられているため、極性が高い順で、各成分が分離カラム４から溶媒に溶出する。また、上述のように、本実施形態では、最初に溶出した成分の吸着が活性炭カラム１４ａで行われる。このため、試料において最も極性の高い成分の吸着が活性炭カラム１４ａで行われることになる。活性炭カラム１４ａは吸着力が非常に高いため、高極性の成分でも充分に吸着する。このため製造装置１００によれば、試料において最も極性の高い高極性の成分も充分に吸着することができる。

以上のように、各トラップカラム１４ａ〜１４ｅで各成分を吸着させると、再び、上記においてインジェクター３で注入した試料と同種の試料を再びインジェクター３で注入し、該試料を構成する各成分の吸着を上記のように行う。このような各成分の吸着は繰り返し行うことができ、例えば、１回当りの吸着量が１μｇであり、ＮＭＲ測定に必要な量が１０μｇである場合は、１０回以上行うことが好ましい。

次に、各トラップカラム１４ａ〜１４ｅに残留している溶媒、即ち、各成分をトラップカラム１４ａ〜１４ｅに吸着させる際に第１ポンプ２で送液された溶媒を重溶媒に置換する。具体的には、図３に示すように、第１切替部９によって重溶媒供給部６と第１流路１０とを連通させ、第２切替部１１によって第１流路１０と第２流路１２ａとを連通させ、第４切替部１６によって第４流路１５ａと第５流路１７とを連通させ、第５切替部１８によって第５流路１７と廃液口１９とを連通させる。そして、重溶媒供給部６の第２ポンプ８によって重溶媒タンク７に貯留された重溶媒を第１流路１０側に送液する。これにより、重溶媒が第１流路１０、第２流路１２ａを通って、活性炭カラム１４ａに流れ込み、活性炭カラム１４ａに残留している溶媒が活性炭カラム１４ａの他端側から流出し、該溶媒が重溶媒に置換される。このように、活性炭カラム１４ａについて溶媒の置換を行った後、第２切替部１１、及び、第４切替部１６によって、重溶媒が供給されるトラップカラム１４ｂ〜１４ｅを切り替えて、他のトラップカラム１４ｂ〜１４ｅについても溶媒の置換を行う。

次に、各トラップカラム１４ａ〜１４ｅのうち、一端側Ａに成分が主として吸着しているトラップカラムについて、一旦、第２流路、及び、第４流路から取り外し、該トラップカラムの一端側Ａを第４流路に装着し、他端側Ｂを第２流路に装着する。例えば、活性炭カラム１４ａの場合は、吸着力が非常に高いため、高極性の成分は、図４（ａ）に示すように活性炭カラム１４ａの一端側Ａに主として吸着する。このため、活性炭カラム１４ａについては、上述のように、一旦、第２流路１２ａ、及び、第４流路１５ａから取り外し、図４（ｂ）に示すように、一端側Ａを第４流路１５ａに装着し、他端側Ｂを第２流路１２ａに装着する。尚、図５に示すように、本実施形態では、活性炭カラム１４ａ〜１４ｅのうち、活性炭カラム１４ａのみ、一端側Ａを第４流路に装着し、他端側Ｂを第２流路に装着したものとする。

次に、図５に示すように、第１切替部９によって重溶媒供給部６と第１流路１０とを連通させ、第２切替部１１によって第１流路１０と第２流路１２ａとを連通させ、第４切替部１６によって第４流路１５ａと第５流路１７とを連通させ、第５切替部１８によって第５流路１７とＮＭＲ測定装置２００とを第２検出器２０を介して連通させる。次に、重溶媒供給部６の第２ポンプ８で重溶媒タンク７に貯留された重溶媒を第１流路１０側に送液する。これにより、重溶媒が第１流路１０、第２流路１２ａ、活性炭カラム１４ａの他端側Ｂ、活性炭カラム１４ａの一端側Ａ、第４流路１５ａ、第５流路１７、及び、第２検出器２０を介してＮＭＲ測定装置２００に送液される。図４（ｂ）に示すように、高極性の成分は一端側Ａに吸着しているので、少量の重溶媒で高極性の成分を活性炭カラム１４ａから溶出させることができる。

よって、製造装置１００によれば、少量の重溶媒で活性炭カラム１４ａに吸着したＮＭＲ測定に必要な量の高極性の成分を製造することができる。また、少量の重溶媒でＮＭＲ測定に必要な量の高極性の成分を溶出できるため、高極性の成分の濃度が高い重溶媒を得ることができる。従って、たとえ、ＮＭＲ装置２００のＮＭＲ測定用のプローブの容積が小さい場合であっても、ＮＭＲ測定に必要な量の高極性の成分を該プローブに収容できる。このため、製造装置１００によれば、このような場合であっても、高極性の成分について適正なＮＭＲ測定が可能である。

高極性の成分のＮＭＲ測定が終了すると、第２切替部１１、及び、第４切替部１６によって、重溶媒が供給されるトラップカラム１４ｂ〜１４ｅを切り替えて、他のトラップカラム１４ｂ〜１４ｅに吸着した成分についても、同様に溶出させてＮＭＲ測定を行う。これによりＮＭＲ測定が終了する。

また、上述のように、各トラップカラム１４ａ〜１４ｅを第２流路１２ａ〜１２ｅ及び第４流路１５ａ〜１５ｅに対して着脱すること無く、各トラップカラム１４ａ〜１４ｅの一端側Ａに主として吸着した成分を少量の重溶媒で溶出させる構成として、例えば、図６に示す第３切替部５０を備えた構成を挙げることができる。図６に示すように、第３切替部５０は、第１切替弁５１と第２切替弁５２とを備える。第１切替弁５１の第１流入出口５１ａは、第２流路１２ａに連通している。第２流入出口５１ｂは、活性炭カラム１４ａの一端側Ａに連通している。第３流入出口５１ｃは、第２切替弁５２の第１流入出口５２ａに連通している。第４流入出口５１ｄは、第２切替弁５２の第３流入出口５２ｃに連通している。第２切替弁５２の第２流入出口５２ｂは、活性炭カラム１４ａの他端側Ｂに連通している。第４流入出口５２ｄは、第４流路１５ａに連通している。図６（ａ）に示すように、第１切替弁５１の第１流入出口５１ａと第２流入出口５１ｂとが連通し、第１切替弁５１の第３流入出口５１ｃと第４流入出口５１ｄとが連通し、第２切替弁５２の第１流入出口５２ａと第３流入出口５２ｃとが連通し、第２切替弁５２の第２流入出口５２ｂと第４流入出口５２ｄとが連通した状態では、活性炭カラム１４ａの一端側Ａが第２流路１２ａに連通し、活性炭カラム１４ａの他端側Ｂが第４流路１５ａに連通している。即ち、この状態では、溶媒又は重溶媒は、活性炭カラム１４ａの一端側Ａから他端側Ｂに流れ込む。一方、図６（ｂ）に示すように、第１切替弁５１の第１流入出口５１ａと第３流入出口５１ｃとが連通し、第１切替弁５１の第２流入出口５１ｂと第４流入出口５１ｄとが連通し、第２切替弁５２の第１流入出口５２ａと第２流入出口５２ｂとが連通し、第２切替弁５２の第３流入出口５２ｃと第４流入出口５２ｄとが連通した状態では、活性炭カラム１４ａの他端側Ｂが第２流路１２ａに連通し、活性炭カラム１４ａの一端側Ａが第４流路１５ａに連通している。即ち、この状態では、溶媒又は重溶媒は、活性炭カラム１４ａの他端側Ｂから一端側Ａに流れる。よって、図６に示す第３切替部５０によれば、活性炭カラム１４ａにおける溶媒及び重溶媒の流れる向きを他端側Ｂから一端側Ａにすることができるので、活性炭カラム１４ａを第２流路１２ａ及び第４流路１５ａに対して着脱すること無く、活性炭カラム１４ａの一端側Ａに主として吸着した成分を少量の重溶媒で溶出させることができる。

尚、各トラップカラム１４ａ〜１４ｅに残留している溶媒を重溶媒に置換する置換用の重溶媒と、各トラップカラム１４ａ〜１４ｅに吸着した成分を溶出させる重溶媒は、同じ種類のものであっても異なる種類のものであってもよい。置換用の重溶媒には、置換の際にトラップカラム１４ａ〜１４ｅに吸着した成分が溶出し難い重溶媒を用いることが好ましい。また、各トラップカラム１４ａ〜１４ｅに吸着した成分を溶出させる重溶媒には、溶出させる成分が溶解し易い重溶媒を用いることが好ましい。

以下に実施例及び比較例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、これらは本発明を限定するものではない。

溶媒タンク１から第１流路１０、第３流路１３、第５流路１７を介して廃液口１９に下記溶媒が排出されるようにした状態で、第１ポンプ２で下記流速で下記溶媒を送液すると共に、高極性の化合物Ａを含む試料をインジェクター３で注入した。尚、活性炭カラム１４ａの一端側Ａが第２流路１２ａに、活性炭カラム１４ａの他端側Ｂが第４流路１５ａに取り付けられていた。実施例１におけるＨＰＬＣ装置１１０等の詳細について下記に示す。
ＨＰＬＣ装置１１０：（株）島津製作所製、製品名「Shimadzu LC-10A CLASS-vp」
分離カラム４：ジーエルサイエンス（株）製、製品名「Inertsil（登録商標）３ series」、粒子径5μm、内径4.6mm、長さ250mm
溶媒：5 mmol/l AcONH₄：CH₃CN＝9：1（isocratic）
溶媒の流速：1.0 mL/min
分離カラム４の温度：40℃
試料における化合物Ａの濃度：10 mg/mL（溶媒：水）
化合物Ａの注入量：10 μL
また、化合物Ａは、（４Ｒ、５Ｓ、６Ｓ）−６−［（１Ｒ）−１−ヒドロキシエチル］−４−メチル−３−（｛４−［（５Ｓ）−５−メチル−２、５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−３−イル］−１、３−チアゾール−２−イル｝スルファニル）−７−オキソ−１−アザビシクロ［３．２．０］ヘプト−２−エン−２−カルボン酸である（化合物Ａの製造については、国際公開番号WO02/38564号公報参照）。また、実施例１及び下記実施例２〜４においては、内径４．６ｍｍ、長さ３０ｍｍのＨＰＬＣ用空カラムに、約５００ｍｇの活性炭（細孔径１２〜２００Å、比表面積５００〜２５００ｍ^２／ｇ）を充填して作製したものを活性炭カラム１４ａとして用いた。

化合物Ａが分離カラム４で分離された後、第１流路１０と第２流路１２ａと、第４流路１５ａと第５流路１７を連通させて、化合物Ａを活性炭カラム１４ａに吸着させた。その後、溶媒を第１ポンプ２で約１時間送液し続けたが、この間に活性炭カラム１４ａの他端側Ｂから化合物Ａが溶出していることは確認できなかった。その後、活性炭カラム１４ａの一端側Ａを第４流路１５ａに、他端側Ｂを第２流路１２ａに取り付け、更に、第１切替部９によって重溶媒供給部６と第１流路１０とを連通させ、第５切替部１８によって、第５流路１７と検出器２０を介してＮＭＲ測定装置２００と連通させた。そして、重溶媒供給部６から重メタノールを活性炭カラム１４ａに供給し、活性炭カラム１４ａの他端側Ｂから一端側Ａに重メタノールを流し、活性炭カラム１４ａの一端側Ａから流出する化合物Ａを第２検出器２０で確認した（図７参照）。尚、第２検出器２０には紫外線検出器を用い、検出波長を２５４nｍとした。図７の縦軸は紫外線強度、横軸は時間である。紫外線強度のピークが現れた時間は、化合物Ａに対応するものであった。また、強度は、ＮＭＲ測定に必要な量に対応するものであった。よって、実施例１により、高極性の化合物ＡのＮＭＲ用サンプルを製造することができたことが確認できた。尚、実施例１では、化合物Ａを活性炭カラム１４ａから溶出させる重溶媒として重メタノールを用いたが、活性炭カラム１４ａから溶出させる重溶媒は化合物の物性に応じて選択でき、本発明においては、活性炭カラム１４ａに吸着した成分を溶出させる重溶媒は、重メタノールに限定されない。

実施例２において、溶媒を第１ポンプ２で約１時間送液し続けるまでは、実施例１と同様である。実施例２では、この後、活性炭カラム１４ａの一端側Ａを第４流路１５ａに、他端側Ｂを第２流路１２ａに取り付けることをせず、第１切替部９によって、重溶媒供給部６と第１流路１０とを連通させ、第５切替部１８によって、第５流路１７と検出器２０を介してＮＭＲ測定装置２００と連通させた。その後、重溶媒供給部６から重水を活性炭カラム１４ａに供給して、活性炭カラム１４ａに残留した溶媒を重水で置換した。尚、置換は１８分行った。置換中、活性炭カラム１４ａの他端側Ｂから化合物Ａが溶出していることは第２検出器２０により確認できなかった（図８参照）。第２検出器２０には、実施例１と同様に、紫外線検出器を用い、検出波長を２５４ｎｍとした。図８の縦軸は紫外線強度、横軸は時間である。このことから、置換用の重溶媒として重水を用いれば、活性炭カラム１４ａに吸着した化合物Ａを溶出させることなく置換ができることが分かった。

リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）１０ｍＬに溶解した化合物Ａ（１００ｍｇ）とシステイン塩酸塩（１４８ｍｇ）の混合物を３７℃で４４時間加熱攪拌して得られた化合物のうち任意の１つの化合物Ｂを含む試料を作製した。溶媒タンク１から第１流路１０、第３流路１３、第５流路１７を介して廃液口１９に下記溶媒が排出されるようにした状態で、第１ポンプ２で下記流速で下記溶媒を送液し、作製した試料をインジェクター３で注入した。実施例３におけるＨＰＬＣ装置等の詳細について下記に示す。
ＨＰＬＣ装置１１０：（株）島津製作所製、製品名「Shimadzu LC-10A CLASS-vp」
分離カラム４：（株）資生堂、製品名「SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG」、内径20 mm、長さ250 mm
溶媒：10 mmol/l AcONH₄（pH 7.0）：CH₃CN＝9：1
溶媒の流速：2.0 mL/min
分離カラム４の温度：25℃
試料における化合物Ｂの濃度：20 mg/mL（溶媒：水）
化合物Ｂの注入量：200 μL

分離カラム４における保持時間が約４０分経過した段階で、第１流路１０と第２流路１２ａと、第４流路１５ａと第５流路１７を連通させて、分離カラム４における保持時間が４０分程度の化合物Ｂを活性炭カラム１４ａに吸着させた。該吸着時においては、活性炭カラム１４ａの一端側Ａが第２流路１２ａに、他端側Ｂが第４流路１５ａに取り付けられていた。その後、活性炭カラム１４ａの一端側Ａを第４流路１５ａに、他端側Ｂを第２流路１２ａに取り付け、重溶媒供給部６と第１流路１０とを連通させ、第５流路１７とＮＭＲ測定装置２００とを第２検出器２０を介して連通させた。その後、重溶媒供給部６から重アセトニトリルを活性炭カラム１４ａに供給し、活性炭カラム１４ａに吸着した化合物Ｂを活性炭カラム１４ａから溶出させ、化合物Ｂが溶出した重溶媒を第２検出器２０で検出して、ＮＭＲ装置２００のＮＭＲ測定用のプローブに送液した。その結果、化合物ＢのＮＭＲ測定を適正に行うことができた。

リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）１０ｍＬに溶解した化合物Ａ（１００ｍｇ）とシステイン塩酸塩（１４８ｍｇ）の混合物を３７℃で４４時間加熱攪拌して得られた化合物のうち化合物Ｂと異なる任意の１つの化合物Ｃを含む試料を作製した。化合物Ｂに代えて化合物Ｃが試料に含まれている点、分離カラム４における保持時間が約５０分経過した段階で、第１流路１０と第２流路１２ａを連通させ、第４流路１５ａと第５流路１７とを連通させた点を除いて、実施例３と同条件で、化合物ＣのＮＭＲ測定を行った。実施例４においても、化合物ＣのＮＭＲ測定を適正に行うことができた。

比較例

実施例１〜４でトラップカラムとして用いた活性炭カラムを表１に示す種々のカラムに変更し、実施例１と同様の条件でそれぞれのカラムについて化合物Ａの吸着を試みた。

標準となる粒子径５μｍのＣ１８逆相カラム（比較例１）に比べて、粒子径が小さいカラム（比較例２、３）および固定相のアルキル鎖が長いカラム（比較例４）は保持能力が高いので、高極性化合物をトラップするには適したカラムであると考えられるが、何れのカラムにおいても化合物Ａは吸着されなかった。高極性化合物の分離に有用であるとされるグラファイトカーボンカラム（比較例５）においても化合物Ａはトラップされなかった。グラファイトカーボンは、活性炭よりも細孔径が大きく比表面積が小さいことから、吸着力の差が影響したと考えられる。高極性化合物の分離に有用であると考えられるその他のカラム（比較例６、７）も化合物Ａはトラップされなかった。

本発明に係るＮＭＲ測定用サンプルの製造方法、ＮＭＲ測定方法、ＮＭＲ測定用サンプルの製造装置、及び、分析システムを用いると、今まで困難であった高極性の成分のＮＭＲ測定が容易に実施できるようになる。すなわち、本発明は、高極性の医薬品または医薬品候補化合物の代謝混合物の構造解析が可能になる。従って、本発明は、創薬研究に大きな貢献を成し得る。

２…第１ポンプ、８…第１ポンプ、９…第１切替部、１０…第１流路、１１…第２切替部、１２ａ〜１２ｅ…第２流路、１３…第３流路、１５ａ〜１５ｅ…第４流路、１６…第４切替部、１７…第５流路、Ａ…一端側、Ｂ…他端側

Claims

高速液体クロマトグラフィー装置を備えたＮＭＲ測定用サンプルの製造装置を用いて、溶媒に溶解した高極性の成分を含む試料を構成する複数の成分を分離カラムで分離して、各成分を該分離カラムから順次前記溶媒に溶出し、溶出した各成分に応じて、複数のトラップカラムの中から前記分離カラムと連通するトラップカラムを切り替えて、各成分が溶出した前記溶媒を前記各トラップカラムの一端側から他端側に流し込むことにより、各成分を前記各トラップカラムに吸着させ、前記各トラップカラムに吸着した各成分を重溶媒で溶出して、各成分のＮＭＲ測定用サンプルを製造する方法であって、
前記分離カラムから溶出する成分のうち、高極性の成分を吸着する前記トラップカラムに活性炭カラム（ただし、グラファイトカーボンカラムを除く）を用い、
前記活性炭カラムの前記他端側から前記一端側に前記重溶媒を流すことにより、前記高極性の成分を前記活性炭カラムから溶出させることを特徴とするＮＭＲ測定用サンプルの製造方法。
請求項１に記載の製造方法で製造されたＮＭＲ測定用サンプルをＮＭＲ測定することを特徴とするＮＭＲ測定方法。
溶媒に溶解した高極性の成分を含む試料を構成する複数の成分を分離して、順次前記溶媒に溶出させる分離カラムと、
前記分離カラムから溶出する各成分をぞれぞれ吸着する複数のトラップカラムと、
重溶媒を供給する重溶媒供給部と、
第１流路と、
前記各トラップカラムがそれぞれ連通可能に取り付けられる複数の第２流路と、
前記分離カラム及び前記重溶媒供給部の何れか一方を切替可能に前記第１流路の一端側に連通させる第１切替部と、
前記第２流路の何れか１つを切替可能に前記第１流路の他端側に連通させる第２切替部とを備え、
前記分離カラムを前記第１流路に前記第１切替部によって連通させ、前記分離カラムから前記溶媒に溶出する各成分に応じて、前記第１流路に連通させる前記トラップカラムを前記第２切替部によって切り替えて、各成分が溶出した前記溶媒を前記各トラップカラムに流し込むことにより各成分を前記トラップカラムに吸着させ、更に、前記重溶媒供給部を前記第１流路に前記第１切替部によって連通させ、前記第１流路に連通させる前記トラップカラムを前記第２切替部によって切り替えて、前記各トラップカラムに吸着した各成分を前記重溶媒供給部が供給する重溶媒で溶出させて、各成分のＮＭＲ測定用サンプルを製造する高速液体クロマトグラフィー装置を備えたＮＭＲ測定用サンプルの製造装置であって、
前記分離カラムから溶出する成分のうち、高極性の成分を吸着する前記トラップカラムが、活性炭カラム（ただし、グラファイトカーボンカラムを除く）であり、
前記活性炭カラムは、前記溶媒及び前記重溶媒の流れる向きが互いに逆になるように、一端側及び他端側のそれぞれが前記第２流路に着脱可能な構成とされていることを特徴とするＮＭＲ測定用サンプルの製造装置。
溶媒に溶解した高極性の成分を含む試料を構成する複数の成分を分離して、順次前記溶媒に溶出させる分離カラムと、
前記分離カラムから溶出する各成分をぞれぞれ吸着する複数のトラップカラムと、
重溶媒を供給する重溶媒供給部と、
第１流路と、
前記各トラップカラムがそれぞれ連通可能に取り付けられる複数の第２流路と、
前記分離カラム及び前記重溶媒供給部の何れか一方を切替可能に前記第１流路の一端側に連通させる第１切替部と、
前記第２流路の何れか１つを切替可能に前記第１流路の他端側に連通させる第２切替部とを備え、
前記分離カラムを前記第１流路に前記第１切替部によって連通させ、前記分離カラムから前記溶媒に溶出する各成分に応じて、前記第１流路に連通させる前記トラップカラムを前記第２切替部によって切り替えて、各成分が溶出した前記溶媒を前記各トラップカラムに流し込むことにより各成分を前記トラップカラムに吸着させ、更に、前記重溶媒供給部を前記第１流路に前記第１切替部によって連通させ、前記第１流路に連通させる前記トラップカラムを前記第２切替部によって切り替えて、前記各トラップカラムに吸着した各成分を前記重溶媒供給部が供給する重溶媒で溶出させて、各成分のＮＭＲ測定用サンプルを製造する高速液体クロマトグラフィー装置を備えたＮＭＲ測定用サンプルの製造装置であって、
前記分離カラムから溶出する成分のうち、高極性の成分を吸着する前記トラップカラムが、活性炭カラム（ただし、グラファイトカーボンカラムを除く）であり、
更に、前記活性炭カラムの一端側及び他端側の何れか一方を切替可能に前記第２流路に連通させる第３切替部を備えることを特徴とするＮＭＲ測定用サンプルの製造装置。
請求項３又は４に記載の高速液体クロマトグラフィー装置を備えたＮＭＲ測定用サンプルの製造装置と、
該ＮＭＲ測定用サンプルの製造装置が製造したＮＭＲ測定用サンプルをＮＭＲ測定するＮＭＲ測定装置とを備える分析システム。