JPH075160A - 液体クロマトグラフィー - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 第１カラム及び第２カラムを連結した液体ク
ロマトグラフィーにおいて、第１カラム（７）と第２カ
ラム（２３）との間に複数の空カラム（１５）及び複数
の濃縮カラム（２１）を連結し、良溶媒（２）と第１の
貧溶媒（４）との混合溶媒からなる第１の溶離液を用い
て試料（Ｓ）を第１カラムに送給して成分を粗分離し、
第１カラムから溶出した各フラクションを各空カラムに
採取し、次いで第１の溶離液で各空カラムのフラクショ
ンを流出させ、これに第２の貧溶媒を加えて各濃縮カラ
ムに導入し、各フラクション中の成分を各濃縮カラム中
に捕捉させた後、第２の溶離液を用い濃縮カラム中の成
分を溶出して第２カラムに送給し分離する液体クロマト
グラフィー。 【効果】 試料を１回注入するのみで、多成分系で、か
つアミノ酸の光学分割のような複雑な分離が可能であ
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、液体クロマトグラフィ
ーに基づく成分の分離方法及びその装置に関し、特にア
ミノ酸のＤＬ分割など多成分系の高分離・精製及び分析
の自動化に好適な液体クロマトグラフィーに関する。

【０００２】

【従来の技術】複雑な物質又は構造の類似した物質の混
合物を液体クロマトグラフィーで分析した場合、単一の
分離カラムでは試料中の各成分を分離できないことが多
い。この場合、分離カラム又は溶離液あるいはその両者
の種類を替えて複数回分析しなければならない。しか
し、複数回分析するには多数の装置及び多くの分析時間
を必要とする。更に試料を複数回注入するので、貴重な
試料を浪費する場合も多い。最近、互いに分離モードの
異なる第１カラム及び第２カラムを連結して成分の分離
を行うことが考えられ、分子量で分離するＧＰＣカラム
と極性で分離する逆相カラムを連結した液体クロマトグ
ラフィーを用いる手法が提案されている（特開昭６１−
１４０８６１号及び特開平２−１７１６５３号各公
報）。

【０００３】ＧＰＣカラムと逆相カラム連結をした液体
クロマトグラフィーの系では逆相カラムの背圧がＧＰＣ
カラムにかかり、３次元重合ポリマーのゆえ圧力に弱い
構造のＧＰＣカラム充填剤が損傷しやすい。そのため、
単管又はバルブを介したＧＰＣカラムと逆相カラムの直
接連結法は実用的に不可能であり、現実的に上記の背圧
の問題を考慮して第１カラムと第２カラムの中間にトラ
ップ又は濃縮カラムを介在させ、第１カラムからの溶出
液をトラップ管にトラップした後、そのトラップ液に水
を加えて濃縮カラムに導入し、目的成分を濃縮して第２
カラムで分析し、良好なピークを得る方法が報告されて
いる。

【０００４】しかしこの流路構成では空ループから濃縮
カラムにて濃縮を行い、溶離液の流路方向を逆にし、第
２カラムに成分を導入している。この場合、ＧＰＣカラ
ムと逆相カラムの組合せでは分離モードが異なるため分
離にはさほどの支障はないが、例えば第１カラム及び第
２カラム共逆相ＯＤＳ系カラムを用いてアミノ酸誘導体
を分析する場合、濃縮カラムは第１カラムでのＤＬ体の
粗分離を保った状態で濃縮するが、第２カラムへ成分を
導入する際、流路構成上溶離液を濃縮操作と逆方向へ流
さざるをえず、濃縮カラム中で粗分離していたピークが
再び一体化し、第２カラムで改めて分離するため分離効
率が悪い。更にトラップ管が１本しかないため再分析を
必要とするピーク群が複数ある場合、希望するピーク群
が溶出するたびにメインポンプを止め第２カラムで分析
を行うか、そのつど試料を注入し目的とするピークを個
々に分析することとなり分析操作は非常に煩雑となる。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、かかる問題
を解決し、単一の分析条件では分離不可能であった構造
の類似した複雑な多成分の分離を可能とし、一度の注入
で多種の分離結果が得られる液体クロマトグラフィーを
提供することを目的とする。

【０００６】

【課題を解決するための手段及び作用】本発明者らは、
上記問題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、第１カ
ラム及び第２カラムの間に、複数の空カラム及び複数の
濃縮カラムを連結し、それらの操作を特定した液体クロ
マトグラフィーは、上記目的を達成することを見出し、
本発明に到達した。

【０００７】すなわち、本発明は第１カラム及び第２カ
ラムを連結した液体クロマトグラフィーにおいて、第１
カラム（７）と第２カラム（２３）との間に複数の空カ
ラム（１５）及び複数の濃縮カラム（２１）を連結し、
良溶媒（２）と第１の貧溶媒（４）との混合溶媒からな
る第１の溶離液を用いて試料（Ｓ）を第１カラム（７）
に送給して成分を粗分離し、第１カラム（７）から溶出
した各フラクションを各空カラム（１５）に採取し；次
いで第１の溶離液で各空カラム（１５）のフラクション
を流出させ、これに第２の貧溶媒（１８）を加えて各濃
縮カラム（２１）に導入し、各フラクション中の成分を
各濃縮カラム（２１）中に捕捉させた後、第２の溶離液
を用い濃縮カラム（２１）中の成分を溶出させて第２カ
ラム（２３）に送給し分離することを特徴とする液体ク
ロマトグラフィーであり、特に、第１カラム（７）及び
第２カラム（２３）とも逆相分配型カラムである液体ク
ロマトグラフィーであり、更にそれを用いてアミノ酸を
光学分割する方法である。

【０００８】以上は、試料の一度の注入で複雑な物質の
混合物又は構造の類似した試料成分の高分離、高精度分
析を確実、かつ自動的に遂行できる分離方法とそのシス
テムであり、以下の特徴を有している。流路構成が一
方向であり、いかなるカラム等を用いた場合でも、濃縮
カラムから第２カラムへ成分を導入する際に流路の逆転
による分離効率の悪化がない。複数の空カラム及び複
数の濃縮カラムを有しているので、１回の分析で複数成
分の再分離を効率良く行うことができる。

【０００９】

【実施例】図１には本発明の液体クロマトグラフィーの
実施に用いるマルチカラム高速液体クロマトグラフの一
例を示す。以下図１に基づいて本発明を説明する。試料
Ｓの、注入口１には良溶媒２を注入する注入ポンプ３
と、第１の貧溶媒４を注入する注入ポンプ５が連結され
ている。良溶媒としては、親水性有機溶媒が用いられ、
その例として一般的に、メタノール、エタノール、プロ
パノール又はアセトニトリルなどが挙げられる。

【００１０】第１の貧溶媒としては、水溶液が用いら
れ、例えば、コハク酸、シュウ酸、酢酸等の有機酸又は
リン酸等の無機酸、あるいはそれ等の酸の塩の水溶液が
挙げられる。塩を形成するカチオン成分としては、リチ
ウム、ナトリウム、カリウム、アンモニウムなどが好ま
しい。水溶液のpHは中性が望ましく、一般には４〜９．
５、好ましくは５〜７．５の範囲である。また、必要に
応じて、クラウンエーテル又はデキストリン等の包接化
合物が少量添加されてもよい。

【００１１】良溶媒と第１の貧溶媒は試料注入口１で混
合されて第１の溶離液が形成され、試料Ｓが添加された
溶離液は切換バルブ６に送られる。次いで切換バルブ６
を介して第１カラム７、検出器８、第２の切換バルブ９
に送られる。レコーダー１０は検出器８の出力を表示及
び記録し、試料を第２カラム２３で分離する際、第１カ
ラム７による圧力低下を避けるためのバイパス管１１が
切換バルブ６により切換えられるようになっている。

【００１２】第１カラム７には、試料中の各成分を分離
するための充填剤が充填される。充填剤としては、例え
ばシリカ、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体、ポリ
ビニルアルコール又はポリビニルピロリドン等の粉末が
用いられ、特に≡Ｓｉ−ＯＲ（式中、ＲはＣ₁ 、Ｃ₂ 、
Ｃ₈ 又はＣ₁₈のアルキル基を表す）基を有するケイ素化
合物で表面処理したシリカ粉末が好ましい。溶離液の排
出口１２から、採取不要のフラクションが排出される。
必要なフラクションは、第３の切換バルブ１３及び第４
の切換バルブ１４によって複数の空カラム１５のいずれ
かに送給され、同カラム１５に採取される。必要なフラ
クションを採取するための切換バルブ１３及び１４の操
作はレコーダー１０の表示を参照して行われる。必要な
フラクションが空カラム１５−１〜１５−ｎにそれぞれ
採取され、次いで、第１カラム中の成分が溶出し終えた
ならば第２カラムでの分離が行われる。

【００１３】第２カラム２３での分離を行うためには、
第１の溶離液で空カラム１５−１中のフラクションを第
５の切換バルブ１９に送り、第２の貧溶媒注入ポンプ１
７から送られる第２の貧溶媒１８と混合して所定の濃縮
カラム２１に導入する。濃縮カラム２１−１〜２１−ｎ
には、試料成分の担持体としてシリカ又はガラスビーズ
等が充填されており、第２の貧溶媒が混合されたフラク
ション中の試料成分は、濃縮カラム２１中の担持体上に
沈積する。空カラム１５に採取された各フラクションを
各濃縮カラム２１に保持させる作業が終了した後、第２
の貧溶媒１８の添加を中止し、良溶媒２又は良溶媒２と
第１の貧溶媒４との混合溶離液からなる第２の溶離液を
所定の濃縮カラム２１に供給して、沈積した成分を溶出
し、第６の切換バルブ２０及び第７の切換バルブ２２を
介して第２カラム２３に送給する。

【００１４】第２カラム２３は、試料の各フラクション
を精密に分離するため、第１カラム７と同様の充填剤を
有するが、しかし、第２カラム２３の充填剤は第１カラ
ム７の充填剤とは分離能が異質となるように組合わせる
ことが好ましい。第２カラム２３で分離された試料成分
は、検出器２４で検出され、排出口２５から排出され
る。レコーダー２６は検出器２４の出力を表示記録す
る。

【００１５】以上、本発明の操作の要点は下記のとおり
である。初めにバルブ流路を第１カラム７−検出器８−
排出口１２に接続し、その状態で試料を導入し、第１カ
ラムで１段目の分離を行う。この第１カラムで分離され
た各フラクションは、流路を切換えて第１カラム７−検
出器８−空カラム１５−排出口１６とし、分離目的成分
のトラップを行う。得られた粗分離成分はバルブ１３及
び１４を切換えて１からｎ群までトラップ可能である。
第１カラムで分離終了後バルブ流路を切換えバイパス管
１１−空カラム１５（１からｎ）−濃縮カラム２１（１
から６）−バイパス管２７−排出口２５とし、トラップ
した成分を確実に濃縮カラム２１に濃縮するが、このと
き第２の貧溶媒をポンプ１７から添加することにより、
更に分離目的成分の回収率が向上する。その後バルブ流
路をバイパス管１１−空カラム１５−濃縮カラム２１−
第２カラム２３−検出器２４とし、分析目的成分を順次
再分離し、これによって従来は分離不可能であった成分
を分離・分析することができる。

【００１６】〈実験例〉逆相カラムを用い、微量の多成
分アミノ酸の光学分割を本発明の装置により実施し、従
来単一の分析条件では分離不可能であった成分の分離を
可能とした本発明の効果を具体的に説明する。

【００１７】Ａ．装置の条件等 第１カラム ７：逆相ＯＤＳ（直径６mm×長さ２００m
m） 濃縮カラム１５：逆相ＯＤＳ（直径６mm×長さ ５０m
m） 第２カラム２３：逆相ＯＤＳ（直径６mm×長さ３００m
m） 空カラム ２１：内径０．５mm、容量５ml 溶離液 ：ポンプ３ メタノール ポンプ５ ０．０１M 酢酸ナトリウム水溶液（pH＝７．
０） 検出器 ：蛍光検出器 励起波長 ２３３nm 蛍光波長 ４５５ｎｍ カラム温度 ：２０℃

【００１８】試料調製は、本装置に付属するオートサン
プラーの前処理機能を用いて、以下のように行った。
空のバイアルにアミノ酸水溶液を２００μｌ 加える。
続いて０．１N ホウ酸ナトリウム水溶液を６００μl
加える。続いてオルトフタルアルデヒド０．８g 及び
Ｎ−アセチル−Ｌ−システインの１００mlメタノール溶
液を４００μl 加え、５回混合後２分間放置し、アミノ
酸の蛍光誘導体を調製した。

【００１９】Ｂ．第１カラム７のみでの分離 上記Ａで調製した試料５μl を蛍光検出器を付属する図
１の高速液体クロマトグラフシステムに注入し、第１カ
ラム７のみで分析を行い、その結果を図２に示す。

【００２０】図２からわかるように、光学分割したアミ
ノ酸と分割されなかったアミノ酸（スレオニンＴｈｒと
ヒスチジンＨｉｓ、フェニルアラニンＰｈｅ、リシンＬ
ｙｓとロイシンＬｅｕ）が見られる。そこで分離未達成
のアミノ酸ピークを空カラムに分取、濃縮、第２カラム
２３に導入し、再分離を行った。結果を次項Ｃで説明す
る。

【００２１】Ｃ．全系での分離 Ｃ−１．粗分離操作 （１）バルブを操作し、流路を第１カラム７−検出器８
−排出口１２とする。 （２）ポンプ３及び５よりメタノールと酢酸ナトリウム
水溶液をそれぞれ流入させる。 （３）オートサンプラにて誘導体化したアミノ酸を試料
注入口１に注入する。 （４）試料注入後、溶離液を表１に設定したグラジエン
ト条件で分離を行う。

【００２２】

【表１】

【００２３】（５）検出器８で分割不十分のピーク先端
を確認したら切換パルブ９を操作し、流路を第１カラム
７−検出器８−空カラム１５−１−排出口１６と切換
え、空カラム１５−１へ分割不十分のピーク群を導入し
分取する。 （６）検出器８で分離不十分のピーク末端を確認したら
切換バルブ１３及び１４を操作し、流路を第１カラム７
−検出器８−排出口１２に切換える。 （７）更に再分離が必要なピーク群が現れたら流路を第
１カラム７−検出器８−空カラム１５−２と切換え分取
する。 （８）以降の操作は、空カラム番号を順送りする以外は
（４）から（６）の操作を繰返す。

【００２４】Ｃ−２．濃縮操作 （１）バルブ流路をバイパス管１１−空カラム１５−１
−濃縮カラム２１−１−バイパス管２７−検出器２４−
排出口２５とする。 （２）ポンプ３及び５より良溶媒と貧溶媒をポンプ１７
より貧溶媒１８を各々流入させ、空カラム１５−１中の
分取画分を濃縮カラム２１−１へ濃縮沈積させる。 （３）以降の操作は、空カラム番号及び濃縮カラム番号
を順送りする以外は（１）及び（２）の操作を繰返す。

【００２５】Ｃ−３．再分離操作 （１）バルブ流路をバイパス管１１−空カラム１５−１
−濃縮カラム２１−１−第２カラム２３−検出器２４−
排出口２５とする。 （２）ポンプ３よりメタノールを、ポンプ５より０．０
１M リン酸二水素ナトリウム水溶液（pH＝７．５）又は
０．０１M ベータシクロデキストリン＋酢酸ナトリウム
水溶液を流入させ、濃縮カラム２１−１中の分離未達成
画分を第２カラム２３で再分離する。 （３）以降の操作は、濃縮カラム番号を順送りする以外
は（１）及び（２）の操作を繰り返す。

【００２６】Ｃ−４．結果 前記Ｂ項で光学分割されなかったアミノ酸、すなわち、
スレオニンとヒスチジン、フェニルアラニン及びリシン
とロイシンのピーク群を空カラムへ分取、濃縮、第２カ
ラムで再分離した結果、目的通り光学分割が達成され、
その結果を図３、図４及び図５に示した。本結果よりわ
かるように従来一つの分析条件では分離未達成のピーク
でも、本システムを用いての分取、濃縮、第２カラムで
の再分離により、ピーク分割が効率よく達成されること
が判明した。

【００２７】

【発明の効果】以上説明したように、本発明の装置及び
方法によると単一の分析条件では分離不可能であった複
雑な多成分の分離が可能となる。更に試料の一度の注入
で多種の分離結果が入手可能となり、貴重な試料の浪費
を防ぐと共に試料再調製の手間を省くことも可能であ
る。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の液体クロマトグラフ装置の説明図であ
る。

【図２】実験例中、Ｂ項で実施した分析結果を示すチャ
ートである。

【図３】実験例中、Ｃ項で実施したスレオニンとヒスチ
ジンの分析結果を示すチャートである。

【図４】実験例中、Ｃ項で実施したフェニルアラニンの
分析結果を示すチャートである。

【図５】実験例中、Ｃ項で実施したリシンとロイシンの
分析結果を示すチャートである。

【符号の説明】

Ｓ 試料 １ 試料注入口 ２ 良溶媒 ３ 注入ポンプ ４ 第１の貧溶媒 ５ 注入ポンプ ６ 切換バルブ ７ 第１カラム ８ 検出器 ９ 切換バルブ １０ レコーダー １１ バイパス管 １２ 排出口 １３ 切換バルブ １４ 切換バルブ １５−１〜１５−ｎ 空カラム １６ 排出口 １７ 注入ポンプ １８ 第２の貧溶媒 １９ 切換バルブ ２０ 切換バルブ ２１−１〜２１−６ 濃縮カラム ２２ 切換バルブ ２３ 第２カラム ２４ 検出器 ２５ 排出口 ２６ レコーダー ２７ バイパス管

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 第１カラム及び第２カラムを連結した液
   体クロマトグラフィーにおいて、第１カラム（７）と第
   ２カラム（２３）との間に複数の空カラム（１５）及び
   複数の濃縮カラム（２１）を連結し、良溶媒（２）と第
   １の貧溶媒（４）との混合溶媒からなる第１の溶離液を
   用いて試料（Ｓ）を第１カラム（７）に送給して成分を
   粗分離し、第１カラム（７）から溶出した各フラクショ
   ンを各空カラム（１５）に採取し；次いで第１の溶離液
   で各空カラム（１５）のフラクションを流出させ、これ
   に第２の貧溶媒（１８）を加えて各濃縮カラム（２１）
   に導入し、各フラクション中の成分を各濃縮カラム（２
   １）中に捕捉させた後、第２の溶離液を用い濃縮カラム
   （２１）中の成分を溶出させて第２カラム（２３）に送
   給し分離することを特徴とする液体クロマトグラフィ
   ー。
2. 【請求項２】 第１カラム（７）及び第２カラム（２
   ３）とも逆相分配型カラムである請求項１の液体クロマ
   トグラフィー。
3. 【請求項３】 請求項２の液体クロマトグラフィーを用
   いてアミノ酸を光学分割する方法。