CN109932464A - 多维色谱系统及多维色谱分离方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种多维色谱系统及分离方法，包括收集器、第一维梯度泵、第二维梯度泵、进样驱动泵及多个色谱柱；至少有两个色谱柱为第一及第二维色谱柱，第一维梯度泵与第一维色谱柱连通以向第一维色谱柱注入第一维流动相进行分离，收集器用于收集第一维色谱柱分离后的样品以在第二维色谱柱进行分离；第二维色谱柱进行分离时，进样驱动泵与收集器的一端连通以向收集器注入驱动流动相，收集器的另一端与第二维色谱柱连通，以将驱动流动相及第一维色谱柱分离后的样品转入第二维色谱柱进行分离；第二维梯度泵连通于第二维色谱柱的与收集器连通的一端以向第二维色谱柱注入第二维流动相进行分离。该多维色谱系统及方法可抑制色谱峰展宽，提升色谱分离效果。

Description

多维色谱系统及多维色谱分离方法

技术领域

本发明涉及色谱分离技术领域，特别是涉及一种多维色谱系统及多维色谱分离方法。

背景技术

随着色谱分离技术的快速发展，色谱的分离模式也逐渐从一维模式到多维模式发展。多维色谱法是指样品经过两种以上的色谱模式的分离方法，相比一维模式，其极大提升了分离能力。然而由于两种不同机理的色谱模式采用的流动相一般不完全相同，因此经上一维色谱分离后，转入下一维色谱进一步分离时存在两维色谱分离的流动相不兼容的问题，从而导致色谱峰严重展宽，进而使得分离效果不佳。

发明内容

基于此，有必要提供一种能够提高分离效果的多维色谱系统及多维色谱分离方法。

一种多维色谱系统，包括收集器、第一维梯度泵、第二维梯度泵、进样驱动泵及多个色谱柱；所述多个色谱柱中至少有两个色谱柱为第一维色谱柱及第二维色谱柱，所述第一维梯度泵与所述第一维色谱柱连通以向所述第一维色谱柱注入第一维流动相进行分离，所述收集器用于收集所述第一维色谱柱分离后的样品以在所述第二维色谱柱进行分离；在所述第二维色谱柱对所述第一维色谱柱分离后的样品进行分离时，所述进样驱动泵与所述收集器的一端连通以向所述收集器注入驱动流动相，所述收集器的另一端与所述第二维色谱柱连通，以将所述驱动流动相及所述第一维色谱柱分离后的样品转入所述第二维色谱柱进行分离；所述第二维梯度泵连通于所述第二维色谱柱的与所述收集器连通的一端以向所述第二维色谱柱注入第二维流动相进行分离。

上述多维色谱系统，待分离样品先在第一维色谱柱采用第一维流动相进行分离，收集器收集第一维色谱柱分离后的样品。第一维色谱柱分离后的样品从收集器转入第二维色谱柱进行再次分离时，采用进样驱动泵注入驱动流动相将第一维色谱柱分离后的样品推入第二维色谱柱，由于收集器中的馏分带有第一维流动相，因此转入第二维色谱柱分离时会存在第一维流动相和第二维流动相两种流动相不兼容导致色谱峰展宽的问题。而将第二维梯度泵设置在收集器下游，使得第二维流动相的洗脱流路不再流经收集器，第二维流动相和收集器中转移的馏分(包括驱动流动相及第一维色谱柱分离后的样品)在第二维色谱柱分离之前先汇合，实现在线混合稀释，然后再进入第二维色谱柱分离。由于第二维梯度泵可控制第二维流动相的流速，进样驱动泵可控制驱动流动相的流速，因此收集器转移的馏分在进入第二维色谱柱之前可以被第二维流动相可控稀释，从而有利于其在进入第二维色谱柱进行分离时实现柱头聚焦，从而抑制第二维分离过程中的峰展宽问题。该多维色谱系统工作时，可以简单通过改变进样驱动泵和第二维梯度泵的流速实现转移馏分的稀释倍数的大范围精确调节，且无需更换分流组件，更便于实际操作，进一步提升了分离效果。

在其中一个实施例中，所述多维色谱系统还包括控制机构；

所述控制机构用于控制所述第二维梯度泵内的第二维流动相的流速和所述进样驱动泵内的驱动流动相的流速，和/或所述控制机构用于控制所述第二维梯度泵内的第二维流动相与所述进样驱动泵内的驱动流动相的流速比。

在其中一个实施例中，所述多维色谱系统还包括混合器，所述混合器设于所述第二维色谱柱和所述收集器之间，所述混合器还与所述第二维梯度泵连通以用于将第二维流动相和来自所述收集器转移的馏分混合。

在其中一个实施例中，所述收集器为定量环或捕集柱。

在其中一个实施例中，所述第一维色谱柱为反相色谱柱，所述第二维色谱柱为亲水色谱柱。

在其中一个实施例中，所述第一维色谱柱和所述第二维色谱柱之间设有两个所述收集器，其中一个用于将所述第一维色谱柱分离后的样品转入所述第二维色谱柱进行分离，另一个用于继续收集所述第一维色谱柱分离后的样品，且两个所述收集器交替地收集所述第一维色谱柱分离后的样品并将其转入所述第二维色谱柱以进行分离。

在其中一个实施例中，还包括切换阀，两个所述收集器分别与所述切换阀连通，所述切换阀能够切换状态，以使两个所述收集器交替地收集所述第一维色谱柱分离后的样品并将其转入所述第二维色谱柱以进行分离。

在其中一个实施例中，所述切换阀为二位八通阀、二位十通阀或由两个六通阀连接组成。

在其中一个实施例中，所述切换阀为二位八通阀，所述切换阀具有八个端口，依次为第一端口、第二端口、第三端口、第四端口、第五端口、第六端口、第七端口及第八端口；

所述第一维色谱柱与所述第一端口连通，所述第二维色谱柱与所述第七端口连通；其中一个所述收集器的两端分别与所述第二端口和所述第六端口连通，另一个所述收集器的两端分别与所述第四端口和所述第八端口连通；所述第五端口用于排出废液；

所述切换阀具有两个状态且能够在所述两个状态之间切换；其中一个状态为：所述第一端口与所述第二端口连通，所述第三端口与所述第四端口连通，所述第五端口与所述第六端口连通，所述第七端口与所述第八端口连通；另一状态为：所述第一端口与所述第八端口连通，所述第二端口与所述第三端口连通，所述第四端口与所述第五端口连通，所述第六端口与所述第七端口连通。

在其中一个实施例中，所述切换阀为二位十通阀，所述切换阀具有十个端口，依次为第一端口、第二端口、第三端口、第四端口、第五端口、第六端口、第七端口、第八端口、第九端口及第十端口；

所述第一维色谱柱与所述第一端口连通，所述第二维色谱柱与所述第九端口连通；其中一个所述收集器的两端分别与所述第三端口和所述第十端口连通，另一个所述收集器的两端分别与所述第五端口和所述第八端口连通；所述第六端口用于排出废液；

所述切换阀具有两个状态且能够在所述两个状态之间切换；其中一个状态为：所述第一端口与所述第十端口连通，所述第二端口与所述第三端口连通，所述第四端口与所述第五端口连通，所述第六端口与所述第七端口连通，所述第八端口与所述第九端口连通；另一状态为：所述第一端口与所述第二端口连通，所述第三端口与所述第四端口连通，所述第五端口与所述第六端口连通，所述第七端口与所述第八端口连通，所述第九端口与所述第十端口连通。

在其中一个实施例中，所述切换阀由两个六通阀组成，其中一个六通阀具有六个端口，依次为第一端口、第二端口、第三端口、第四端口、第五端口及第六端口；另一个六通阀具有六个端口，依次为第七端口、第八端口、第九端口、第十端口、第十一端口及第十二端口；

所述第二端口与所述第七端口连通，所述第四端口与所述第十一端口连通；所述第一维色谱柱与所述第一端口连通；所述第二维色谱柱与所述第五端口连通；其中一个所述收集器的两端分别与所述第三端口和所述第六端口连通，另一个所述收集器的两端分别与所述第九端口和所述第十二端口连通；

所述切换阀具有两个状态且能够在所述两个状态之间切换；其中一个状态为：所述第一端口与所述第六端口连通，所述第二端口与所述第三端口连通，所述第四端口与所述第五端口连通，所述第七端口与所述第八端口连通，所述第九端口与所述第十端口连通，所述第十一端口与所述第十二端口连通；另一状态为：所述第一端口与所述第二端口连通，所述第三端口与所述第四端口连通，所述第五端口与所述第六端口连通，所述第七端口与所述第十二端口连通，所述第八端口与所述第九端口连通，所述第十端口与所述第十一端口连通。

一种二维色谱分离方法，包括如下步骤：

将待分离的样品注入第一维色谱柱并于第一维流动相的作用下进行分离；

将经所述第一维色谱柱分离后的样品收集后在驱动流动相的驱动下与第二维流动相混合，并于第二维色谱柱进行分离。

在其中一个实施例中，还包括如下步骤：

控制所述第二维流动相的流速和所述驱动流动相的流速；和/或

控制所述第二维流动相与所述驱动流动相的流速比。

附图说明

图1为一实施方式的多维色谱系统的两个工作状态的结构图；

图2为又一实施方式的多维色谱系统的两个工作状态的结构图；

图3为又一实施方式的多维色谱系统的一工作状态的结构图；

图4为图3所示多维色谱系统的又一工作状态的结构图；

图5为传统多维色谱系统应用于分离时所用的第一维流动相和第二维流动相的洗脱梯度图；

图6为图1所示的多维色谱系统应用于分离时所用的第一维流动相和第二维流动相的洗脱梯度图；

图7为传统多维色谱系统应用于分离桔梗提取物，得到的全二维等高线谱图和抽取的三个馏分的二维分离色谱图；

图8为图1所示多维色谱系统应用于分离桔梗提取物，得到的全二维等高线谱图和抽取的三个馏分的二维分离色谱图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

需要说明的是，当元件被称为“固定于”另一个元件，它可以直接在另一个元件上或者也可以存在居中的元件。当一个元件被认为是“连接”另一个元件，它可以是直接连接到另一个元件或者可能同时存在居中元件。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

请参阅图1，本发明一实施方式的多维色谱系统10包括收集器100、第一维梯度泵201、第二维梯度泵202、进样驱动泵203及多个色谱柱。

此外，本发明一实施方式提供了一种多维色谱分离方法，下面将结合多维色谱系统10的结构对多维色谱分离方法进行介绍。

多个色谱柱中至少有两个色谱柱分别为第一维色谱柱300及第二维色谱柱400。

第一维梯度泵201与第一维色谱柱300连通以向第一维色谱柱300注入第一维流动相进行分离。收集器100用于收集第一维色谱柱300分离后的样品以在第二维色谱柱400进行分离。

在第二维色谱柱400对第一维色谱柱300分离后的样品进行分离时，进样驱动泵203与收集器100的一端连通以向收集器100注入驱动流动相，收集器100的另一端与第二维色谱柱400连通，以将第一维色谱柱300分离后的样品及驱动流动相转入第二维色谱柱400进行分离。

第二维梯度泵202连通于第二维色谱柱400的与收集器100连通的一端以向第二维色谱柱400注入第二维流动相进行分离。

可理解，第一维色谱柱300内的第一维流动相和第二维梯度泵202内的第二维流动相均是具有浓度梯度，对应的洗脱程序为梯度洗脱。

如此第二维色谱柱400注入的第二维流动相在第二维色谱柱400分离之前与从收集器100转移的馏分汇合。

采用上述多维色谱系统10进行色谱分离时，包括如下步骤：将待分离的样品注入第一维色谱柱300内于第一维流动相的作用下进行分离；将经第一维色谱柱300分离后的样品经收集后在驱动流动相的驱动下与第二维流动相混合，并于第二维色谱柱400进行分离。

进一步地，上述多维色谱系统10，待分离样品先在第一维色谱柱300采用第一维流动相进行分离，收集器100收集第一维色谱柱300分离后的样品。第一维色谱柱300分离后的样品从收集器100转入第二维色谱柱400进行再次分离时，采用进样驱动泵203注入驱动流动相将第一维色谱柱300分离后的样品推入第二维色谱柱400，由于收集器100中的馏分带有第一维流动相，因此转入第二维色谱柱400分离时会存在第一维流动相和第二维流动相两种流动相不兼容导致色谱峰展宽的问题。而将第二维梯度泵202设置在收集器100下游，使得第二维流动相的洗脱流路不再流经收集器100，第二维流动相和收集器100中转移的馏分(包括驱动流动相及第一维色谱柱300分离后的样品)在第二维色谱柱400分离之前先汇合，实现在线混合稀释，然后再进入第二维色谱柱400分离。由于第二维梯度泵202可控制第二维流动相的流速，进样驱动泵203可控制驱动流动相的流速，因此收集器100转移的馏分在进入第二维色谱柱400之前可以被第二维流动相可控稀释，从而有利于其在进入第二维色谱柱400进行分离时实现柱头聚焦，从而抑制第二维分离过程中的峰展宽问题。该多维色谱系统10工作时，可以简单通过改变进样驱动泵203和第二维梯度泵202的流速实现转移馏分的稀释倍数的大范围精确调节，且无需更换分流组件，更便于实际操作，进一步提升了分离效果。

传统的多维色谱系统，不含有本发明的进样驱动泵203及驱动流动相，传统第二维流动相的梯度产生是通过两个泵来实现的，每个泵分别单独提供一种流动相，两种流动相经混合器混合后得到比例持续变化的流动相，这种模式下，通常第二维的馏分进样是发生在第二维流动相混合之后，称之为混合后进样。

而上述多维色谱系统10，第一维色谱柱300分离后的样品和驱动流动相与第二维梯度泵202内泵出的第二维流动相合并混合，这种模式称之为进样后混合。优选地，在混合器204(见下文)混合。上述多维色谱系统10的优势在于，这样进样后混合，可以减少一个第二维混合器，从而减小了第二维色谱柱400的柱前的系统死体积，使得梯度的流动相能更迅速地到达色谱柱，减少延迟。其二，由于进样驱动泵中的驱动流动相是具有一定的流速的，如果不经过混合器204与第二流动相进行混合，进入色谱柱的流动相均匀性有可能不够；故而混合器204可提高进入第二维色谱柱400的流动相的均匀性。

在其中一个实施例中，上述多维色谱系统10还包括控制机构(图未示)，控制机构用于控制第二维梯度泵202内的第二维流动相的流速和进样驱动泵203内的驱动流动相的流速；和/或控制机构用于控制第二维梯度泵202内的第二维流动相和进样驱动泵203内的驱动流动相的流速比。可理解，第二维梯度泵202和进样驱动泵203均可自带调速功能，只要将控制机构同时连接第二维梯度泵202和进样驱动泵203即可实现第二维流动相的流速和驱动流动相的流速或流速比控制。如此实现转移馏分的稀释倍数的大范围精确调节。

可理解，在一些实施例中，控制机构可省略，直接通过手动调节第二维梯度泵202和进样驱动泵203的调速功能即可。

在其中一个实施例中，上述多维色谱系统10还包括混合器204，混合器204设于第二维色谱柱400和收集器100之间，也就是说混合器204的一端与第二维色谱柱400连通，另一端与收集器100连通，且混合器204还与第二维梯度泵202连通以用于将第二维流动相和来自收集器100转移的馏分混合。如此先在混合器204中充分混合，可使第二维流动相更好地可控稀释，从而有利于其在进入第二维色谱柱400进行分离时实现柱头聚焦，从而更好地抑制第二维分离过程中的峰展宽问题。

可理解，在一些实施例中，混合器204可省略，直接在第二维色谱柱400之前的管路或第二维色谱柱400内在线混合稀释即可。

此外，第二维梯度泵202设置在收集器100下游，使得第二维流动相的洗脱流路不再流经收集器100，可更好地保证第二维分离过程中的洗脱梯度。且驱动流动相可不需要具有浓度梯度的流动相，但是驱动流动相和第二维流动相可采用组分相同的流动相，以便于第二维分离的进行。具体地，驱动流动相优选采用第二流动相中弱洗脱溶剂作为流动相。

进一步地，第二维色谱柱400分离所采用的流动相由驱动流动相和第二流动相两者共同组成。更进一步地，驱动流动相采用纯的弱洗脱溶剂，而第二流动相中弱洗脱溶剂的体积浓度呈梯度变化；相应地，第二维色谱柱400分离所采用的流动相也呈梯度变化。

可理解，上述多维色谱系统10还包括进样器205，进样器205用于向第一维色谱柱300内注入待分离的样品。具体地，第一维色谱柱300还可与进样器205连通。

在其中一个实施例中，第一维色谱柱300为反相色谱柱，第二维色谱柱400为亲水色谱柱。

如此第一维色谱柱300将待分离样品中化合物按照极性由大到小顺序依次分离，洗脱的成分进入收集器100。第二维色谱柱400将第一维色谱柱300分离后转移的组分按照极性由小到大的顺序进行第二次分离。一般地，此时所用第一维流动相为富水流动相，而第二维流动相为高有机相流动相，因此从第一维色谱柱300分离后的样品中水分含量较高，较多的水分进入第二维色谱柱400，会降低第二维色谱柱400的保留效果，造成色谱峰的展宽。而将进样驱动泵203的驱动流动相和第二维流动相混合，将该水分一点点地稀释，逐渐进入第二维色谱柱400，避免该水分经由第二维流动相一次性从收集器100推入造成不可逆转的色谱峰展宽的问题，从而抑制了色谱峰展宽，提升了色谱分离效果。

在其中一个实施例中，第一维色谱柱300和第二维色谱柱400之间设有两个收集器100。其中一个用于将第一维色谱柱300分离后的样品转入第二维色谱柱400进行分离，另一个用于继续收集第一维色谱柱300分离后的样品，且两个收集器100交替地收集第一维色谱柱300分离后的样品并将其转入第二维色谱柱400以进行分离。

如此第一维色谱柱300在第一维流动相的洗脱下不断地进行分离，两个收集器100交替地且分阶段地将实时分离的样品转入到第二维色谱柱400；当其中一个收集器100收集结束后，切换至另一个收集器100继续收集第一维色谱柱300分离的样品，同时该收集有样品的收集器100与第二维流动相和第二维色谱柱400连通，以将其中的样品转入第二维色谱柱400进行分离。

特别地，待分离样品中所有成分的分离分析均经过第一维色谱柱300及第二维色谱柱400的分离，待分离样品中所有成分均以同等比例经过第一维色谱柱300及第二维色谱柱400分离后进行检测，因此避免了分离过程中样品的损失和样品的重现性差的问题。

进一步地，收集器100为定量环或捕集柱。

具体在本实施例中，收集器100为反相捕集柱。在其中一个实施例中，当收集器100为反相捕集柱时，还包括稀释管路310和与稀释管路310连通的稀释泵50。稀释管路310一端与稀释溶剂连通，另一端与第一维色谱柱300的出口端连通，以使稀释泵50泵出的稀释溶剂与经过第一维色谱柱300分离的样品汇合。一般地，所用第一维流动相为富水流动相，稀释溶剂为高水相，经过第一维色谱柱300分离的样品进一步经过稀释溶剂的稀释，使得待进入反相捕集柱的样品的含水量提高，有机相降低，以使样品中的目标分析物更好地被反相捕集柱补集。

当收集器100为定量环时，该稀释管路310可省略。可以理解，在图2～图4中，当收集器100为反相捕集柱时，也可设有稀释管路310(图2～图4中未示)。

在其中一个实施例中，还包括检测装置500，检测装置500与第二维色谱柱400的出口端连接。具体地，检测装置500为色谱分析仪等分析检测装置500。

请参阅图1、图2、图3及图4，其中一个实施例中，还包括切换阀600/700/800。第一维色谱柱300、第二维色谱柱400及第一维色谱柱300与第二维色谱柱400之间的两个收集器100分别与切换阀连通600/700/800。切换阀600/700/800能够切换状态，以使两个收集器100交替地收集第一维色谱柱300分离后的样品并将其转入第二维色谱柱400以进行分离。

进一步地，切换阀600/700/800为二位八通阀、二位十通阀或由两个六通阀连接组成。

请参阅图1，进一步地，在一实施例中，切换阀600为二位八通阀。切换阀600具有八个端口，依次为第一端口610、第二端口620、第三端口630、第四端口640、第五端口650、第六端口660、第七端口670及第八端口680。其中第一维色谱柱300与第一端口610连通。第二维色谱柱400与第七端口670连通。其中一个收集器100的两端分别与第二端口620和第六端口660连通，另一个收集器100的两端分别与第四端口640和第八端口680连通。第五端口650用于排出废液40。

切换阀600具有两个状态且能够在该两个状态之间切换。其中一个状态为：第一端口610与第二端口620连通，第三端口630与第四端口640连通，第五端口650与第六端口660连通，第七端口670与第八端口680连通。另一状态为：第一端口610与第八端口680连通，第二端口620与第三端口630连通，第四端口640与第五端口650连通，第六端口660与第七端口670连通。

工作时，切换阀600在两个状态中交替切换。具体地，检测装置500的废液40与第五端口650排出的废液40汇合排出系统。

请参阅图2，进一步地，在又一实施例中，切换阀700为二位十通阀。切换阀具有十个端口，依次为第一端口701、第二端口702、第三端口703、第四端口704、第五端口705、第六端口706、第七端口707、第八端口708、第九端口709及第十端口710。其中第一维色谱柱300与第一端口701连通。第二维色谱柱400与第九端口709连通。其中一个收集器100的两端分别与第三端口703和第十端口710连通，另一个收集器100的两端分别与第五端口705和第八端口708连通。第六端口706用于排出废液40。

切换阀700具有两个状态且能够在该两个状态之间切换。其中一个状态为：第一端口701与第十端口710连通，第二端口702与第三端口703连通，第四端口704与第五端口705连通，第六端口706与第七端口707连通，第八端口708与第九端口709连通。另一状态为：第一端口701与第二端口702连通，第三端口703与第四端口704连通，第五端口705与第六端口706连通，第七端口707与第八端口708连通，第九端口709与第十端口710连通。

工作时，切换阀700在两个状态中交替切换。具体地，检测装置500的废液40与第六端口706排出的废液40汇合排出系统。

请参阅图3及图4，进一步地，在又一实施例中，切换阀800由两个六通阀连接组成。其中一个六通阀810具有六个端口，依次为第一端口801、第二端口802、第三端口803、第四端口804、第五端口805及第六端口806。另一个六通阀820具有六个端口，依次为第七端口807、第八端口808、第九端口809、第十端口810、第十一端口811及第十二端口812。第二端口802与第七端口807连通，第四端口804与第十一端口811连通。其中，第一维色谱柱300与第一端口801连通。第二维色谱柱400与第五端口805连通。其中一个收集器100的两端分别与第三端口803和第六端口806连通。另一个收集器100的两端分别与第九端口809和第十二端口812连通。

切换阀800具有两个状态且能够在该两个状态之间切换。

请参阅图3，其中一个状态为：第一端口801与第六端口806连通，第二端口802与第三端口803连通，第四端口804与第五端口805连通，第七端口807与第八端口808连通，第九端口809与第十端口810连通，第十一端口811与第十二端口812连通。

请参阅图4，另一状态为：第一端口801与第二端口802连通，第三端口803与第四端口804连通，第五端口805与第六端口806连通，第七端口807与第十二端口812连通，第八端口808与第九端口809连通，第十端口810与第十一端口811连通。工作时，切换阀在两个状态中交替切换。

具体到本实施例中，色谱柱为两个，即对应的多维色谱系统为二维色谱系统。此时，该多维色谱系统10为全二维液相色谱。可理解，当色谱柱的数量为三个或三个以上时，第三个、第四个色谱柱等等与前一色谱柱之间也通过收集器连通，也可设有上述进样驱动泵。优选地，在分离顺序上相邻的两个色谱柱均通过收集器、进样驱动泵和上述切换阀连通。

以下为具体应用实施例。

分别采用传统不含进样驱动泵的二维色谱系统和本发明如图1所示的多维色谱系统10(在本实施例中为二维色谱系统)依次连接反相和亲水色谱构建全二维系统。其中，第一维色谱柱为反相色谱柱：C18色谱柱(20×4.6mm,5μm)，流速为1mL/min；第二维色谱柱为亲水色谱柱：半胱氨酸键合HILIC色谱柱(15×4.6mm,5μm)，当采用传统的二维系统时，第二维流速为2.6mL/min，当采用图1所示二维系统时，驱动流路流速为0.4mL/min，第二流动相流速为2.2mL/min。第一收集器为反相柱(2×4.6mm,5μm)，第二收集器为反相柱(2×4.6mm,5μm)。

采用桔梗提取物为分析对象，对其中的桔梗皂苷类化合物进行全二维分析。样品制备：精密称取桔梗粉末0.3g超声溶解于5mL 60％甲醇水溶液中，取上清液过0.4μm有机膜后等待进样。

传统RP x HILIC二维色谱系统的第一维与第二维流动相及梯度如下：第一维流动相(1^st D gradient)为乙腈的水溶液，其乙腈的体积浓度为2％～94％。第二维流动相(2^stD gradient)初始为100％乙腈，然后乙腈体积浓度逐渐降低。第一维流动相与第二维流动相的浓度梯度如图5所示，其中横坐标为保留时间/min，纵坐标为ACN concentrition(乙腈体积浓度，％)。

按图1方式构建的RP x HILIC二维色谱系统的第一维与第二维流动相及梯度如下：第一维流动相(1^st D gradient)为乙腈的水溶液，梯度与按照传统方式构建RP x HILIC二维系统相同。第二维梯度与传统二维系统有差异，按图1方式构建二维系统，第二维色谱柱内的流动相来源分两部分，第一部分是第二维梯度泵202提供的，另一部分是有进样驱动泵203提供的，本实验室中，进样驱动泵提供部分为0.4mL/min的100％纯乙腈等度。第二维泵提供为总流速为2.2mL/min的梯度。两部分最后混合得到的合并梯度与传统的梯度保持一致。图1方式构建RP x HILIC二维系统第一维流动相(1^st D gradient)与第二维流动相(2^st D gradient)的浓度梯度如图6所示，其中横坐标为保留时间/min，纵坐标为ACNconcentration(乙腈体积浓度，％)。

采用传统的二维色谱系统和按图1方式构建的RP x HILIC二维色谱系统在检测波长为210nm，分别对中药材桔梗提取物进行全二维分析，结果如图7和图8所示。图7和图8分别为采用传统方式构建的RP x HILIC和采用图1方式构建的RP x HILIC二维色谱系统对中药材桔梗的分析结果，图7和图8中左图为等高线二维色谱图(其中，横坐标为第一维馏分1^stDimensional fractions(n)；纵坐标为第二维保留时间2^st Dimensional R.time(min))，右图为抽取的三个馏分(分别标号为a、b、c)的第二维色谱图(其中，横坐标为保留时间(min)，纵坐标为吸收强度Intensity(mAU))。

从图7和图8的左图所示的等高线色谱图对比可以看出，传统的方法得到的结果出了大量重复出现的溶剂峰外，很少看到清晰的分析物的峰。出现的少部分分析物峰也集中于有限的区域，很难被很好地分离。这种结果很难用于实际分析。鲜明对比的是，图1方式构建二维系统获得结果中能获得大量的清晰的分析物，几乎没有明显溶剂峰，而且峰的分离状况良好。进一步对在两个系统上的分离结果中抽取的三个馏分进行对比，如图7和图8的右图所示。结果表明，传统系统上三个馏分的分离谱图上几乎只能观察到很强的溶剂溶峰。而图1方构建的系统上，三个馏分谱图显示，馏分中分析物获得了很好的分离，峰型尖锐。

上述对比的结果原因在于，图1方式构建的二维系统允许转移馏分在进入到第二维色谱柱之前经乙腈稀释6.5倍。经稀释后的馏分中含水量大大降低，从而增强了分析物在第二维色谱柱的柱头的聚焦。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种多维色谱系统，其特征在于，包括收集器、第一维梯度泵、第二维梯度泵、进样驱动泵及多个色谱柱；所述多个色谱柱中至少有两个色谱柱为第一维色谱柱及第二维色谱柱，所述第一维梯度泵与所述第一维色谱柱连通以向所述第一维色谱柱注入第一维流动相进行分离，所述收集器用于收集所述第一维色谱柱分离后的样品以在所述第二维色谱柱进行分离；在所述第二维色谱柱对所述第一维色谱柱分离后的样品进行分离时，所述进样驱动泵与所述收集器的一端连通以向所述收集器注入驱动流动相，所述收集器的另一端与所述第二维色谱柱连通，以将所述驱动流动相及所述第一维色谱柱分离后的样品转入所述第二维色谱柱进行分离；所述第二维梯度泵连通于所述第二维色谱柱的与所述收集器连通的一端以向所述第二维色谱柱注入第二维流动相进行分离。

2.如权利要求1所述的多维色谱系统，其特征在于，所述多维色谱系统还包括控制机构；

所述控制机构用于控制所述第二维梯度泵内的第二维流动相的流速和所述进样驱动泵内的驱动流动相的流速，和/或所述控制机构用于控制所述第二维梯度泵内的第二维流动相与所述进样驱动泵内的驱动流动相的流速比。

3.如权利要求1所述的多维色谱系统，其特征在于，所述多维色谱系统还包括混合器，所述混合器设于所述第二维色谱柱和所述收集器之间，所述混合器还与所述第二维梯度泵连通以用于将第二维流动相和来自所述收集器转移的馏分混合。

4.如权利要求1所述的多维色谱系统，其特征在于，所述收集器为定量环或捕集柱。

5.如权利要求1所述的多维色谱系统，其特征在于，所述第一维色谱柱为反相色谱柱，所述第二维色谱柱为亲水色谱柱。

6.如权利要求1～5任一项所述的多维色谱系统，其特征在于，所述第一维色谱柱和所述第二维色谱柱之间设有两个所述收集器，其中一个用于将所述第一维色谱柱分离后的样品转入所述第二维色谱柱进行分离，另一个用于继续收集所述第一维色谱柱分离后的样品，且两个所述收集器交替地收集所述第一维色谱柱分离后的样品并将其转入所述第二维色谱柱以进行分离。

7.如权利要求6所述的多维色谱系统，其特征在于，还包括切换阀，两个所述收集器分别与所述切换阀连通，所述切换阀能够切换状态，以使两个所述收集器交替地收集所述第一维色谱柱分离后的样品并将其转入所述第二维色谱柱以进行分离。

8.如权利要求7所述的多维色谱系统，其特征在于，所述切换阀为二位八通阀、二位十通阀或由两个六通阀连接组成。

9.一种多维色谱分离方法，其特征在于，包括如下步骤：

将待分离的样品注入第一维色谱柱并于第一维流动相的作用下进行分离；

将经所述第一维色谱柱分离后的样品收集后在驱动流动相的驱动下与第二维流动相混合，并于第二维色谱柱进行分离。

10.如权利要求9所述的多维色谱分离方法，其特征在于，还包括如下步骤：

控制所述第二维流动相的流速和所述驱动流动相的流速；和/或

控制所述第二维流动相与所述驱动流动相的流速比。