TW202337974A - 用於於基材上產率良好地形成空孔之技術之核殼模板分子、粒子 - Google Patents

用於於基材上產率良好地形成空孔之技術之核殼模板分子、粒子 Download PDF

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Abstract

本發明提供一種能夠簡易且感度良好地進行分析及檢查之分析用感測器、及用於其之分析用感測器製作用基材，進而提供一種用於製作該基材之粒子以及相關技術。本發明提供一種粒子，其包含粒子核、及利用能夠在不損傷該粒子核之條件下分離之分子間化學鍵而與該粒子核一體化之修飾物質；或者提供一種粒子，其用於製造分析用感測器製作用基材，該粒子包含粒子核、及利用能夠在不損傷該基材之條件下分離之分子間化學鍵而與該核一體化之修飾物質。

Description

用於於基材上產率良好地形成空孔之技術之核殼模板分子、粒子
本發明係關於一種於基材上感度良好地對檢測對象進行檢測之技術。更具體而言，本發明係關於測定技術中之核殼模板分子、粒子及其應用、檢測對象之分析用感測器製作用基材及其製造方法、檢測對象之分析用感測器及其製造方法、以及檢測對象之分析法。
胞外體等小細胞外囊泡(Small Extracellular Vesicles；sEVs)係從細胞釋出之內質網之一，且為直徑20～200 nm之脂質雙膜囊泡。小細胞外囊泡於其內部內包蛋白質、及miRNA、mRNA等核酸，並且於其表面亦具有蛋白質。由於小細胞外囊泡由此種物質賦予了特徵，故認為藉由對小細胞外囊泡之特徵進行解析，可推測所分泌之細胞為何種細胞。又，確認到小細胞外囊泡存在於各種體液中，能夠相對容易地採集。
由癌細胞分泌之小細胞外囊泡包含來自腫瘤之物質。因此，期待可藉由對體液中之小細胞外囊泡所含之物質進行解析來診斷癌症。進而，小細胞外囊泡係由細胞主動地分泌者，因此，預測即便為癌症之早期階段，亦會呈現出某些特徵。
[解決問題之技術手段]
本發明者等人進行了銳意研究，結果開發出可簡易且感度良好地進行分析及檢查之分析用感測器、及用於其之分析用感測器製作用基材、進而用於製作該基材之粒子以及相關技術，從而完成了本發明。
本發明例如提供以下之項目。 (項目A1) 一種粒子，其包含粒子核、及 基於能夠在不損傷該粒子核之條件下分離之相互作用而與該粒子核一體化之修飾物質。 (項目A1A) 一種粒子，其包含粒子核、及 利用能夠在不損傷該粒子核之條件下分離之分子間化學鍵而與該粒子核一體化之修飾物質。 (項目A1B) 一種粒子，其係用於製造分析用感測器製作用基材者，該粒子包含 粒子核、及基於能夠在不損傷該基材之條件下分離之相互作用而與該核一體化之修飾物質。 (項目A1B-2) 一種粒子，其係用於製造分析用感測器製作用基材者，該粒子包含 粒子核、及利用能夠在不損傷該基材之條件下分離之分子間化學鍵而與該核一體化之修飾物質。 (項目A1C) 如上述項目中任一項記載之粒子，其中上述修飾物質不為以共價鍵與上述核結合之單體。 (項目A1D) 如上述項目中任一項記載之粒子，其包含一種或複數種上述修飾物質。 (項目A2) 如上述項目中任一項記載之粒子，其中上述修飾物質包含能夠與基材結合之取代基。 (項目A3) 如上述項目中任一項記載之粒子，其中上述修飾物質具有選自由可逆性連結基及聚合性官能基所組成之群中之至少一個基。 (項目A3-1) 如上述項目中任一項記載之粒子，其中上述修飾物質具有聚合性官能基。 (項目A3A) 如上述項目中任一項記載之粒子，其中上述修飾物質具有選自由針對靶物質之特異性結合性分子之結合用基、訊號物質之結合用基、訊號物質、及可逆性連結基所組成之群中之至少一者。 (項目A3A-1) 如上述項目中任一項記載之粒子，其中上述修飾物質包含針對靶物質之特異性結合性分子之結合用基及訊號物質之結合用基；針對靶物質之特異性結合性分子之結合用基及訊號物質；或可逆性連結基。 (項目A4A) 如上述項目中任一項記載之粒子，其中上述可逆性連結基為二硫基、亞胺鍵基、肟基、腙鍵基、硼酸環狀酯鍵、羧酸酯基、羧酸硫酯基、或抗生物素蛋白-生物素鍵。 (項目A4B) 如上述項目中任一項記載之粒子，其中上述針對靶物質之特異性結合性分子之結合用基為胺基、羧基、二羥基硼基(boronyl)、硫醇基、馬來醯亞胺基、羰基、醛基、胺氧基、羥基、醯肼基、生物素基、源自次氮基三乙酸鎳之基、硫醇基或吡啶二硫基。 (項目A4C) 如上述項目中任一項記載之粒子，其中上述訊號物質之結合用基為胺基、羧基、二羥基硼基、硫醇基、馬來醯亞胺基、羰基、醛基、胺氧基、羥基、醯肼基、生物素基、源自次氮基三乙酸鎳之基、硫醇基或吡啶二硫基。 (項目A4D) 如上述項目中任一項記載之粒子，其中上述訊號物質為螢光分子、含放射性元素之物質、磁性物質、或酵素。 (項目A4) 如上述項目中任一項記載之粒子，其中上述能夠在不損傷粒子核之條件下分離之相互作用為非共價鍵。 (項目A4A) 如上述項目中任一項記載之粒子，其中上述能夠在不損傷粒子核或粒子核之核之條件下分離之分子間化學鍵為非共價鍵。 (項目A5) 如上述項目中任一項記載之粒子，其中上述相互作用為靜電相互作用。 (項目A5A) 如上述項目中任一項記載之粒子，其中上述分子間化學鍵為靜電相互作用。 (項目A6) 如上述項目中任一項記載之粒子，其中粒子核包含氧化矽、聚苯乙烯、聚乳酸、聚甲基丙烯酸甲酯、聚乳酸-乙醇酸共聚物、聚葡萄胺糖、氧化鐵、金、銀、鉑、氧化鋁、氧化銅、氧化鈦、氧化鋅、氧化鋯、氧化鈰、氧化鈷、摻錫氧化銦(ITO)、摻銻氧化錫(ATO)、石墨烯、氧化石墨烯、奈米碳管、奈米金剛石、或者氫氧磷灰石或該等之任意組合。 (項目A7) 如上述項目中任一項記載之粒子，其中粒子核包含氧化矽、或聚苯乙烯。 ＜B)附著有分析用感測器製作用基材製造用聚合物之模板粒子＝用途＞ (項目B1) 一種分析用感測器製作用基材之製造套組，其包含如上述項目中任一項記載之粒子、 基材、及 視需要之聚合物基質之原料。 (項目B1A) 一種分析用感測器製作用基材之製造套組，其包含基材；及 粒子，其包含粒子核、及基於能夠在不損傷該基材之條件下分離之相互作用而與該核一體化之修飾物質。 (項目B1B) 一種分析用感測器製作用基材之製造套組，其包含基材；及 粒子，其包含粒子核、及利用能夠在不損傷該基材之條件下分離之分子間化學鍵而與該核一體化之修飾物質。 (項目B1) 一種分析用感測器製作用基材之製造套組，其包含基材； 粒子，其包含粒子核、及基於能夠在不損傷該基材之條件下分離之相互作用而與該核一體化之修飾物質；及 視需要之聚合物基質之原料。 (項目B1C) 一種分析用感測器製作用基材之製造套組，其包含基材； 粒子，其包含粒子核、及利用能夠在不損傷該基材之條件下分離之分子間化學鍵而與該核一體化之修飾物質；及 視需要之聚合物基質之原料。 (項目B2) 一種如上述項目中任一項記載之粒子之用途，用於製造分析用感測器製作用基材。 (項目B3) 一種如上述項目中任一項記載之粒子之製作方法，其包含： A)提供粒子核之步驟； B)提供基於能夠在不損傷分析用感測器製作用基材之條件下分離之相互作用而能與該核一體化之修飾物質之步驟；及 C)將該粒子核與該修飾物質供於該粒子核與該修飾物質基於能夠在不損傷該基材之條件下分離之相互作用而一體化之條件之步驟。 (項目B3A) 一種如上述項目中任一項記載之粒子之製作方法，其包含： A)提供粒子核之步驟； B)提供利用能夠在不損傷分析用感測器製作用基材之條件下分離之分子間化學鍵而能與該核一體化之修飾物質之步驟；及 C)將該粒子核與該修飾物質供於該粒子核與該修飾物質藉由能夠在不損傷該基材之條件下分離之分子間化學鍵而一體化之條件之步驟。 ＜C)使用A)之測定基材製造方法＞ (項目C1) 一種用於製造分析用感測器製作用基材之方法，其包含： A)提供如上述項目中任一項記載之粒子之步驟； B)將該粒子配置於基材之步驟； C)視需要，對固定有該粒子之該基材提供聚合物基質之原料之步驟； D)視需要，藉由將該基材供於該聚合物基質進行聚合之條件，而形成配置有該聚合物基質之基材之步驟；及 E)藉由供於該粒子自該基材解離之條件而形成支架之步驟。 (項目C2) 一種用於製造分析用感測器之方法，其包含： A)提供如上述項目中任一項記載之粒子之步驟； B)將該粒子配置於基材之步驟； C)視需要，對配置有該粒子之該基材提供聚合物基質之原料之步驟； D)視需要，藉由將該基材供於該聚合物基質進行聚合之條件，而形成配置有該聚合物基質之基材之步驟； E)藉由供於該粒子自該基材解離之條件而形成支架之步驟；及 F)使測定所需之物質結合於上述支架之步驟。 (項目C3) 如上述項目中任一項記載之方法，其中上述步驟E中，該粒子自該基材解離之條件為切斷可逆性連結基而製作可逆性結合基之條件。 (項目C4) 如上述項目中任一項記載之方法，其中於上述步驟E之後，包含將支架內之上述可逆性結合基轉化為針對靶物質之特異性結合性分子之結合用基或訊號物質之結合用基之步驟。 ＜D)經C)製得之基材、感測器＞ (項目DX) 一種分析用感測器製作用基材，其係利用如上述項目中之任一項製得。 (項目DX2) 一種分析用感測器，其係利用如上述項目中之任一項製得。 (項目D1) 一種分析用感測器製作用基材，其具有A)基材； B)視需要之聚合物基質，其係配置於該基材上者，且該聚合物基質具有至少一部分適配對象分子之支架；及 C)配置於該支架之結合用基。 (項目D2) 一種分析用感測器，其具有A)基材； B)視需要之聚合物基質，其係配置於該基材上者，且該聚合物基質具有至少一部分適配對象分子之支架； C)配置於該支架之訊號物質之結合用基或訊號物質；及 D)與成為檢測對象之分子結合之特異性結合性分子之結合用基。 (項目D3) 如上述項目中任一項記載之基材或感測器，其中上述聚合物基質之潔淨度為95%以上。 (項目D4) 如上述項目中任一項記載之基材或感測器，其中上述基材中之該支架之規格值為80%以上。 (項目D5) 如上述項目中任一項記載之基材或感測器，其中上述基材上結合有源自基於能夠在不損傷該基材之條件下分離之相互作用而與該核一體化之一種或複數種修飾物質之取代基。 (項目D5) 如上述項目中任一項記載之基材或感測器，其中上述基材上結合有源自利用能夠在不損傷該基材之條件下分離之分子間化學鍵而與該核一體化之一種或複數種修飾物質之取代基。 (項目D5-1) 如上述項目中任一項記載之基材或感測器，其中上述源自修飾物質之取代基為胺基、酸性基、配位鍵性基、羰基、醛基、酮基、二羥基硼基、順式二醇基、硫醇基、生物素基、去硫生物素基、肽配體或可逆性連結基。 (項目D5A) 如上述項目中任一項記載之基材或感測器，其中上述胺基為一～四級胺基、脂肪族胺基、芳香族胺基、醯肼、胍、或脒。 (項目D5B) 如上述項目中任一項記載之基材或感測器，其中上述酸性基為羧基、磺酸基、或磷酸基。 (項目D5C) 如上述項目中任一項記載之基材或感測器，其中上述配位鍵性基為NTA基、或His標籤(His-tag)。 (項目D5D) 如上述項目中任一項記載之基材或感測器，其中上述肽配體為麩胱甘肽基、或RGD(Arg-Gly-Asp，精胺酸-甘胺酸-天冬醯胺)基。 (項目D5E) 如上述項目中任一項記載之基材或感測器，其中上述可逆性連結基為雙硫醚、吡啶雙硫醚、亞胺、肟、腙、硼酸環狀酯、羧酸酯、羧酸硫酯、或矽烷基。 (項目D6) 一種分析用感測器，其具有：A)基材； B)視需要之聚合物基質，其係配置於該基材上者，且該聚合物基質具有至少一部分適配對象分子之支架； C)配置於該支架之源自基於能夠在不損傷該基材之條件下分離之相互作用而與該核一體化之修飾物質之取代基； D)配置於該支架之訊號物質之結合用基或訊號物質；及 E)與成為檢測對象之分子結合之特異性結合性分子之結合用基。 (項目D6A) 一種分析用感測器，其具有：A)基材； B)視需要之聚合物基質，其係配置於該基材上者，且該聚合物基質具有至少一部分適配對象分子之支架； C)配置於該支架之源自利用能夠在不損傷該基材之條件下分離之分子間化學鍵而與該核一體化之修飾物質之取代基； D)配置於該支架之訊號物質之結合用基或訊號物質；及 E)與成為檢測對象之分子結合之特異性結合性分子之結合用基。 ＜E)直接型基材＞ (項目E1) 一種直接型分析用感測器製作用基材，其係直接型分析用感測器製造用基材，且包含： A)基材、 B)如上述項目中任一項記載之粒子、 C)視需要之配置於該基材且配置有該粒子之聚合物基質、及 D)視需要之位於最表層之阻斷劑。 (項目E2) 一種直接型分析用感測器，其具有： A)基材、 B)如上述項目中任一項記載之粒子、 C)視需要之配置於該基材且配置有該粒子之聚合物基質、及 D)視需要之位於該粒子上之特異性結合性分子之結合用基、及訊號物質之結合用基或訊號物質。 (項目E3) 一種用於製造直接型分析用感測器製作用基材之方法，其包含： A)提供如上述項目中任一項記載之粒子之步驟； B)將該粒子配置於基材之步驟； C)視需要，對固定有該粒子之該基材提供聚合物基質之原料之步驟；及 D)視需要，藉由將該基材供於該聚合物基質進行聚合之條件，而形成配置有該聚合物基質之基材之步驟。 (項目E4) 一種用於製造直接型分析用感測器之方法，其包含： A)提供如上述項目中任一項記載之粒子之步驟； B)將該粒子配置於基材之步驟； C)視需要，對固定有該粒子之該基材提供聚合物基質之原料之步驟； D)視需要，藉由將該基材供於該聚合物基質進行聚合之條件，而形成配置有該聚合物基質之基材之步驟；及 F)視需要，使測定所需之物質結合於該粒子之步驟。 (項目1) 一種粒子，其係包含(A)粒子核、及 (B)修飾物質之(C)粒子， 該粒子核包含(A1)粒子核之核、與(A2)粒子核上之含官能基之部分， 該修飾物質包含：(B-1)能夠與該粒子核結合且能形成分子間化學鍵之第一官能基、及(B-2)賦予分析用感測器所需性質之第二官能基，此處，(B-1)之官能基與(B-2)之結合用基相同或不同， 該粒子核與該修飾物質利用含有該第一官能基之部分與第一可能基之分子間化學鍵而與該粒子核一體化。 (項目1A) 如先前項目中任一項記載之粒子，其中上述(A1)粒子核之核為無機材料或有機材料。 (項目1AA) 如先前項目中任一項記載之粒子，其中上述(A1)粒子核之核為金屬(金、銀、鉑、摻錫氧化銦(ITO)、摻銻氧化錫(ATO)等)、金屬氧化物(氧化鐵、氧化鋁、氧化銅、氧化鈦、氧化鋅、氧化鋯、氧化鈰、氧化鈷等)、石墨烯、氧化石墨烯、奈米碳管、奈米金剛石、氮化物、氟化物、硫化物、硼化物、及該等之複合化合物、氫氧磷灰石、二氧化矽(氧化矽)、乳膠硬化物、葡聚糖、聚葡萄胺糖、聚乳酸、聚(甲基)丙烯酸、聚甲基丙烯酸甲酯、PLGA(poly(lactic-co-glycolica acid)聚乳酸-乙醇酸共聚物)、聚苯乙烯、聚伸乙基亞胺。 (項目1B) 如先前項目中任一項記載之粒子，其中上述(A2)含官能基之部分為酸性基、鹼性基、芳香族基、烷基、多組胺酸(His)標籤、金屬錯合物、生物素、馬來醯亞胺基、丙烯酸酯基等缺電子之不飽和碳基、碘乙醯胺基、硫醇基、吡啶二硫基、自由基加成系點擊化學用途之烯烴(乙烯基碸)/炔烴基、用於天然化學連接(Native chemical ligation)法之硫酯基、胺基、羰基、醛基、羥基、酚性羥基、羧酸活性酯基、二羥基硼基、順式二醇基(糖基)、(硫)內酯基、炔烴基或其衍生物或者疊氮基。 (項目1C) 如先前項目中任一項記載之粒子，其中上述(B-1)第一官能基為鹼性基、酸性基、芳香族基、烷基、多組胺酸(His)標籤、金屬錯合物、生物素、馬來醯亞胺基、丙烯酸酯基等缺電子之不飽和碳基、碘乙醯胺基、硫醇基、吡啶二硫基、自由基加成系點擊化學用途之烯烴(乙烯基碸)/炔烴基、用於天然化學連接法之硫酯基、胺基、羰基、醛基、羥基、酚性羥基、羧酸活性酯基、二羥基硼基、順式二醇基(糖基)、(硫)內酯基、炔烴基或其衍生物或者疊氮基。 (項目1D) 如項目1記載之粒子，其中上述(B-2)第二官能基為胺基、羧基、羧酸活性酯基、金屬錯合物(Ni-NTA基等)、硫醇基、吡啶二硫基、二硫基、馬來醯亞胺基、鹵化乙醯胺基、疊氮基、炔烴基(或其衍生物基)、生物素(或其結構類似物)、抗生物素蛋白(抗生物素蛋白、中性抗生物素蛋白、鏈黴抗生素蛋白(Avidin,Neutravidin,Streptavidin))、順式二醇基、二羥基硼基、或(硫)內酯基。 (項目1E) 如先前項目中任一項記載之粒子，其中上述(A2)含官能基之部分與上述(B-1)第一官能基係使以下之表中之左右部分相同之組合。 [表1A-1]
A-2(粒子核上官能基) B-1
酸性基 (羧基、磺基、磷酸基、矽烷醇基等) 鹼性基 (一級胺基、二級胺基、三級胺基、四級銨基、吡啶基、胍基、脒基、咪唑基、胺氧基等)
鹼性基 (一級胺基、二級胺基、三級胺基、四級銨基、吡啶基、胍基、脒基、咪唑基、胺氧基等) 酸性基 (羧基、磺基、磷酸基、矽烷醇基等)
芳香族基 (經取代或未經取代之芳基、伸芳基等) 芳香族基 (經取代或未經取代之芳基、伸芳基等)
烷基 (C=6以上之直鏈或分支結構) 烷基 (C=6以上之直鏈或分支結構)
多組胺酸(His)標籤 (6×His、8×His、10×His等) 金屬錯合物 (Ni-NTA(源自次氮基三乙酸鎳之基)等)
金屬錯合物 (Ni-NTA(源自次氮基三乙酸鎳之基)等) 多組胺酸(His)標籤 (6×His、8×His、10×His等)
生物素 (生物素、去硫生物素及亞胺生物素衍生物) 抗生物素蛋白 (抗生物素蛋白、中性抗生物素蛋白、鏈黴抗生素蛋白)
抗生物素蛋白 (抗生物素蛋白、中性抗生物素蛋白、鏈黴抗生素蛋白) 生物素 (生物素、去硫生物素及亞胺生物素衍生物)
馬來醯亞胺基、丙烯酸酯基等缺電子之不飽和碳基；碘乙醯胺基；硫醇基；吡啶二硫基；自由基加成系點擊化學用途之烯烴(乙烯基碸)/炔烴基；用於天然化學連接法之硫酯基等 硫醇基
硫醇基 馬來醯亞胺基、丙烯酸酯基等缺電子之不飽和碳基；碘乙醯胺基；硫醇基；吡啶二硫基；自由基加成系點擊化學用途之烯烴(乙烯基碸)/炔烴基；用於天然化學連接法之硫酯基等
胺基(一級胺基、二級胺基) 馬來醯亞胺基
馬來醯亞胺基 胺基(一級胺基、二級胺基)
胺基(一級胺基、二級胺基、胺氧基) 羰基、醛基
羰基、醛基 胺基(一級胺基、二級胺基、胺氧基)
胺基(一級胺基、二級胺基) 羥基、酚性羥基、硫醇基 羧酸活性酯基
羧酸活性酯基 胺基(一級胺基、二級胺基) 羥基、酚性羥基、硫醇基
二羥基硼基 順式二醇基 (糖基)
順式二醇基 (糖基) 二羥基硼基
胺基 (硫)內酯基
(硫)內酯基 胺基
炔烴基及其衍生物 疊氮基
疊氮基 炔烴基及其衍生物
(項目1F) 如先前項目中任一項記載之粒子，其中上述(A2)含官能基之部分與上述(B-1)第一官能基係使以下之表中之左右部分相同之組合。 [表1A-2]
A-2(粒子核上官能基) B-1
酸性基 鹼性基
鹼性基 酸性基
芳香族基 芳香族基
烷基 烷基
多組胺酸(His)標籤 金屬錯合物
金屬錯合物 多組胺酸(His)標籤
生物素 抗生物素蛋白
抗生物素蛋白 生物素
馬來醯亞胺基、丙烯酸酯基等缺電子之不飽和碳基；碘乙醯胺基；硫醇基；吡啶二硫基；自由基加成系點擊化學用途之烯烴(乙烯基碸)/炔烴基；用於天然化學連接法之硫酯基等 硫醇基
硫醇基 馬來醯亞胺基、丙烯酸酯基等缺電子之不飽和碳基；碘乙醯胺基；硫醇基；吡啶二硫基；自由基加成系點擊化學用途之烯烴(乙烯基碸)/炔烴基；用於天然化學連接法之硫酯基等
胺基 馬來醯亞胺基
馬來醯亞胺基 胺基
胺基 羰基、醛基
羰基、醛基 胺基
胺基、羥基、酚性羥基、硫醇基 羧酸活性酯基
羧酸活性酯基 胺基、羥基、酚性羥基、硫醇基
二羥基硼基 順式二醇基 (糖基)
順式二醇基 (糖基) 二羥基硼基
胺基 (硫)內酯基
(硫)內酯基 胺基
炔烴基及其衍生物 疊氮基
疊氮基 炔烴基及其衍生物
(項目1G) 如先前項目中任一項記載之粒子，其中上述(A2)含官能基之部分與上述(B-1)第一官能基係使以下之表中之左右部分相同之組合。 [表1A-3]
A-2(粒子核上官能基) B-1
羧基、磺基、磷酸基、矽烷醇基 一級胺基、二級胺基、三級胺基、四級銨基、吡啶基、胍基、脒基、咪唑基、胺氧基
一級胺基、二級胺基、三級胺基、四級銨基、吡啶基、胍基、脒基、咪唑基、胺氧基 羧基、磺基、磷酸基、矽烷醇基
芳香族基 (經取代或未經取代之芳基、伸芳基等) 經取代或未經取代之芳基、伸芳基
烷基 (C=6以上之直鏈或分支結構) 烷基 (C=6以上之直鏈或分支結構)
6×His、8×His、10×His Ni-NTA(源自次氮基三乙酸鎳之基
Ni-NTA(源自次氮基三乙酸鎳之基) 6×His、8×His、10×His等)
生物素、去硫生物素及亞胺生物素衍生物 抗生物素蛋白、中性抗生物素蛋白、鏈黴抗生素蛋白
抗生物素蛋白、中性抗生物素蛋白、鏈黴抗生素蛋白) 生物素、去硫生物素及亞胺生物素衍生物
馬來醯亞胺基、丙烯酸酯基等缺電子之不飽和碳基；碘乙醯胺基；硫醇基；吡啶二硫基；自由基加成系點擊化學用途之烯烴(乙烯基碸)/炔烴基；用於天然化學連接法之硫酯基 硫醇基
硫醇基 馬來醯亞胺基、丙烯酸酯基等缺電子之不飽和碳基；碘乙醯胺基；硫醇基；吡啶二硫基；自由基加成系點擊化學用途之烯烴(乙烯基碸)/炔烴基；用於天然化學連接法之硫酯基
一級胺基、二級胺基 馬來醯亞胺基
馬來醯亞胺基 一級胺基、二級胺基
一級胺基、二級胺基、胺氧基 羰基、醛基
羰基、醛基 一級胺基、二級胺基、胺氧基
一級胺基、二級胺基 羥基、酚性羥基、硫醇基 羧酸活性酯基
羧酸活性酯基 一級胺基、二級胺基 羥基、酚性羥基、硫醇基
二羥基硼基 順式二醇基 (糖基)
順式二醇基 (糖基) 二羥基硼基
胺基 (硫)內酯基
(硫)內酯基 胺基
炔烴基及其衍生物 疊氮基
疊氮基 炔烴基及其衍生物
(項目1H) 如項目1記載之粒子，其中上述(A2)含官能基之部分為酸性基，上述(B-1)第一官能基為鹼性基。 (項目2) 如先前項目中任一項記載之粒子，其用於製造分析用感測器製作用基材。 (項目3) 如先前項目中任一項記載之粒子，其包含一種或複數種上述修飾物質。 (項目4) 如先前項目中任一項記載之粒子，其中上述修飾物質含有能夠結合於基材之取代基。 (項目5) 如先前項目中任一項記載之粒子，其中上述修飾物質具有選自由可逆性連結基及聚合性官能基所組成之群中之至少一個基。 (項目6) 如先前項目中任一項記載之粒子，其中上述修飾物質具有聚合性官能基。 (項目7) 如先前項目中任一項記載之粒子，其中上述修飾物質進而具有選自由訊號物質之結合用基、訊號物質、及可逆性連結基所組成之群中之至少一個。 (項目8) 如先前項目中任一項記載之粒子，其中上述修飾物質包含針對靶物質之特異性結合性分子之結合用基及訊號物質之結合用基；針對靶物質之特異性結合性分子之結合用基及訊號物質；或可逆性連結基。 (項目9) 如先前項目中任一項記載之粒子，其中上述可逆性連結基為二硫基、亞胺鍵基、肟基、腙鍵基、硼酸環狀酯鍵、羧酸酯基、羧酸硫酯基、或抗生物素蛋白-生物素鍵。 (項目10) 如先前項目中任一項記載之粒子，其中上述針對靶物質之特異性結合性分子之結合用基為胺基、羧基、二羥基硼基、硫醇基、馬來醯亞胺基、羰基、醛基、胺氧基、羥基、醯肼基、生物素基、源自次氮基三乙酸鎳之基、硫醇基或吡啶二硫基。 (項目11) 如先前項目中任一項記載之粒子，其中上述訊號物質之結合用基為胺基、羧基、二羥基硼基、硫醇基、馬來醯亞胺基、羰基、醛基、胺氧基、羥基、醯肼基、生物素基、源自次氮基三乙酸鎳之基、硫醇基或吡啶二硫基。 (項目12) 如先前項目中任一項記載之粒子，其中上述訊號物質為螢光分子、含放射性元素之物質、磁性物質、或酵素。 (項目13) 如先前項目中任一項記載之粒子，其中上述能夠分離之分子間化學鍵為非共價鍵。 (項目14) 如先前項目中任一項記載之粒子，其中上述非共價鍵為靜電相互作用。 (項目15) 如先前項目中任一項記載之粒子，其中粒子核包含氧化矽、聚苯乙烯、聚乳酸、聚甲基丙烯酸甲酯、聚乳酸-乙醇酸共聚物、聚葡萄胺糖、氧化鐵、金、銀、鉑、氧化鋁、氧化銅、氧化鈦、氧化鋅、氧化鋯、氧化鈰、氧化鈷、摻錫氧化銦(ITO)、摻銻氧化錫(ATO)、石墨烯、氧化石墨烯、奈米碳管、奈米金剛石、或者氫氧磷灰石或該等之任意組合。 (項目16) 如先前項目中任一項記載之粒子，其中粒子核包含氧化矽、或聚苯乙烯。 (項目17) 一種分析用感測器製作用基材之製造套組，其包含如先前項目中任一項記載之粒子、及 基材。 (項目18) 如先前項目中任一項記載之分析用感測器製作用基材之製造套組，其進而包含聚合物基質之原料。 (項目19) 一種如先前項目中任一項記載之粒子之用途，用於製造分析用感測器製作用基材。 (項目20) 一種如先前項目中任一項記載之粒子之製作方法，其包含： A)提供粒子核之步驟； B)提供利用能夠分離之分子間化學鍵而能與該核一體化之修飾物質之步驟；及 C)將該粒子核與該修飾物質供於該粒子核與該修飾物質利用能夠分離之分子間化學鍵而一體化之條件之步驟。 (項目21) 一種用於製造分析用感測器製作用基材之方法，其包含 A)提供如先前項目中任一項記載之粒子之步驟； B)將該粒子配置於基材之步驟；及 C)藉由供於該粒子自該基材解離之條件而形成支架之步驟。 (項目22) 如先前項目中任一項記載之方法，其進而包含對固定有上述粒子之上述基材提供聚合物基質之原料之步驟。 (項目23) 如先前項目中任一項記載之方法，其進而包含藉由將上述基材供於上述聚合物基質進行聚合之條件，而形成配置有該聚合物基質之基材之步驟。 (項目24) 一種用於製造分析用感測器之方法，其包含： A)提供如先前項目中任一項記載之粒子之步驟； B)將該粒子配置於基材之步驟； C)藉由供於該粒子自該基材解離之條件而形成支架之步驟；及 D)使測定所需之物質結合於上述支架之步驟。 (項目25) 如先前項目中任一項記載之方法，其進而包含對配置有上述粒子之上述基材提供聚合物基質之原料之步驟。 (項目26) 如先前項目中任一項記載之方法，其進而包含藉由將上述基材供於上述聚合物基質進行聚合之條件，而形成配置有該聚合物基質之基材之步驟。 (項目27) 如先前項目中任一項記載之方法，其中於上述步驟C中，該粒子自該基材解離之條件為切斷可逆性連結基而製作可逆性結合基之條件。 (項目28) 如先前項目中任一項記載之方法，其中於上述步驟C之後，包含將支架內之上述可逆性結合基轉化為針對靶物質之特異性結合性分子之結合用基或訊號物質之結合用基之步驟。 (項目29) 一種分析用感測器製作用基材，其具有：A)基材； B)聚合物基質，其配置於該基材上，且該聚合物基質具有至少一部分適配對象分子之支架；及 C)配置於該支架之結合用基。 (項目30) 一種分析用感測器，其具有：A)基材； B)聚合物基質，其配置於該基材上，且該聚合物基質具有至少一部分適配對象分子之支架； C)鍵結於成為檢測對象之分子上之特異性結合性分子之結合用基。 (項目31) 如先前項目中任一項記載之基材或如先前項目中任一項記載之感測器，其中上述聚合物基質之潔淨度為95%以上。 (項目32) 如先前項目中任一項記載之基材或如先前項目中任一項記載之感測器，其中上述基材中之該支架之規格值為80%以上。 (項目33) 如先前項目中任一項記載之基材或如先前項目中任一項記載之感測器，其中於上述基材上結合有源自利用能夠分離之分子間化學鍵而與該核一體化之一種或複數種修飾物質之取代基。 (項目34) 如先前項目中任一項記載之基材或如先前項目中任一項記載之感測器，其中上述源自修飾物質之取代基為胺基、酸性基、配位鍵性基、羰基、醛基、酮基、二羥基硼基、順式二醇基、硫醇基、生物素基、去硫生物素基、肽配體或可逆性連結基。 (項目35) 如先前項目中任一項記載之基材或如先前項目中任一項記載之感測器，其中上述胺基為一～四級胺基、脂肪族胺基、芳香族胺基、醯肼、胍、或脒。 (項目36) 如先前項目中任一項記載之基材或如先前項目中任一項記載之感測器，其中上述酸性基為羧基、磺酸基、或磷酸基。 (項目37) 如先前項目中任一項記載之基材或如先前項目中任一項記載之感測器，其中上述配位結合性基為NTA基、或His標籤。 (項目38) 如先前項目中任一項記載之基材或如先前項目中任一項記載之感測器，其中上述肽配體為麩胱甘肽基、或RGD基。 (項目39) 如先前項目中任一項記載之基材或如先前項目中任一項記載之感測器，其中上述可逆性連結基為雙硫醚、吡啶雙硫醚、亞胺、肟、腙、硼酸環狀酯、羧酸酯、羧酸硫酯、或矽烷基。 (項目40) 一種分析用感測器，其具有：A)基材； B)聚合物基質，其配置於該基材上，且該聚合物基質具有至少一部分適配對象分子之支架； C)配置於該支架之源自利用分子間化學鍵而與該核一體化之修飾物質之取代基； D)配置於該支架之訊號物質之結合用基或訊號物質；及 E)鍵結於成為檢測對象之分子上之特異性結合性分子之結合用基。 (項目41) 一種直接型基材型分析用感測器製作用基材，其係直接型基材型分析用感測器製造用基材，且包含 A)基材、及 B)如先前項目中任一項記載之粒子。 (項目42) 如先前項目中任一項記載之直接型基材型分析用感測器製作用基材，其進而包含配置於上述基材且配置有該粒子之聚合物基質。 (項目43) 如先前項目中任一項記載之直接型基材型分析用感測器製作用基材，其進而於最表層包含阻斷劑。 (項目44) 一種直接型基材型分析用感測器，其具有 A)基材、及 B)如先前項目中任一項記載之粒子。 (項目45) 如先前項目中任一項記載之直接型基材型分析用感測器，其進而具有配置於上述基材且配置有該粒子之聚合物基質。 (項目46) 如先前項目中任一項記載之直接型基材型分析用感測器，其進而於最表層具有阻斷劑。 (項目47) 如先前項目中任一項記載之直接型基材型分析用感測器，其中於上述粒子上進而具有特異性結合性分子之結合用基、及訊號物質之結合用基或訊號物質。 (項目48) 一種用於製造直接型分析用感測器製作用基材之方法，其包含 A)提供如先前項目中任一項記載之粒子之步驟、及 B)將該粒子配置於基材之步驟。 (項目49) 如先前項目中任一項記載之方法，其進而包含對固定有上述粒子之上述基材提供聚合物基質之原料之步驟。 (項目50) 如先前項目中任一項記載之方法，其進而包含藉由將該基材供於上述聚合物基質進行聚合之條件，而形成配置有該聚合物基質之基材之步驟。 (項目51) 一種用於製造直接型分析用感測器之方法，其包含 A)提供如先前項目中任一項記載之粒子之步驟、及 B)將該粒子配置於基材之步驟。 (項目52) 如先前項目中任一項記載之方法，其進而包含對固定有上述粒子之該基材提供聚合物基質之原料之步驟。 (項目53) 如先前項目中任一項記載之方法，其進而包含藉由將該基材供於上述聚合物基質進行聚合之條件，而形成配置有該聚合物基質之基材之步驟。 (項目54) 如先前項目中任一項記載之方法，其進而包含使測定所需之物質結合於該粒子之步驟。
於本說明書中，意在上述一個或複數個特徵除了明示之組合以外，還能進一步組合再提供。關於本發明之進一步之實施方式及優點，業者只要視需要閱讀以下之詳細説明來理解便可掌握。 [發明之效果]
藉由利用本發明之相關技術，於製作使用分子壓印技術之細胞外囊泡檢測用途之支架(例如凹部或凸部)之技術中，相對於所投入之模板物質，支架(例如凹部或凸部)形成率飛躍性地提昇，期待每單位面積之支架(例如凹部或凸部)數之增加所帶來之感度提昇。又，與先前法相比，模板物質之去除變得格外容易，基材間之波動亦得到抑制，因此，於製程方面亦具有優點。本發明之方法於用於再現性良好地製作高感度之感測器基材之基礎技術方面佔據重要地位。
以下，對本發明更詳細地進行說明。
於本發明之整體中，應理解為單數形式之表達還包含其複數形式之概念，除非另有特別提及。因此，應理解為單數形式之表達(例如英語中之「a」、「an」、「the」等)還包含其複數形式之概念，除非另有特別提及。又，於本說明書中，應理解，所使用之用語係以該領域中常用之含義使用，除非另有特別提及。因此，只要未作其他定義，則本說明書中所使用之全部專業用語及科學技術用語具有與本發明所屬之領域之從業者通常理解之含義相同。於產生矛盾之情形時，本發明(包括定義在內)優先。
(定義) 首先，對本說明書中使用之用語及一般技術進行說明。
於本說明書中，「粒子核」係指具有成為於分析用感測器中用於形成設置於基材之支架(例如凹部或凸部)之模板之結構的基本物質，只要可用作分子壓印中之模板，便無特別限定，包含無機粒子及有機粒子。於尺寸位於nm範圍之情形時，有時稱為奈米粒子核，但本說明書中未嚴格區分，當稱為奈米粒子核時，只要未意圖尤其限定尺寸來敍述，則理解為亦包括具有更大或更小之核結構者。粒子核包含(A1)粒子核之核及(A2)粒子核上之含官能基之部分。
於本說明書中，「粒子核之核」係指構成粒子核之核，由其與含官能基之部分構成粒子核。作為粒子核之核之例，例舉於表1A之A1。具體而言，關於粒子核之核，例如作為無機粒子，可例舉：金屬(金、銀、鉑、摻錫氧化銦(ITO)、摻銻氧化錫(ATO)等)、金屬氧化物(氧化鐵、氧化鋁、氧化銅、氧化鈦、氧化鋅、氧化鋯、氧化鈰、氧化鈷等)、石墨烯、氧化石墨烯、奈米碳管、奈米金剛石、氮化物、氟化物、硫化物、硼化物、及該等之複合化合物、以及氫氧磷灰石等，較佳為例舉二氧化矽(氧化矽)。又，作為有機粒子，可例舉：乳膠硬化物、葡聚糖、聚葡萄胺糖、聚乳酸、聚(甲基)丙烯酸、聚甲基丙烯酸甲酯、PLGA(poly(lactic-co-glycolic acid)聚乳酸-乙醇酸共聚物)、聚苯乙烯、聚伸乙基亞胺等，但並不限定於該等。
於本說明書中，粒子核之核上之「含官能基之部分」係存在於粒子核之核上之含有官能基之部分，含官能基之部分係為了對粒子核之核賦予所需之性質進行修飾者。含官能基之部分之例記載於表1A之A2，含官能基之部分與第一官能基之較佳組合可為表1A之左右部分所例舉之官能基彼此。
作為粒子核之尺寸，可根據最終之分析用感測器所意圖之目標發生變動，可例舉約1 nm～約100 μm、約1 nm～約20 nm、約20 nm～約500 nm、約50 nm～約200 nm、約100 nm～約500 nm、約1 μm～約10 μm、約10 μm～約100 μm等，但並不限定於此。
於本說明書中，「能夠與粒子核結合且能形成分子間化學鍵之第一官能基」係指賦予經由含官能基之部分而與粒子核結合之能力之任意之官能基。第一官能基之例記載於表1A之B1，與含官能基之部分之較佳組合可為表1A之左右部分所例舉之官能基彼此。於本說明書中，有時將分子間化學鍵稱作相互作用，只要未特別提及，則該等以相同之含義使用。
於本說明書中，「賦予分析用感測器所需之性質之第二官能基」係指賦予分析用感測器所需之性質之任意之官能基，且係指賦予分析用感測器所需性質之基，例如包含訊號基、能夠結合於靶物質之結合基。第二官能基之例記載於表1A-4之B2。
作為粒子核上之官能基之具體例，可例舉下述表1A-4所示之基，但並不限定於該等。 [表1A-4]
粒子核材料(材質) 粒子核上官能基 與粒子核之相互作用(連結)用 備註(A2-B1間相互作用) 功能賦予用官能基
A-1(粒子核之核) A-2(粒子核上官能基) B-1 A2-B1間相互作用(連結)之種類 B-2(用以賦予所需性質之官能基)
無機材料 金屬(金、銀、鉑、摻錫氧化銦(ITO)、摻銻氧化錫(ATO)等)、金屬氧化物(氧化鐵、氧化鋁、氧化銅、氧化鈦、氧化鋅、氧化鋯、氧化鈰、氧化鈷等)、石墨烯、氧化石墨烯、奈米碳管、奈米金剛石、氮化物、氟化物、硫化物、硼化物、及該等之複合化合物、以及氫氧磷灰石、氧化矽) 酸性基 (羧基、磺基、磷酸基、矽烷醇基等) 鹼性基 (一級胺基、二級胺基、三級胺基、四級銨基、吡啶基、胍基、脒基、咪唑基、胺氧基等) 靜電相互作用、氫鍵 胺基(一級胺基、二級胺基、胺氧基) 羧基 羧酸活性酯基 金屬錯合物(Ni-NTA基等) 硫醇基 吡啶二硫基 二硫基 馬來醯亞胺基 鹵化乙醯胺基 疊氮基 炔烴基(或其衍生物基) 生物素(或其結構類似物) 抗生物素蛋白(抗生物素蛋白、中性抗生物素蛋白、鏈黴抗生素蛋白) 順式二醇基 二羥基硼基 (硫)內酯基
鹼性基 (一級胺基、二級胺基，三級胺基、四級銨基、吡啶基、胍基、脒基、咪唑基、胺氧基等) 酸性基 (羧基、磺基、磷酸基、矽烷醇基等)
芳香族基 (經取代或未經取代之芳基、伸芳基等) 芳香族基 (經取代或未經取代之芳基、伸芳基等) 疏水性相互作用、n-n相互作用
烷基 (C=6以上之直鏈或分支結構) 烷基 (C=6以上之直鏈或分支結構) 疏水性相互作用、凡得瓦力(vander Waals)
多組胺酸(His)標籤 (6×His、8×His、10×His等) 金屬錯合物 (Hi-NTA(源自次氮基三乙酸鎳之基)等) 配位鍵
金屬錯合物 (Ni-NTA(源自次氮基三乙酸鎳之基)等) 多組胺酸(His)標籤 (6×His、8×His、10×His等)
生物素 (生物素、去硫生物素及亞胺生物素衍生物) 抗生物素蛋白(抗生物素蛋白、中性抗生物素蛋白、鏈黴抗生素蛋白) 抗生物素蛋白-生物素相互作用
抗生物素蛋白(抗生物素蛋白、中性抗生物素蛋白、鏈黴抗生素蛋白) 生物素 (生物素、去硫生物素及亞胺生物素衍生物)
馬來醯亞胺基、丙烯酸酯基等缺電子之不飽和碳基；碘乙醯胺基；硫醇基；吡啶二硫基；自由基加成系點擊化學用途之烯烴(乙烯基碸)/炔烴基；用於天然化學連接法之硫酯基等 硫醇基 硫醚、雙硫鍵
有機材料 (乳膠硬化物、葡聚糖、聚葡萄胺糖、聚乳酸、聚(甲基)丙烯酸、聚甲基丙烯酸甲酯、PLGA(poly(lactic-co-glycolic acid)聚乳酸-二醇酸共聚物)、聚苯乙烯、聚伸乙基亞胺等) 硫醇基 馬來醯亞胺基、丙烯酸酯基等缺電子之不飽和碳基；碘乙醯胺基；硫醇基；吡啶二硫基；自由基加成系點擊化學用途之烯烴(乙烯基碸)/炔烴基；用於天然化學連接法之硫酯基等
胺基(一級胺基、二級胺基) 馬來醯亞胺基 麥可加成
馬來醯亞胺基 胺基(一級胺基、二級胺基)
胺基(一級胺基、二級胺基、胺氧基) 羰基、醛基 亞胺、肟鍵
羰基、醛基 胺基(一級胺基、二級胺基、胺氧基)
胺基(一級胺基、二級胺基) 羥基、酚性羥基、硫醇基 羧酸活性酯基 醯胺鍵、(硫)酯鍵
羧酸活性酯基 胺基(一級胺基、二級胺基、胺氧基) 羥基、酚性羥基、硫醇基
二羥基硼基 順式二醇基(糖基) 硼酸酯
順式二醇基(糖基) 二羥基硼基
胺基 (硫)內酯基 醯胺鍵
(硫)內酯基 胺基
炔烴基及其衍生物 疊氮基 點擊化學
疊氮基 炔烴基及其衍生物
於本說明書中，「修飾物質」係具有直接或間接地對分析用感測器或分析用感測器製造用基材賦予所意圖之功能之用途之物質，為了實現此種功能賦予，可包含各種官能基，或者形成結構內可包含各種官能基或如具有訊號基之結構。於本說明書中，修飾物質有利的是能夠與粒子核形成分子間化學鍵之物質，較佳為利用能夠在不損傷基材之條件下分離之分子間化學鍵而可與粒子核一體化，或利用能夠在不損傷粒子核之條件下分離之分子間化學鍵而可與粒子核一體化及/或能夠與粒子核形成分子間化學鍵之物質。修飾物質包含(B0)修飾物質核、(B-1)能夠與本發明之粒子核結合且能形成分子間化學鍵之第一官能基及/或(B2)賦予分析用感測器所需性質之第二官能基。作為第一及第二官能基之具體例，可例舉上述表3A所示之基，但並不限定於該等。以下物質為修飾物質之代表例，更詳細而言，修飾物質於本發明之其他處所進行了詳述。可例舉：聚異丙基丙烯醯胺共聚物、聚(甲基)丙烯醯胺共聚物、聚乳酸衍生物、聚(甲基)丙烯酸共聚物、聚(甲基)丙烯酸甲酯共聚物、聚(甲基)丙烯酸羥基乙酯共聚物、聚葡萄胺糖衍生物、及聚離胺酸衍生物以及該等之組合等，但並不限定於該等。又，一種或複數種修飾物質亦可與粒子核一體化。
於本說明書中，所謂「能夠在不損傷粒子核之條件下分離」，當針對修飾物質進行闡述時，係指修飾物質與粒子核之間之分子間化學鍵能夠分離，且粒子核未實質受損之任意之條件。此時，代表性而言，只要為粒子核之核未實質受損之條件，便可認為是粒子核未實質受損之條件。此處，粒子核只要在所使用之分析用感測器中未對檢測造成實質性障礙，便可理解為未實質受損。較佳為，將粒子核配置於基板上，在不損傷粒子核之情況下將粒子核與基材之分子間化學鍵切斷，從而可將粒子核與基材分離。作為能夠在不損傷奈米粒子之條件下分離之分子間化學鍵，例如可例舉靜電相互作用等非共價鍵、雙硫鍵等共價鍵等，但並不限定於該等。
於本說明書中，所謂「能夠在不損傷基材之條件下分離」，當針對修飾物質進行闡述時，係指修飾物質與粒子核之間之分子間化學鍵能夠分離，且意圖使用修飾物質之分析用感測器之基材未實質受損之任意之條件。此處，基材只要在所使用之分析用感測器中未對檢測造成實質性障礙，便可理解為未實質受損。較佳為，將粒子核配置於基材上，在不損傷基材之情況下將粒子核與基材之分子間化學鍵切斷，從而可將粒子核與基材分離。作為能夠在不損傷基材之條件下分離之分子間化學鍵，例如可例舉靜電相互作用等非共價鍵、雙硫鍵等共價鍵，但並不限定於該等。於本說明書中，業者應理解，「能夠在不損傷粒子核之條件下分離」與「能夠在不損傷基材之條件下分離」有時可能使用相同之條件。
於本說明書中，「一體化」通常係指物質彼此成為一個整體，當針對修飾物質及粒子核進行闡述時，只要在分析用感測器或分析用感測器製造用基材之製造時之環境下，處於只有在供於「能夠在不損傷粒子核之條件下分離」及/或「能夠在不損傷基材之條件下分離」之條件之情形時才會解離之狀態及/或形成了分子間化學鍵，則可藉由任何作用進行一體化。作為此種作用，可例舉共價鍵或非共價鍵。
於本說明書中，「非共價鍵」係指藉由不為共價鍵之分子間化學鍵而使物質彼此進行分子間化學結合之任意鍵或相互作用。例如可例舉氫鍵、靜電相互作用、疏水性相互作用等，但並不限定於該等。
於本說明書中，「基」除非有另外指定，否則係指一價基。作為不為一價基之例，可例舉伸烷基(二價)等。又，於本說明書中使用時，有時省略用語「基」。
於本說明書中，「可逆性連結基」係指切斷(斷鍵)及鍵結具可逆性之直接鍵或二價以上之基。具體例可例舉下述表2A之1-3中所示之基，但並不限定於該等。
[表2A-1]
1-1 1-2 1-3 1-4
結合性官能基 對應之結合性官能基 可逆性連結基 可逆部分之鍵樣式
(針對靶分子之特異性結合性分子之結合用基) (結合性基) (可逆性連結基)   
(訊號物質之結合用基) (結合性基)   
硫醇基、二硫基、吡啶二硫基 硫醇基、二硫基、吡啶二硫基 二硫基 共價鍵
二羥基硼基 糖基 硼酸環狀酯 共價鍵
二羥基硼基 順式二醇基 硼酸環狀酯 共價鍵
羰基、醛基 胺基 亞胺鍵基 共價鍵
胺基 羰基、醛基
羧基 羥基 羧酸酯基 共價鍵
羥基 羧基/羧酸活性酯基
羧基 硫醇基 羧酸硫酯基 共價鍵
硫醇基 羧基/羧酸活性酯基
胺氧基 羧基、醛基 肟基 共價鍵
羰基、醛基 胺氧基
羧基、醛基 羥基 縮醛基 共價鍵
羥基 羧基、醛基
[表2A-2]
金屬錯合物 (Ni-NTA(源自次氮基三乙酸鎳之基)等) 多組胺酸(His)標籤 (6×His、8×His、10×His等) 配位鍵 非共價鍵
鹼性基 (胺基、環狀二級胺基(例如吡咯啶基)、哌啶基、吡啶基、咪唑基、胍基等) 酸性基 (羧基/羧酸活性酯基等) 氫鍵 非共價鍵
羥基   
酸性基 鹼性基 非共價鍵
(羧基等) (胺基、環狀二級胺基 (例如吡咯啶基、哌啶基)、吡啶基、咪唑基、胍基等)、羥基
芳香族基 (胺基苯基等苯基、胺基萘基等萘基、吡啶基等) 芳香族基 (胺基苯基等苯基、胺基萘基等萘基、吡啶基等) 疏水鍵 非共價鍵
醯肼 羰基、醛基 腙鍵基 共價鍵
羰基、醛基 醯肼
抗生物素蛋白(中性抗生物素蛋白、鏈黴抗生物素蛋白) 生物素(生胞素、脫生物素) 抗生物素蛋白-生物素鍵 非共價鍵
生物素(生胞素、脫生物素) 抗生物素蛋白(中性抗生物素蛋白、鏈黴抗生物素蛋白)
麩胱甘肽(GSH) 麩胱甘肽-S-轉移酶(GST) 麩胱甘肽(GSH)-麩胱甘肽-S-轉移酶 非共價鍵
[表2A-3]
麩胱甘肽-S-轉移酶(GST) 麩胱甘肽(GSH) (GST)鍵   
Phos標籤 磷酸根離子 配位鍵 非共價鍵
磷酸根離子 Phos標籤
於本說明書中，「能夠形成分子間化學鍵之…官能基」係指可於不同分子間進行結合之官能基。具體例可例舉下述表3A所示之基，但並不限定於該等。 [表3A]
分子間化學鍵之種類 粒子核上官能基 能夠與粒子核形成分子間化學鍵之官能基
B-1
靜電相互作用 氫鍵 酸性基 (羧基、磺基、磷酸基、矽烷醇基等) 鹼性基 (一級胺基、二級胺基、三級胺基、四級銨基、吡啶基、胍基、脒基、咪唑基、胺氧基等)
靜電相互作用 氫鍵 鹼性基 (一級胺基、二級胺基、三級胺基，四級銨基、吡啶基、胍基、脒基、咪唑基、胺氧基等) 酸性基 (羧基、磺基、磷酸基、矽烷醇基等)
疏水性相互作用 pai-pai相互作用 芳香族基 (經取代或未經取代之芳基、伸芳基等) 芳香族基 (經取代或未經取代之芳基、伸芳基等)
疏水性相互作用 分子間力 烷基 (C=6以上之直鏈或分支結構) 烷基 (C=6以上之直鏈或分支結構)
配位鍵 多組胺酸(His)標籤 (6×His、8×His、10×His等) 金屬錯合物 (Ni-NTA(源自次氮基三乙酸鎳之基)等)
配位鍵 金屬錯合物 (Ni-NTA(源自次氮基三乙酸鎳之基)等) 多組胺酸(His)標籤 (6×His、8×His、10×His等)
抗生物素蛋白-生物素相互作用 生物素 (生物素、去硫生物素及亞胺生物素衍生物) 抗生物素蛋白 (抗生物素蛋白、中性抗生物素蛋白、鏈黴抗生素蛋白)
抗生物素蛋白-生物素相互作用 抗生物素蛋白 (抗生物素蛋白、中性抗生物素蛋白、鏈黴抗生素蛋白) 生物素 (生物素、去硫生物素及亞胺生物素衍生物)
硫醚 雙硫鍵 馬來醯亞胺基、丙烯酸酯基等缺電子之不飽和碳基；碘乙醯胺基；硫醇；吡啶二硫基；自由基加成系點擊化學用途之烯烴(乙烯基碸)/炔烴基；用於天然化學連接法之硫酯基等 硫醇基
硫醚 雙硫鍵 麥可加成 硫醇基 馬來醯亞胺基、丙烯酸酯基等缺電子之不飽和碳基；碘乙醯胺基；硫醇基；吡啶二硫基；自由基加成系點擊化學用途之烯烴(乙烯基碸)/炔烴基；用於天然化學連接法之硫酯基等
麥可加成 胺基(一級胺基、二級胺基) 馬來醯亞胺基
馬來醯亞胺基 胺基(一級胺基、二級胺基)
亞胺鍵 胺基(一級胺基、二級胺基、胺氧基) 羰基、醛基
肟鍵 羰基、醛基 胺基(一級胺基、二級胺基、胺氧基)
醯胺鍵 酯鍵 硫酯鍵 胺基(一級胺基、二級胺基) 羥基、酚性羥基、硫醇基 羧酸活性酯基
羧酸活性酯基 胺基(一級胺基、二級胺基) 羥基、酚性羥基、硫醇基
硼酸酯 二羥基硼基 順式二醇基 (糖基)
順式二醇基 (糖基) 二羥基硼基
醯胺鍵 胺基 內酯基 硫內酯基
內酯基 硫內酯基 胺基
點擊化學 炔烴基及其衍生物 疊氮基
疊氮基 炔烴基及其衍生物
於本說明書中，「聚合性官能基」係指與其他之能夠聚合之官能基聚合而可形成聚合物之官能基。例如可例舉乙烯基、烯丙基、環氧基、(甲基)丙烯醯基及(甲基)丙烯醯胺基等，但並不限定於該等。
於本說明書中，「能夠結合於基材之取代基」係指藉由與位於基板上之取代基進行共價鍵結或非共價鍵結而能夠配置於基板上之基。例如可例舉上述表2A所示之基，但並不限定於該等。
於本說明書中，「基材」係指成為分析用感測器基礎之物質。基材之材料例如可為選自由金屬、金屬氧化物、玻璃、紙(纖維素)、二氧化矽、矽及樹脂以及該等之組合所組成之群中之材料。作為金屬，可例舉：金、銀、銅、鋁、鈦、鎢、及鉬等，但並不限定於該等。作為樹脂，可例舉：聚(甲基)丙烯酸酯、聚苯乙烯、ABS(丙烯腈-丁二烯-苯乙烯共聚物)、聚碳酸酯、聚酯、聚乙烯、聚丙烯、尼龍、聚胺基甲酸酯、矽酮樹脂、氟樹脂、甲基戊烯樹脂、酚樹脂、三聚氰胺樹脂、環氧樹脂、及氯乙烯樹脂等，但並不限定於該等。
於本說明書中，「聚合物基質」係指形成基質之聚合物，通常係指單體進行聚合所形成之物質。有利的是，基質只要在配置於本發明之分析用感測器或分析用感測器用基材時，具有適合感測器之形狀及結構，便可為任何形狀或結構。基質之形狀或結構例如為薄膜狀或球狀(粒子狀)。作為基質之較佳構成，為了儘可能抑制目標以外成分之吸附，基質之主成分為生物相容性較高者。
於本說明書中，「聚合物基質之原料」係指可藉由反應而形成聚合物基質之原料。一般而言，為了形成聚合物基質，包含至少1種單體與至少1種之適當之聚合起始劑便充足，除該等以外，例如亦可包含追加之單體(可一部分聚合)、追加之聚合起始劑、交聯劑、RAFT(Reversible-addition fragmentation chain transfer，可逆-加成斷裂鏈轉移)劑、觸媒、還原劑或溶劑等。作為單體，可例舉：苯乙烯、N-異丙基丙烯醯胺、2-甲基丙烯醯氧基乙基磷酸膽鹼等，但並不限定於該等。作為聚合起始劑，可例舉：2,2'-偶氮雙(異丁腈)(AIBN)、α-溴異丁酸乙酯等，但並不限定於該等。交聯劑可例舉三聚氰胺化合物、胍胺化合物、甘脲化合物、N,N'-亞甲基雙丙烯醯胺、及(三、四、五、六、聚)乙二醇二甲基丙烯酸酯等，但並不限定於該等。作為RAFT劑，可例舉苯并二硫代酸苄酯、2-氰基-2-[(十二烷基硫基硫羰基)硫基]丙烷等，但並不限定於該等。觸媒可例舉CuBr 2等，但並不限定於該等。還原劑可例舉抗壞血酸等，但並不限定於該等。作為溶劑，可自通常已知作為溶劑者中無特別限制地選擇，例如可例舉純水、緩衝液、MeOH、EtOH、DMA(dimethyl acetamide，二甲基乙醯胺)及DMF(dimethyl formamide，二甲基甲醯胺)等，但並不限定於該等。
於本說明書中，「分析用感測器」係指可特異性地識別靶物質並進行分析之感測器。
於本說明書中，「分析用感測器製作用基材」係指用於製作分析用感測器之任意之基材，形狀及材質只要適於分析用感測器，便可使用任意者。較佳為，分析用感測器製作用基材係具有支架(例如凹部或凸部)之基材，此處，有利的是構成為，藉由對支架(例如凹部或凸部)進行特異性結合性分子之結合用基及訊號物質之結合用基修飾，使用者可簡便地對能夠感度更高地對檢測對象進行檢測之感測器進行自設定。於本說明書中，「分析用感測器製作用基材」亦被稱為「測定基材」。
於本說明書中，「分子壓印聚合物」係指用於分子壓印技術之任意之聚合物(參照Takeuchi. T et. al. Chromatography, 2016, 37 (2), 43-64.)，較佳係指具有對如下靶物質之結合空間的物質識別材料，該靶物質係藉由利用共價鍵及/或非共價形成靶物質或其衍生物與功能性單體之複合體，與交聯劑一併進行聚合後再去除靶物質而獲得。
於本說明書中，「有…至少一部分適配分子」係指具有如於用於分析用感測器之情形時能夠實質地進行對象分子之檢測或分析之形狀及/或結構。
於本說明書中，「支架」係指於用於本發明之分析用感測器之情形時用以供測定所需之物質結合並使之穩定化之部分，可為凹部亦可為凸部，可使結合基(可逆性結合基、特異性結合性分子之結合基、訊號物質之結合用基等)固定或穩定化。
於本說明書中，「凹部」係指於用於本發明之分析用感測器之情形時旨在捕捉靶物質而形成之空隙或空孔，較佳係指於分析用感測器中形成之聚合物基質上形成之空孔部。
於本說明書中，「最表層」係指本發明之感測器或感測器製作用基材中位於最表面之層，當對基材或聚合物基質或者該等利用追加之物質進行了塗覆時，可指此種追加之物質。
於本說明書中，「直接型基材」係指於用於本發明之分析用感測器之情形時，具有附著有旨在捕捉靶物質而形成之修飾物質之核粒子或核粒子之基材，較佳為具有於分析用感測器中形成之聚合物基質上所形成之附著有修飾物質之核粒子或核粒子之基材。直接型基材可包含形成為凸型之基材、使用立方體狀之核並形成聚合物基質達至該核之高度以上而得之基材，但並不限定於此。
於本說明書中，「聚合物基質進行聚合之條件」或「聚合物基質之原料進行聚合之條件」係指於存在聚合物基質之原料之情形時，可使聚合物基質聚合之條件。
於本說明書中，「功能性單體」係指聚合時，所製作之聚合物或使用該聚合物之感測器或基材中能夠賦予某些功能之官能基，例如可例舉具有鹼性基、酸性基、經取代或未經取代之芳香族基及二羥基硼基等作為分子間化學結合基之單體。作為鹼性基，可例舉經取代或未經取代之胺基、經取代或未經取代之含氮芳香族基、脒基、及胍基等，但並不限定於該等。作為酸性基，可例舉羧基、磺基及磷酸基等，但並不限定於該等。作為經取代或未經取代之芳香族基，可例舉經取代或未經取代之芳基、及經取代或未經取代之伸芳基等，但並不限定於該等。
於本說明書中，「粒子自基材解離之條件」係指藉由將配置於基板上之粒子切斷基材與粒子之分子間化學鍵而可將基材與粒子剝離的條件。例如可例舉加溫、冷卻、pH值之調整(酸處理、鹼處理)、利用含有界面活性劑之溶液進行之洗淨、超音波照射、光照射、振盪、及還原處理。
於本說明書中，「測定所需之物質」係指可捕捉靶物質並進行檢測之物質。例如可例舉捕捉劑、標記等。捕捉劑係指用以捕捉測定對象之任意之藥劑，例如可例舉抗體、抗體片段、抗體擬抗體、核酸適體(包括DNA、RNA、肽核酸、人工核酸)、磷脂識別蛋白、及凝集素。
於本說明書中，「訊號物質」係指能夠檢測出靶物質之物質。例如可例舉螢光分子、含放射性元素之物質、磁性物質等。基於檢測容易性等之觀點，訊號物質較佳為螢光物質。例如藉由導入螢光物質-螢光物質對或螢光物質-消光物質對，可利用螢光(Forster)共振能量轉移(FRET)之抑制(或促進)來檢測靶物質之結合。又，藉由導入形成酵素級聯之異種酵素來檢測酵素級聯抑制，藉此可檢測出靶物質。
於本說明書中，「標記」係指用以自另外之渠道識別靶分子或物質之事物(例如物質、能量、電磁波等)。作為此種標記方法，可例舉RI(放射性同位素)法、螢光法、生物素法、化學發光法等。於本說明書中，當利用複數種(2種以上)標記物或捕捉其之因子或方法及螢光法進行標記時，藉由螢光發光極大波長互不相同之螢光物質進行標記。螢光發光極大波長之差較佳為10 nm以上。當對配體進行標記時，只要不對功能造成影響，則可使用任意者，作為螢光物質，可例示Alexa TMFluor BODIPY、ATTO、量子點(QDot)及螢光蛋白(GFP(Green Fluorescent Protein，綠色螢光蛋白)、YFP(Yellow Fluorescent Protein，黃色螢光蛋白)、mCherry等)。Alexa TMFluor係對香豆素、若丹明、螢光素、花青素等進行修飾而得之水溶性螢光色素，係與廣範圍之螢光波長對應之系列，與其他之所屬波長之螢光色素相比，非常穩定且明亮，又，pH敏感性較低。作為螢光極大波長為10 nm以上之螢光色素之組合，可例舉：Alexa TM555與Alexa TM633之組合、Alexa TM488與Alexa TM555之組合等。於對核酸進行標記之情形時，只要能與其鹼基部分結合，則可使用任意者，較佳為使用花青色素(例如CyDyeTM系列之Cy3、Cy5等)、若丹明6G試劑、2-乙醯胺基茀(AAF)、AAIF(AAF之碘衍生物)等。作為螢光發光極大波長之差為10 nm以上之螢光物質，例如可例舉Cy5與若丹明6G試劑之組合、Cy3與螢光素之組合、若丹明6G試劑與螢光素之組合等。於本發明中，可利用此種標記對目標對象進行改良以使目標對象能夠由所使用之檢測方法進行檢測。此種改良於該領域中為公知，業者可根據標記及目標對象適當實施此種方法。
於本說明書中，「切斷可逆性連結基而製作可逆性結合基之條件」係指切斷可逆性連結基之後，使所切斷之相同之可逆性連結基或不同之可逆性連結基結合而製作新的可逆性連結基之條件。
於本說明書中，「針對靶物質之特異性結合性分子之結合用基」係指能夠與可對靶物質特異性地結合之特異性結合性分子結合的基。針對靶物質之特異性結合性分子之結合用基例如可例舉表2A之2-1中例舉之結合性官能基。
[表2A-1]
2-1 2-2
結合性官能基 對應之結合性官能基
(針對靶分子之特異性結合性分子之結合用基) (結合性基)
(訊號物質之結合用基結合性基) (結合性基)
胺基(一價胺基、二價胺基等) 羧酸活性酯基 (使用N-羥基丁二醯亞胺、硝基苯酚、五氟苯酚等之活性酯基；NHS胺基甲酸酯等胺基甲酸活性酯基)；羧基；醛基；異氰酸基；異硫氰酸基；環氧基；馬來醯亞胺基等
胺基 羧基
羧基 胺基
糖基(順式二醇基) 二羥基硼基
二羥基硼基 糖基(順式二醇基)
[表2A-2]
硫醇基 馬來醯亞胺基、丙烯酸酯基等缺電子之不飽和碳基；碘乙醯胺基；硫醇基；吡啶二硫基；自由基加成系點擊化學用途之烯烴(乙烯基碸)/炔烴基；用於天然化學連接法之硫酯基等
馬來醯亞胺基、丙烯酸酯基等缺電子之不飽和碳基；碘乙醯胺基；硫醇基；吡啶二硫基；自由基加成系點擊化學用途之烯烴(乙烯基碸)/炔烴基；用於天然化學連接法之硫酯基等 硫醇基
羰基、醛基 胺基
胺基 羰基、醛基
胺氧基 羰基、醛基
羰基、醛基 胺氧基
羰基、醛基 羥基
羥基 羰基、醛基
羥基、酚性羥基 羧酸活性酯基
金屬錯合物 (Ni-NTA(源自次氮基三乙酸鎳之基)等) 多組胺酸(His)標籤(6×His、8×His、10×His)
醯肼基 羰基、醛基
羰基、醛基 醯肼
抗生物素蛋白(中性抗生物素蛋白、鏈黴抗生物素蛋白) 生物素(生胞素、脫生物素)
生物素(生胞素、脫生物素) 抗生物素蛋白(中性抗生物素蛋白、鏈黴抗生物素蛋白)
麩胱甘肽(GSH) 麩胱甘肽-S-轉移酶
麩胱甘肽-S-轉移酶 麩胱甘肽(GSH)
於本說明書中，「訊號物質之結合用基」係指能夠修飾訊號物質之基。作為訊號物質，可例舉螢光分子、含放射性元素之物質、磁性物質等。基於檢測容易性等之觀點，訊號物質較佳為螢光物質。訊號物質之結合用基例如可例舉表3A之2-1中例舉之結合性官能基。
[表3A-1]
2-1 2-2
結合性官能基 對應之結合性官能基
(針對靶分子之特異性結合性分子之結合用基) (結合性基)
(訊號物質之結合用基結合性基) (結合性基)
胺基(一價胺基、二價胺基等) 羧酸活性酯基 (使用N-羥基丁二醯亞胺、硝基苯酚、五氟苯酚等之活性酯基；NHS胺基甲酸酯等胺基甲酸活性酯基)；羧基；醛基；異氰酸基；異硫氰酸基；環氧基；馬來醯亞胺基等
胺基 羧基
羧基 胺基
糖基(順式二醇基) 二羥基硼基
二羥基硼基 糖基(順式二醇基)
硫醇基 馬來醯亞胺基、丙烯酸酯基等缺電子之不飽和碳基；碘乙醯胺基；硫醇基；吡啶二硫基；自由基加成系點擊化學用途之烯烴(乙烯基碸)/炔烴基；用於天然化學連接法之硫酯基等
馬來醯亞胺基、丙烯酸酯基等缺電子之不飽和碳基；碘乙醯胺基；硫醇基；吡啶二硫基；自由基加成系點擊化學用途之烯烴(乙烯基碸)/炔烴基；用於天然化學連接法之硫酯基等 硫醇基
[表3A-2]
羰基、醛基 胺基
胺基 羰基、醛基
胺氧基 羰基、醛基
羰基、醛基 胺氧基
羰基、醛基 羥基
羥基 羰基、醛基
羥基、酚性羥基 羧酸活性酯基
金屬錯合物 (Ni-NTA(源自次氮基三乙酸鎳之基)等) 多組胺酸(His)標籤 (6×His、8×His、10×His)
醯肼基 羰基、醛基
羰基、醛基 醯肼
抗生物素蛋白(中性抗生物素蛋白、鏈黴抗生物素蛋白) 生物素(生胞素、脫生物素)
生物素(生胞素、脫生物素) 抗生物素蛋白(中性抗生物素蛋白、鏈黴抗生物素蛋白)
麩胱甘肽(GSH) 麩胱甘肽-S-轉移酶
麩胱甘肽-S-轉移酶 麩胱甘肽(GSH)
於本說明書中，「分析用感測器所需之性質」包含於用於分析用感測器之情形時能夠結合於靶物質及/或能與訊號物質結合之性質。
於本說明書中，「潔淨度」係指配置於基板上之粒子於洗淨後被去除之比率。測定潔淨度之方法例如可例舉：使用經螢光標記(FITC)之氧化矽奈米粒子並進行洗淨，對洗淨後被去除與否進行觀察之方法；或利用掃描式電子顯微鏡對殘存氧化矽進行觀察之方法等。潔淨度較佳為95%以上。
於本說明書中，「規格值」係指相對於固定於基板上之模板粒子數，模板粒子去除前或模板粒子去除後導入有螢光分子之支架(例如凹部或凸部)之比率。規格值較佳為80%以上。
於本說明書中，「源自修飾物質之取代基」係指包含存在於修飾物質上之取代基或源自修飾物質之取代基進行反應而能夠變化之結構的基。例如代表性取代基為胺基(一～四級、脂肪族、芳香族、吡啶、醯肼、胍、脒)、酸性基(羧基、磺酸基、磷酸基)、配位鍵性基(NTA基、His標籤等)、羰基(醛基、酮基)、二羥基硼基、順式二醇基(含鄰苯二酚、糖鏈結構)、硫醇基、生物素基、去硫生物素基、肽配體(麩胱甘肽基、RGD基)、及可逆結合基(雙硫醚、吡啶雙硫醚、亞胺、肟、腙、硼酸環狀酯、羧酸酯、羧酸硫酯、矽烷基)等。又，亦可具有一種或複數種之源自修飾物質之取代基。
於本說明書中，「直接型分析用感測器製作用基材」係指基材上包含粒子與視需要之聚合物基質，且可於所配置之粒子上修飾測定所需之物質的基材。
於本說明書中，「阻斷劑」係指妨礙聚合物基質以外之非特異性吸附之物質。例如，阻斷劑可例舉BSA(牛血清白蛋白)等蛋白質、或無蛋白阻斷緩衝液(Protein Free Blocking buffer)等非蛋白質(Non-Protein)者，但並不限定於該等。
(較佳之實施方式) 以下，對本發明之較佳之實施方式進行說明。以下提供之實施方式係為了更充分地理解本發明而提供，應理解，本發明之範圍不應限定於以下之記載。因此，業者明確，可參考本發明中之記載而在本發明之範圍內適當進行改變。又，應理解，本發明之以下之實施方式可單獨使用或將其等組合使用。
＜修飾物質一體化粒子＞ 於一態樣中，本發明提供一種粒子，其包含粒子核、及利用能夠在不損傷該粒子核之條件下分離之分子間化學鍵而與該粒子核一體化之修飾物質。
於一態樣中，本發明提供一種粒子，其係包含(A)粒子核、及(B)修飾物質之(C)粒子；此處，該粒子核包含(A1)粒子核之核、與(A2)粒子核上之含官能基之部分，該修飾物質包含：(B-1)能夠與該粒子核結合且能形成分子間化學鍵之第一官能基、及(B-2)賦予分析用感測器所需性質之第二官能基，此處，(B-1)之官能基與(B-2)之結合用基相同或不同，該粒子核與該修飾物質經由該能夠分離之官能基利用分子間化學鍵而與該粒子核一體化。
於另一態樣中，提供一種用於製造分析用感測器製作用基材之粒子，該粒子包含粒子核、及利用能夠在不損傷該基材之條件下分離之分子間化學鍵而與該核一體化之修飾物質。
於另一態樣中，提供一種用於製造分析用感測器製作用基材之粒子，該粒子包含粒子核、及利用分子間化學鍵而與該核一體化之修飾物質。
於本發明之粒子之實施方式中，修飾物質可為藉由非共價鍵形式之分子間化學鍵而與粒子核一體化之任意之物質，以及/或者可為能夠與粒子核一體化之任意之聚合物。
於本發明之粒子之一實施方式中，修飾物質不為可以共價鍵與粒子核結合之單體。
於一實施方式中，能夠在不損傷粒子核之條件下分離之分子間化學鍵包括非共價鍵或一部分共價鍵。是否於本發明中為較佳之共價鍵可藉由確認是否有如下情形來判定：當欲在不損傷粒子核之條件下將粒子核與修飾物質分離時，存在至少一個共價鍵能夠分離之條件。即，只要發現至少一個不損傷粒子核之條件，該共價鍵便包含於該粒子核與修飾物質之組合中所採用之共價鍵中。
於一實施方式中，能夠在不損傷基材(例如分析用感測器製作用基材)之條件下分離之分子間化學鍵包括非共價鍵或一部分共價鍵。是否於本發明中為較佳之共價鍵可藉由確認是否有如下情形來判定：當欲在不損傷意圖之基材之條件下將粒子核與修飾物質分離時，存在至少一個共價鍵能夠分離之條件。即，只要發現至少一個不損傷意圖之基材之條件，該共價鍵便包含於該粒子核與修飾物質之組合中所採用之共價鍵中。
如本發明之粒子之類之模板物質有利的是可與所欲形成之支架(例如凹部或凸部)對應地導入各種官能基。先前需要利用特定之牢固之共價鍵來導入該等官能基，模板物質之製作會耗費勞力及時間。於本發明中，提供一種核-殼型模板分子，其係預先將所需之官能基作為修飾物質進行一體化，將該修飾物質利用能夠在不損傷測定用基材之條件下分離之分子間化學鍵而附著於核物質而形成殼。該核-殼型模板分子於其周圍形成聚合物基質時被穩定地固定於基板上，但形成聚合物基質之後，先前必須在使模板物質溶解之程度之強條件下進行洗淨才能去除之模板物質利用數分鐘之洗淨便可去除。
於本發明中，所使用之粒子核只要能夠用作分子壓印中之模板，便無特別限定，可例舉人工製造之無機粒子及有機粒子。作為無機粒子，可例舉：金屬(金、銀、鉑、摻錫氧化銦(ITO)、摻銻氧化錫(ATO)等)、金屬氧化物(氧化鐵、氧化鋁、氧化銅、氧化鈦、氧化鋅、氧化鋯、氧化鈰、氧化鈷等)、石墨烯、氧化石墨烯、奈米碳管、奈米金剛石、氮化物、氟化物、硫化物、硼化物、及該等之複合化合物、以及氫氧磷灰石等，較佳為例舉二氧化矽(氧化矽)。又，作為有機粒子，可例舉：乳膠硬化物、葡聚糖、聚葡萄胺糖、聚乳酸、聚(甲基)丙烯酸、聚甲基丙烯酸甲酯、PLGA(poly(lactic-co-glycolic acid)聚乳酸-乙醇酸共聚物)、聚苯乙烯、聚伸乙基亞胺等。
於本發明中，所使用之修飾物質係能夠與粒子核形成分子間化學鍵之物質，可例示於結構內可包含各種官能基之物質。作為該官能基，可例舉胺基(一～四級、脂肪族、芳香族、吡啶、醯肼、胍、脒)、酸性基(羧基、磺酸基、磷酸基)、配位鍵性基(NTA基、His標籤等)、羰基(醛基、酮基)、二羥基硼基、順式二醇基(含鄰苯二酚、糖鏈結構)、硫醇基、生物素基、去硫生物素基、肽配體(麩胱甘肽基、RGD基)、及可逆結合基(雙硫醚、吡啶雙硫醚、亞胺、肟、腙、硼酸環狀酯、羧酸酯、羧酸硫酯、矽烷基)等。
修飾物質之合成可以如下方式實施：使用單體、RAFT劑、聚合起始劑、及溶劑，進行RAFT聚合，合成聚合物。藉由聚合物內之一級胺基與甲基丙烯酸之縮合來合成修飾物質。或者，亦可利用以下之方法來實施修飾物質之合成：藉由對胱胺等分子內具有可逆性連結基及能夠與粒子核形成分子間化學鍵之基的化合物進行聚合性官能基之修飾，而合成修飾物質。
本發明之粒子為修飾物質一體化粒子。本發明之包含粒子核、及利用能夠在不損傷該粒子核之條件下分離之分子間化學鍵而與該粒子核一體化之修飾物質的粒子可藉由將粒子核與修飾物質供於能夠進行分子間化學結合之條件下進行一體化而提供。例如可以如下方式實施。 1)將粒子核之分散液、及修飾物質進行混合並攪拌，反應後對本發明之粒子進行純化。 2)將粒子核之分散液、及修飾物質進行混合並攪拌，反應後進行離心分離，去除溶液中之反應物後，對本發明之粒子進行純化。 3)將粒子核配置於基材上，向其添加修飾物質。或者， 4)使修飾物質固定(吸附)於基材上，向其添加粒子核，進而添加修飾物質。
為了利用能夠在不損傷粒子核之條件下分離之分子間化學鍵進行結合，可藉由非共價鍵使修飾物質與粒子核一體化，或者藉由共價鍵使作為聚合物之修飾物質鍵結來實現。
於一實施方式中，修飾物質含有能夠結合於基材之取代基。於一實施方式中，能夠結合於基材之取代基可藉由共價鍵或非共價鍵，與存在於基板上之官能基進行分子間化學結合。於一實施方式中，非共價鍵可為靜電相互作用。於一實施方式中，能夠結合於基材之取代基可為一級胺、二級胺、三級胺、及四級胺等陽離子性官能基。
於一實施方式中，修飾物質具有聚合性官能基。於一實施方式中，聚合性官能基可為乙烯基、烯丙基、環氧基、(甲基)丙烯醯基或(甲基)丙烯醯胺基，較佳者可為(甲基)丙烯醯基。 於一實施方式中，修飾物質具有針對靶物質之特異性結合性分子之結合用基及訊號物質之結合用基、針對靶物質之特異性結合性分子之結合用基及訊號物質、或可逆性連結基。 於一實施方式中，針對靶物質之特異性結合性分子之結合用基可為胺基、羧基、二羥基硼基、硫醇基、馬來醯亞胺基、羰基、醛基、胺氧基、羥基、醯肼基、生物素基、源自次氮基三乙酸鎳之基、硫醇基或吡啶二硫基，較佳者可為生物素基、源自次氮基三乙酸鎳之基、硫醇基或吡啶二硫基。於一實施方式中，訊號物質之結合用基可為胺基、羧基、二羥基硼基、硫醇基、馬來醯亞胺基、羰基、醛基、胺氧基、羥基、醯肼基、生物素基、源自次氮基三乙酸鎳之基、硫醇基或吡啶二硫基，較佳者可為生物素基、源自次氮基三乙酸鎳之基、硫醇或吡啶二硫基。於一實施方式中，訊號物質可為螢光分子、含放射性元素之物質、磁性物質、或酵素，較佳者可為螢光分子。於一實施方式中，可逆性連結基可為雙硫鍵、硼酸順式二醇酯、硼酸環狀酯鍵、亞胺鍵基、羧酸酯基、羧酸硫酯基、肟基、腙鍵基、抗生物素蛋白-生物素鍵、縮醛基、配位鍵、氫鍵、或疏水鍵，較佳者可為雙硫鍵、或配位鍵。
於一實施方式中，粒子核為無機粒子或有機粒子。於一實施方式中，作為無機粒子，可為金屬(金、銀、鉑、摻錫氧化銦(ITO)、摻銻氧化錫(ATO)等)、金屬氧化物(氧化鐵、氧化鋁、氧化銅、氧化鈦、氧化鋅、氧化鋯、氧化鈰、氧化鈷等)、石墨烯、氧化石墨烯、奈米碳管、奈米金剛石、氮化物、氟化物、硫化物、硼化物、及該等之複合化合物、以及氫氧磷灰石，較佳為二氧化矽(氧化矽)。於一實施方式中，有機粒子可為乳膠硬化物、葡聚糖、聚葡萄胺糖、聚乳酸、聚(甲基)丙烯酸、聚甲基丙烯酸甲酯、PLGA(poly(lactic-co-glycolic acid)聚乳酸-乙醇酸共聚物)、聚苯乙烯、聚伸乙基亞胺。
於一實施方式中，粒子核可藉由混合而與修飾物質一體化。 ＜分析用感測器製作用基材用粒子之製造＞ 於一態樣中，本發明提供一種分析用感測器製作用基材之製造套組，其包含本發明之粒子、基材、以及聚合物基質之原料，上述本發明之粒子包含粒子核、及利用能夠在不損傷該粒子核之條件下分離之分子間化學鍵而與該粒子核一體化之修飾物質。
此處，作為粒子，可採用修飾物質一體化粒子之項等中之任意之實施方式。作為基材，只要為適於所意圖之分析之材料，便可使用任何物質。基材之材料例如可為選自由金屬、玻璃、二氧化矽、矽及樹脂以及該等之組合所組成之群中之材料。作為金屬，可例舉金、銀、銅、鋁、鎢、及鉬等，但並不限定於該等。作為樹脂，可例舉：聚(甲基)丙烯酸酯、聚苯乙烯、ABS(丙烯腈-丁二烯-苯乙烯共聚物)、聚碳酸酯、聚酯、聚乙烯、聚丙烯、尼龍、聚胺基甲酸酯、矽酮樹脂、氟樹脂、甲基戊烯樹脂、酚樹脂、三聚氰胺樹脂、環氧樹脂、及氯乙烯樹脂等，但並不限定於該等。
聚合物基質之原料只要為適於所意圖之分析之材料，便可使用任何物質。一般而言，為了形成聚合物基質，聚合物基質之原料包含至少1種單體及至少1種之適當之聚合起始劑便充足，但除該等以外，例如亦可包含追加之單體(可一部分聚合)、追加之聚合起始劑、交聯劑、RAFT劑、觸媒、還原劑或溶劑等。作為單體，可例舉：苯乙烯、N-異丙基丙烯醯胺、2-甲基丙烯醯氧基乙基磷酸膽鹼等，但並不限定於該等。作為聚合起始劑，可例舉：2,2'-偶氮雙(異丁腈)(AIBN)、α-溴異丁酸乙酯等，但並不限定於該等。交聯劑可例舉三聚氰胺化合物、胍胺化合物、甘脲化合物、N,N'-亞甲基雙丙烯醯胺、及(三、四、五、六、聚)乙二醇二甲基丙烯酸酯等，但並不限定於該等。作為RAFT劑，可例舉：苯并二硫代酸苄酯、2-氰基-2-[(十二烷基硫基硫羰基)硫基]丙烷等，但並不限定於該等。觸媒可例舉CuBr 2等，但並不限定於該等。還原劑可例舉抗壞血酸等，但並不限定於該等。溶劑可自通常已知作為溶劑者中無特別限制地選擇，例如可例舉純水、緩衝液、MeOH、EtOH、DMA及DMF等，但並不限定於該等。
於一實施方式中，本發明之包含粒子核及利用能夠在不損傷該粒子核之條件下分離之分子間化學鍵而與該粒子核一體化之修飾物質的粒子可用於製作分析用感測器製作用基材。
於一實施方式中，提供一種本發明之粒子之製作方法，本發明之粒子包含粒子核、及利用能夠在不損傷該粒子核之條件下分離之分子間化學鍵而與該粒子核一體化之修飾物質。該方法包含：A)提供粒子核之步驟；B)提供利用能夠在不損傷該粒子核之條件下分離之分子間化學鍵而與該粒子核一體化之修飾物質之步驟；及C)將該粒子核與該修飾物質供於一體化之條件之步驟。此處，有利的是，一體化之條件可為該粒子核與該修飾物質能夠在不損傷該基材之條件下分離之分子間化學鍵。於將該粒子用於分析用感測器或分析用感測器製作用基材之情形時，有利的是，一體化之條件可為基材與修飾物質能夠在不損傷該基材之條件下分離之分子間化學鍵。應理解，粒子核及修飾物質以及一體化條件可採用本發明中之其他處所、例如＜修飾物質一體化粒子＞、＜分析用感測器製作用基材用粒子之製造＞等項中記載之任意之實施方式。
於一實施方式中，提供一種本發明之粒子之製作方法，該粒子包含粒子核、及將該粒子核利用分子間化學鍵而與該粒子核一體化之修飾物質。該方法包含：A)提供粒子核之步驟；B)提供將該粒子核利用分子間化學鍵而與該粒子核一體化之修飾物質之步驟；及C)將該粒子核與該修飾物質供於一體化之條件之步驟。此處，有利的是，一體化之條件可為該粒子核與該修飾物質於該基材上形成分子間化學鍵。於將該粒子用於分析用感測器或分析用感測器製作用基材之情形時，有利的是，一體化之條件可為基材與修飾物質形成分子間化學鍵。應理解，粒子核及修飾物質以及一體化條件可採用本發明中之其他處所、例如＜修飾物質一體化粒子＞、＜分析用感測器製作用基材用粒子之製造＞等項中記載之任意之實施方式。
＜分析用感測器製作用基材及分析用感測器之製造＞ 於另一態樣中，本發明提供一種用於製造分析用感測器製作用基材之方法。該方法包含：A)提供包含本發明之粒子核、及利用能夠在不損傷該粒子核之條件下分離之分子間化學鍵而與該粒子核一體化之修飾物質的粒子之步驟；及B)將該粒子配置於基材之步驟；C)視需要，對固定有該粒子之該基材提供聚合物基質之原料之步驟；D)視需要，藉由將該基材供於該聚合物基質進行聚合之條件，而形成配置有該聚合物基質之基材之步驟；及E)藉由供於該粒子自該基材解離之條件而形成支架(例如凹部或凸部)之步驟。應理解，粒子核、修飾物質、一體化可採用本發明中之其他處所、例如＜修飾物質一體化粒子＞、＜分析用感測器製作用基材用粒子之製造＞等項中記載之任意之實施方式。
於另一態樣中，本發明提供一種用於製造分析用感測器製作用基材之方法。該方法包含：A)提供包含本發明之粒子核及將該粒子核利用分子間化學鍵而與該粒子核一體化之修飾物質的粒子之步驟；及B)將該粒子配置於基材之步驟；C)視需要，對固定有該粒子之該基材提供聚合物基質之原料之步驟；D)視需要，藉由將該基材供於該聚合物基質進行聚合之條件，而形成配置有該聚合物基質之基材之步驟；及E)藉由供於該粒子自該基材解離之條件而形成支架(例如凹部或凸部)之步驟。應理解，粒子核、修飾物質、一體化可採用本發明中之其他處所、例如＜修飾物質一體化粒子＞、＜分析用感測器製作用基材用粒子之製造＞等項中記載之任意之實施方式。
本發明之提供包含粒子核及利用能夠在不損傷該粒子核之條件下分離之分子間化學鍵而與該粒子核一體化之修飾物質的粒子之步驟可利用任意之方法實施，例如將粒子核之分散液、及修飾物質進行混合並攪拌，反應後對本發明之粒子進行純化。應理解，本發明之粒子可採用本發明中之其他處所、例如＜修飾物質一體化粒子＞、＜分析用感測器製作用基材用粒子之製造＞等項中記載之任意之實施方式。
本發明之提供包含粒子核及將該粒子核利用分子間化學鍵而與該粒子核一體化之修飾物質的粒子之步驟可利用任意之方法實施，例如將粒子核之分散液、及修飾物質進行混合並攪拌，反應後對本發明之粒子進行純化。應理解，本發明之粒子可採用本發明中之其他處所、例如＜修飾物質一體化粒子＞、＜分析用感測器製作用基材用粒子之製造＞等項中記載之任意之實施方式。
於本發明中，將粒子配置於基材之步驟可利用任意之方法實施，例如藉由將本發明之粒子分散於溶液中並滴至基材上，然後靜置來配置。
於本發明中，對固定有粒子之該基材提供聚合物基質之原料之步驟可利用任意之方法實施，例如可藉由添加聚合性單體，並提供源自修飾物質之聚合性官能基及聚合性單體作為基質來實施。
於本發明中，藉由將該基材供於聚合物基質進行聚合之條件，而形成配置有該聚合物基質之基材之步驟可利用任意之方法實施，例如添加聚合性單體，將源自修飾物質之聚合性官能基及聚合性單體作為基質，將聚合起始性基作為聚合性起始劑，而合成位於本發明之粒子之局部表面之聚合物。藉此，可形成具有支架(例如凹部或凸部)之基材表面。
於本發明中，藉由供於該粒子自基材解離之條件而形成支架(例如凹部或凸部)之步驟可藉由任意之步驟來實施，例如可使可逆性連結基斷鍵，而將本發明之粒子去除。
於另一態樣中，本發明提供一種用於製造分析用感測器之方法。該方法包含：A)提供包含本發明之粒子核及利用能夠在不損傷該粒子核之條件下分離之分子間化學鍵而與該粒子核一體化之修飾物質的粒子之步驟；及B)將該粒子配置於基材之步驟；C)視需要，對固定有該粒子之該基材提供聚合物基質之原料之步驟；D)視需要，藉由將該基材供於該聚合物基質進行聚合之條件，而形成配置有該聚合物基質之基材之步驟；E)藉由供於該粒子自該基材解離之條件而形成支架(例如凹部或凸部)之步驟；及F)使測定所需之物質結合於上述支架(例如凹部或凸部)之步驟。應理解，該方法可採用本發明中之其他處所、例如＜修飾物質一體化粒子＞、＜分析用感測器製作用基材用粒子之製造＞等項中記載之任意之實施方式。
於另一態樣中，本發明提供一種用於製造分析用感測器之方法。該方法包含：A)提供包含本發明之粒子核及將該粒子核利用分子間化學鍵而與該粒子核一體化之修飾物質的粒子之步驟；B)將該粒子配置於基材之步驟；C)視需要，對固定有該粒子之該基材提供聚合物基質之原料之步驟；D)視需要，藉由將該基材供於該聚合物基質進行聚合之條件，而形成配置有該聚合物基質之基材之步驟；E)藉由供於該粒子自該基材解離之條件而形成支架(例如凹部或凸部)之步驟；及F)使測定所需之物質結合於上述支架(例如凹部或凸部)之步驟。應理解，該方法可採用本發明中之其他處所、例如＜修飾物質一體化粒子＞、＜分析用感測器製作用基材用粒子之製造＞等項中記載之任意之實施方式。
於一實施方式中，步驟E中，該粒子自該基材解離之條件係切斷可逆性連結基而製作可逆性結合基之條件。
於另一實施方式中，本發明之方法於步驟E之後，包含將支架(例如凹部或凸部)內之上述可逆性結合基轉化為針對靶物質之特異性結合性分子之結合用基及訊號物質之結合用基之步驟。
於一實施方式中，使測定所需之物質結合於上述支架(例如凹部或凸部)之步驟可利用任意之方法來實施，例如可藉由對利用還原而於支架(例如凹部或凸部)內生成之斷鍵之可逆性連結基進行特異性結合性分子之結合用基或訊號物質之結合用基修飾來實施。
＜分析用感測器製作用基材＞ 於另一態樣中，本發明提供一種分析用感測器製作用基材，其係利用如下方法製造，該方法包含：A)提供包含本發明之粒子核及利用能夠在不損傷該粒子核之條件下分離之分子間化學鍵而與該粒子核一體化之修飾物質的粒子之步驟；B)將該粒子配置於基材之步驟；C)視需要，對固定有該粒子之該基材提供聚合物基質之原料之步驟；D)視需要，藉由將該基材供於該聚合物基質進行聚合之條件，而形成配置有該聚合物基質之基材之步驟；及E)藉由供於該粒子自該基材解離之條件而形成支架(例如凹部或凸部)之步驟。應理解，該基材可採用本發明中之其他處所、例如＜修飾物質一體化粒子＞、＜分析用感測器製作用基材用粒子之製造＞、＜分析用感測器製作用基材及分析用感測器之製造＞等項中記載之任意之實施方式。
於另一態樣中，本發明提供一種分析用感測器製作用基材，其係利用如下方法製造，該方法包含：A)提供包含本發明之粒子核及利用分子間化學鍵而與該粒子核一體化之修飾物質的粒子之步驟；B)將該粒子配置於基材之步驟；C)視需要，對固定有該粒子之該基材提供聚合物基質之原料之步驟；D)視需要，藉由將該基材供於該聚合物基質進行聚合之條件，而形成配置有該聚合物基質之基材之步驟；及E)藉由供於該粒子自該基材解離之條件而形成支架(例如凹部或凸部)之步驟。應理解，該基材可採用本發明中之其他處所、例如＜修飾物質一體化粒子＞、＜分析用感測器製作用基材用粒子之製造＞、＜分析用感測器製作用基材及分析用感測器之製造＞等項中記載之任意之實施方式。
於一實施方式中，本發明提供一種分析用感測器製作用基材，其具有：A)基材；B)視需要之聚合物基質，其係配置於該基材上者，且該聚合物基質具有至少一部分適配對象分子之支架(例如凹部或凸部)；及C)配置於該支架(例如凹部或凸部)之結合用基。
於另一態樣中，本發明提供一種分析用感測器，其具有：A)基材；B)視需要之聚合物基質，其係配置於該基材上者，且該聚合物基質具有至少一部分適配對象分子之支架(例如凹部或凸部)；C)視需要之配置於該支架(例如凹部或凸部)之訊號物質之結合用基或訊號物質、及D)與成為檢測對象之分子結合之特異性結合性分子之結合用基。應理解，該感測器可採用本發明中之其他處所、例如＜修飾物質一體化粒子＞、＜分析用感測器製作用基材用粒子之製造＞、＜分析用感測器製作用基材及分析用感測器之製造＞等項中記載之任意之實施方式。
於一實施方式中，本發明中使用之聚合物基質之潔淨度較佳為95%以上(用氫氟酸所無法達成之程度)。於用氫氟酸之氧化矽粒子去除不充分之情形時，藉由對基材表面進行元素分析(EDX)，可評價為潔淨度不足。或者，進而較佳為除潔淨度以外，有時可以支架(例如凹部或凸部)功能化之良率，基於製造法進行區別。作為潔淨度之較佳之數值，可例舉95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上等。
於一實施方式中，本發明提供本發明之基材中之該支架(例如凹部或凸部)之規格值具有80%以上之測定基材。於本說明書中，上述「規格值」係指以基材上所固定之模板粒子數作為參數，模板粒子去除後導入有螢光分子(或經螢光分子修飾之抗生物素蛋白)之支架(例如凹部或凸部)個數之比率。作為規格值之較佳之數值，可例舉80%以上、85%以上、90%以上、95%以上等。
於一實施方式中，本發明提供一種於基材上結合有源自修飾物質之取代基之測定基材。於一實施方式中，提供一種測定基材，其中源自修飾物質之取代基為(胺基(一～四級、脂肪族、芳香族、吡啶、醯肼、胍、脒)、酸性基(羧基、磺酸基、磷酸基)、配位鍵性基(NTA基、His標籤等)、羰基(醛基、酮基)、二羥基硼基、順式二醇基(含鄰苯二酚、糖鏈結構)、硫醇基、生物素基、去硫生物素基、肽配體(麩胱甘肽基、RGD基)、可逆結合基(雙硫醚、吡啶雙硫醚、亞胺、肟、腙、硼酸環狀酯)、化學上能夠相對容易切斷之共價鍵(羧酸酯、羧酸硫酯、矽烷基)。 ＜E)直接型基材＞ 於另一態樣中，本發明提供一種直接型分析用感測器製造用基材。該直接型分析用感測器製造用基材包含：A)基材；B)本發明之粒子；及C)配置於該基材且配置有該粒子之聚合物基質。令人吃驚的是，該直接型基材可直接用作感測器。又，應理解，該基材可採用本發明中之其他處所、例如＜修飾物質一體化粒子＞、＜分析用感測器製作用基材用粒子之製造＞、＜分析用感測器製作用基材及分析用感測器之製造＞等項中記載之任意之實施方式。
於一態樣中，本發明提供一種直接型分析用感測器。該直接型分析用感測器包含：A)基材；B)包含本發明之粒子核及利用能夠在不損傷該粒子核之條件下分離之分子間化學鍵而與該粒子核一體化之修飾物質之粒子；C)視需要之配置於該基材且配置有該粒子之聚合物基質；D)視需要之位於最表層之阻斷劑；及E)視需要之位於該粒子上之測定所需之物質。應理解，該感測器可採用本發明中之其他處所、例如＜修飾物質一體化粒子＞、＜分析用感測器製作用基材用粒子之製造＞、＜分析用感測器製作用基材及分析用感測器之製造＞等項中記載之任意之實施方式。
於一態樣中，本發明提供一種直接型分析用感測器。該直接型分析用感測器包含：A)基材；B)包含本發明之粒子核及利用分子間化學鍵而與該粒子核一體化之修飾物質之粒子；C)視需要之配置於該基材且配置有該粒子之聚合物基質；D)視需要之位於最表層之阻斷劑；及E)視需要之位於該粒子上之測定所需之物質。應理解，該感測器可採用本發明中之其他處所、例如＜修飾物質一體化粒子＞、＜分析用感測器製作用基材用粒子之製造＞、＜分析用感測器製作用基材及分析用感測器之製造＞等項中記載之任意之實施方式。
於一實施方式中，阻斷劑可為BSA(牛血清白蛋白)等蛋白質及無蛋白阻斷緩衝液等非蛋白質，較佳為無蛋白阻斷緩衝液。
於一實施方式中，測定所需之物質係具有特異性結合性分子之結合用基、訊號物質之結合用基或訊號物質之物質。於一實施方式中，特異性結合性分子之結合用基可為胺基、羧基、糖基(順式二醇基)、二羥基硼基、硫醇基、馬來醯亞胺基、羰基、醛基、胺氧基、或羥基，較佳為糖基(順式二醇基)或硫醇基。於一實施方式中，訊號物質之結合用基為胺基、羧基、糖基(順式二醇基)、二羥基硼基、硫醇基、馬來醯亞胺基、羰基、醛基、胺氧基、或羥基，較佳為糖基(順式二醇基)或硫醇基。於一實施方式中，訊號物質為螢光分子、含放射性元素之物質、磁性物質、或酵素，較佳為螢光分子。
於一實施方式中，本發明提供一種用於製造直接型分析用感測器製作用基材之方法。該方法包含：A)提供包含本發明之粒子核及利用能夠在不損傷該粒子核之條件下分離之分子間化學鍵而與該粒子核一體化之修飾物質的粒子之步驟；B)將該粒子配置於基材之步驟；C)視需要，對固定有該粒子之該基材提供聚合物基質之原料之步驟；及D)視需要，藉由將該基材供於該聚合物基質進行聚合之條件，而形成配置有該聚合物基質之基材之步驟。
於一實施方式中，本發明提供一種用於製造直接型分析用感測器之方法。該方法包含：A)提供包含本發明之粒子核及利用能夠在不損傷該粒子核之條件下分離之分子間化學鍵而與該粒子核一體化之修飾物質的粒子之步驟；B)將該粒子配置於基材之步驟；C)視需要，對固定有該粒子之該基材提供聚合物基質之原料之步驟；D)視需要，藉由將該基材供於該聚合物基質進行聚合之條件，而形成配置有該聚合物基質之基材之步驟；及F)視需要，使測定所需之物質結合於該粒子之步驟。
於一實施方式中，本發明提供一種用於製造直接型分析用感測器之方法。該方法包含：A)提供包含本發明之粒子核及利用分子間化學鍵而與該粒子核一體化之修飾物質的粒子之步驟；B)將該粒子配置於基材之步驟；C)視需要，對固定有該粒子之該基材提供聚合物基質之原料之步驟；D)視需要，藉由將該基材供於該聚合物基質進行聚合之條件，而形成配置有該聚合物基質之基材之步驟；及F)視需要，使測定所需之物質結合於該粒子之步驟。
(製作方法) 用於製造分析用感測器之步驟可以如下方式實施。將粒子核之分散液、及修飾物質進行混合並攪拌，反應後，對本發明之粒子進行純化。藉由將本發明之粒子分散於溶液中並滴至基材上，然後靜置來配置。添加聚合性單體，提供源自修飾物質之聚合性官能基及聚合性單體作為基質。使用聚合起始性基作為聚合性起始劑，而合成位於本發明之粒子之局部表面之聚合物。藉此，形成具有支架(例如凹部或凸部)之基材表面。使可逆性連結基斷鍵，而去除本發明之粒子。對於支架(例如凹部或凸部)內生成之斷鍵之可逆性連結基進行特異性結合性分子之結合用基及訊號物質之結合用基修飾。
(用途) 本發明之分析用感測器用於檢測對象之感測。作為更具體之用途，可根據具特異性之結合性基之種類來決定，例如可用於基於腎功能、肝功能、炎症之有無或程度；腫瘤之有無或程度等之診斷目的或治療監測等目的。本發明之技術能夠應用於以使用分子壓印之空孔形成作為基礎技術之一切感測晶片之製作，對於感測晶片之大量生產而言不可或缺。
本發明之分析用感測器可用於以下之用途。
可利用於：測定對象之體內(in vivo)/體外(in vitro)成像或治療用途、 人體或環境中之病毒感測、及 食品、農作物、家畜等之分析。
以上，示出較佳之實施方式對本發明進行了說明以便容易理解。以下，基於實施例對本發明進行說明，但上述之說明及以下之實施例僅以例示之目的提供，並非以限定本發明之目的提供。因此，本發明之範圍既不受本發明中具體記載之實施方式限定，亦不受實施例限定，而僅由申請專利範圍限定。 [實施例]
本實施例中，對本發明之化合物之製造、用途相關之實施例進行說明。
再者，細胞之顯微鏡觀察使用CKX31(OLYMPUS, Tokyo, Japan)，離心分離器使用KUBOTA2 800(KUBOTA, Tokyo, Japan)，保溫箱使用水套式二氧化碳培養箱(CO2 WATER JACKETED INCUBATOR)(Thermo Fisher Scientific Inc, Massachusetts, USA)，高壓釜使用KS-243(TOMY SEIKO Co, Ltd., Tokyo, Japan)，清潔台使用無菌清潔台(ORIENTAL GIKEN INC, Tokyo, Japan)。胞外體濃度測定使用qNano Gold(Izon Science Ltd., Christchurch, New Zealand)。又，金基材之UV臭氧處理使用UV Ozone Cleaner(BioForce Nanosciences, Inc.)，螢光測定使用附帶SIC自動分注裝置(SYSTEM INSTRUMENTS Co., Ltd., Tokyo, Japan)之螢光顯微鏡(Olympus Corporation, Tokyo, Japan)及作為分光學軟體之Andor SOLIS(Andor Technology Ltd, Belfast, Northern Ireland)。
又，MALDI-TOF-MS(Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight-Mass Spectrometry，基質輔助雷射脫附/游離-飛行時間-質譜)使用MALDI-TOF/MS(MALDI-7090，島津製作所)，解析軟體使用(MALDI Solutions，島津製作所)，校準使用蛋白質校正標準I(protein calibration standard I)(Bruker公司)。基質使用芥子酸。CD光譜使用J-725型圓二色性分散計(日本分光, Tokyo, Japan)。為了製備緩衝液，利用桌上pH計F-52(HORIBA, Kyoto, JAPAN)測定pH值。螢光光譜測定使用日立高新技術製造之螢光分光光度計(Fluorescence spectrophotometer)F-2500(Tokyo, Japan)進行。用於超濾之超濾膜使用Amicon Ultra-4(10kDa)。吸收光譜測定使用Thermo ScientificTM Nano drop TM One超微量紫外可視分光光度計(Thermo Fisher)。所製作之粒子之平均粒徑及多分散指數(PDI)係利用ZETASIZER NANO-ZS MAL500735(Malvern, UK)藉由動態光散射法(Dynamic Light Scattering，DLS)進行測定，解析軟體使用Zetasizer軟體。TEM解析使用穿透式電子顯微鏡(JEM-1230，日本電子製造)。
(實施例1：修飾物質之合成) 1-1.實驗操作 1-1-1.聚合物之合成
[化1]
1-1-1.聚合物E2之合成
[化2]
將表1-1所示之配方之試劑溶解於DMF(2 mL)，進行脫氣氬氣置換後，於油浴(75℃)中進行24小時聚合反應。將反應後之溶液冷卻，使之與空氣接觸，藉此使反應停止，然後將反應溶液滴至二乙醚中，藉此產生沈澱，並回收該沈澱。將該操作重複進行2次。對回收之沈澱進行真空乾燥，藉此獲得聚合物(E2-0)。(產量：100 mg) 將所獲得之聚合物100 mg分散於二氯甲烷/二㗁烷＝1/1(v/v)溶液(10 mL)中，向其中添加甲基丙烯酸N-丁二醯亞胺酯92 mg(0.5 mmol)、三乙胺(TEA)140 μL(1.0 mmol)，於室溫下攪拌24小時。將反應後之溶劑利用蒸發器減壓蒸餾去除，向殘渣中添加少量之二氯甲烷，進而添加過量之己烷而產生沈澱，回收由此產生之沈澱(進行2次該操作)。對所獲得之沈澱進行真空乾燥，藉此獲得聚合物E2。(產量：101 mg) 基於 1H-NMR(DMSO-d6中)(AVANCE-500，Bruker)，對所獲得之聚合物E2推定組成。(圖1-1)
[表1-1]
表1-1聚合物E2合成配方
   試樣 濃度
主原料 N-異丙基丙烯醯胺(NIPAm) 300 mM
陽離子性部分 N-(3-二甲胺基丙基)甲基丙烯醯胺鹽酸鹽 100 mM
修飾部位 Cys-甲基丙烯醯胺鹽酸鹽 100 mM
RAFT劑 2-氰基-2-[(十二烷基硫基硫羰基)硫基]丙烷 12.5 mM
起始劑 2,2'-偶氮雙(異丁腈)(AIBN) 6.25 mM
溶劑 DMF 2 mL
1-1-2.聚合物E3之合成
[化3]
將表1-2所示之配方之試劑溶解於DMF(2 mL)，進行脫氣氬氣置換後，於油浴(75℃)中進行24小時聚合反應。將反應後之溶液冷卻，使之與空氣接觸，藉此使反應停止，然後將反應溶液滴至二乙醚中，藉此產生沈澱，並回收該沈澱。將該操作重複進行2次。對回收之沈澱進行真空乾燥，藉此獲得聚合物。(產量：105 mg) 將該聚合物分散於二氯甲烷(10 mL)中，向其中添加甲基丙烯酸N-丁二醯亞胺酯110 mg(0.6 mmol)、三乙胺(TEA)140 μL(1.0 mmol)，於室溫下攪拌24小時。向反應後之溶液中添加過量之己烷而產生沈澱，回收由此產生之沈澱(進行2次該操作)。對所獲得之沈澱進行真空乾燥，藉此獲得聚合物E3。(產量：115 mg)將所獲得之聚合物分散於二氯甲烷(6 mL)中，向其中添加含4N HCl之二㗁烷1.0 mL，於冰浴冷卻下攪拌2小時。其後於室溫下進而攪拌一夜。向反應後溶液中添加己烷而產生沈澱，回收所產生之沈澱。向回收之沈澱中添加少量之二氯甲烷，進而添加過量之己烷洗淨沈澱。對回收之沈澱進行真空乾燥。(產量：105 mg) 基於 1H-NMR(DMSO-d6中)(AVANCE-500，Bruker)，對所獲得之聚合物E4推定組成。(圖1-2)
[表1-2]
表1-2聚合物E3合成配方
   試樣 濃度
主原料 N-異丙基丙烯醯胺(NIPAm) 300 mM
陽離子性部位 N-Boc-(3-胺基丙基)甲基丙烯醯胺鹽酸鹽 100 mM
修飾部位 Cys-甲基丙烯醯胺 100 mM
RAFT劑 2-氰基-2-[(十二烷基硫基硫羰基)硫基]丙烷 12.5 mM
起始劑 2,2'-偶氮雙(異丁腈)(AIBN) 6.25 mM
溶劑 DMF 2 mL
1-1-3.聚合物E4之合成
[化4]
將表1-3所示之配方之試劑溶解於DMF(2 mL)，進行脫氣氬氣置換後，於油浴(75℃)中進行24小時聚合反應。將反應後之溶液冷卻，使之與空氣接觸，藉此使反應停止，然後將反應溶液滴至二乙醚中，藉此產生沈澱，並回收該沈澱。將該操作重複進行2次。對回收之沈澱進行真空乾燥，藉此獲得聚合物。(產量：70 mg) 將所獲得之聚合物分散於二氯甲烷(10 mL)中，向其中添加含4N HCl之二㗁烷1.0 mL，於冰浴冷卻下攪拌2小時。其後於室溫下進而攪拌一夜。向反應後溶液中添加己烷而產生沈澱，回收所產生之沈澱。向回收之沈澱中添加少量之二氯甲烷，進而添加過量之己烷洗淨沈澱。對回收之沈澱進行真空乾燥。其後，將該聚合物分散於二氯甲烷(10 mL)中，向其中添加甲基丙烯酸N-丁二醯亞胺酯73 mg(0.4 mmol)、三乙胺(TEA)84 μL(0.6 mmol)，於室溫下攪拌24小時。向反應後之溶液中添加過量之己烷而產生沈澱，回收由此產生之沈澱(進行2次該操作)。對所獲得之沈澱進行真空乾燥，藉此獲得E4。(產量：62 mg) 基於 1H-NMR(DMSO-d6中)(AVANCE-500，Bruker)，對所獲得之E4推定組成。(圖1-3)
[表1-3]
表1-3聚合物E4合成配方
   試樣 濃度
主原料 N-異丙基丙烯醯胺(NIPAm) 200 mM
陽離子性部位 N-(3-二甲胺基丙基)甲基丙烯醯胺鹽酸鹽 100 mM
修飾部位 Cys-甲基丙烯醯胺鹽酸鹽 200 mM
RAFT劑 2-氰基-2-[(十二烷基硫基硫羰基)硫基]丙烷 12.5 mM
起始劑 2,2'-偶氮雙(異丁腈)(AIBN) 6.25 mM
溶劑 DMF 2 mL
1.1.3.聚合物F1之合成 將表1-4所示之配方之試劑溶解於DMF(2 mL)，進行脫氣氬氣置換後，於油浴(75℃)中進行24小時聚合反應。將反應後之溶液冷卻，使之與空氣接觸，藉此使反應停止，然後將反應溶液滴至二乙醚中，藉此產生沈澱，並回收該沈澱。將該操作重複進行2次。對回收之沈澱進行真空乾燥，藉此獲得聚合物。(產量：105.7 mg) 將所獲得之聚合物分散於二氯甲烷(5 mL)中，向其中添加甲基丙烯酸N-丁二醯亞胺酯34.1 mg(0.19 mmol)、三乙胺(TEA)38.9 μL(0.28 mmol)，於室溫下攪拌24小時。向反應後之溶液中添加過量之己烷而產生沈澱，回收由此產生之沈澱(進行2次該操作)。對所獲得之沈澱進行真空乾燥，藉此獲得F1。(產量：19.1 mg)
[表1-4]
表.1-4螢光性聚合物F1合成配方
   試樣 濃度
主原料 N-異丙基丙烯醯胺(NIPAm) 275 mM
陽離子性部位 N-(3-二甲胺基丙基)甲基丙烯醯胺鹽酸鹽 100niM
修飾部位 Cys-甲基丙烯醯胺鹽酸鹽 100 mM
螢光部位 甲基丙烯醯氧基乙基硫基胺甲醯基若丹明B 25 mM
RAFT劑 2-氰基-2-[(十二烷基硫基硫羰基)硫基]丙烷 12.5 mM
起始劑 2,2'-偶氮雙(異丁腈)：V-60 6.25 mM
溶劑 DMF 2 mL
聚合物(AN1)之合成 將Boc-胱胺甲基丙烯醯胺64 mg、丙烯酸第三丁酯29 μL、NIPAm 68 mg溶解於DMF 1.8 mL，最後添加溶解有RAFT劑(2-氰基-2-[(十二烷基硫基硫羰基)硫基]丙烷)8.6 mg、起始劑(AIBN)2.1 mg之DMF 0.2 mL，進行脫氣氬氣置換，去除溶氧。其後，於設定為75℃之油浴中進行聚合反應(24 h)。反應後，將反應液滴至過量之二乙醚中，回收沈澱。(產量：51 mg) 將所獲得之聚合物溶解於二氯甲烷(5 mL)，於冰浴冷卻下進行攪拌。向其中添加三氟乙酸1.5 mL，於遮光下攪拌一夜。反應後添加二乙醚，回收產生之沈澱，利用二乙醚洗淨所獲得之沈澱。(產量：22 mg) 將所獲得之聚合物分散於二氯甲烷，向其中添加甲基丙烯酸N-丁二醯亞胺酯15 mg(0.08 mmol)、三乙胺17 μL(0.12 mmol)，於室溫下攪拌一夜。向反應液中添加二乙醚，回收所產生之沈澱。使該沈澱溶解於少量之二氯甲烷，向其中添加過量之己烷，藉此產生沈澱。將該操作重複進行2次，進行真空乾燥，藉此獲得目標聚合物(AN1)。(產量：16 mg)
(實施例1-2：聚合物於粒子上之結合(非共價鍵)) 1-2-1.E3偶聯氧化矽NP之合成
[化5]
將氧化矽奈米粒子分散液(2.0×10 12個/mL)100 μL、聚合物E3水溶液(2.0 mg/mL)500 μL、4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三𠯤-2-基)-4-甲基嗎啉鹽酸鹽(DMT-MM)水溶液(12.5 mM)400 μL進行混合，利用Thermo振盪器於25℃、1000 rpm之條件下攪拌12小時。反應後利用離心分離(25℃，10,000 g，15 min)×5去除溶液中之反應物。各上清液利用UV-vis測定(Nano Drop)進行確認。
按照同樣之順序，使聚合物E2、聚合物E4與氧化矽粒子一體化。 1-2-2.結果 1-2-2-1.DLS及Z電位測定 將氧化矽奈米粒子分散液(2.0×10 12個/mL)20 μL、各種陽離子性聚合物水溶液(2.0 mg/mL)100 μL、純水80 μL進行混合，利用vortex充分攪拌。用純水將該溶液稀釋至100倍，作為DLS及Z-電位測定樣品。測定機器使用Zetasizer pro(Marvern Panalytical, UK)。
根據由DLS獲得之粒徑測定結果(圖1-4及表1-5)與Z-電位測定結果(圖1-5及表1-5)表明，所製作之陽離子性聚合物與氧化矽奈米粒子呈粒子狀吸附，可從其表面特性帶負電之狀態變為帶正電之狀態。又，於使聚合物吸附於該氧化矽奈米粒子前後未觀察到粒徑有較大變化，因此，表明於聚合物吸附後，氧化矽奈米粒子亦維持單分散性。
[表1-5]
表1-5   各粒子之DLS測定及Z-電位測定
   平均粒徑(nm) 表面電荷(mV)
氧化矽奈米粒子 208 -53.2
氧化矽奈米粒子+E2 216 56.2
氧化矽奈米粒子+E4 237 60.9
氧化矽奈米粒子+E3 220 40.5
1-1.聚合物(E101)之合成 [化6] 聚合物配方： [表A-1]
試樣 Mw. 濃度(mM) 最終液量(mL)
胱胺單體(N-[2-[(2-胺基乙基)二硫基]乙基]-2-甲基-2-丙烯醯胺鹽酸鹽) 256.82 100 1
4-[(2-甲基-1-側氧基-2-丙烯-1-基)胺基]丁酸 171.19 100 1
NIPAm 113.16 300 1
2-氰基-2-[(十二烷基硫基硫羰基)硫基]丙烷 345.63 12.5 1
AIBN 164.21 6.25 1
將上述配方之化合物放入舒倫克(Schlenk)燒瓶(25 mL)中，使該等溶解於DMF(最終液量：1 mL)。最後添加RAFT劑及起始劑，放入攪拌棒後進行脫氣氬氣置換，於油浴(設定溫度：75℃)中進行聚合。(20 h)。聚合後將舒倫克燒瓶冰浴冷卻，藉由送入空氣而使反應停止，將反應溶液添加至大量之二乙醚中，回收所產生之沈澱。向殘渣中添加少量之CH 2Cl 2，進而添加過量之正己烷洗淨沈澱後，進行真空乾燥。
將前項中製作之聚合物、TEA 140 μL(1.0 mmol)溶解於CH 2Cl 2，於冰浴冷卻下進行攪拌。向其中添加甲基丙烯酸N-丁二烯亞胺酯54 mg(0.3 mmol)，並攪拌一夜(14 h)。反應後，向反應溶液中添加正己烷，回收所產生之沈澱。使該沈澱再溶解於少量之CH 2Cl 2，添加過量之正己烷而產生沈澱，回收該沈澱進行真空乾燥，獲得聚合物(E101)。
1-2.聚合物(E101)-粒子核複合體之形成及基板上之固定化 將聚合物(E101)水溶液(2 mg/mL)與表面具有鹼性基之粒子核分散液以1/1(v/v)進行混合。將該溶液利用DMF稀釋至80倍。將該溶液4 μL滴至經2-(2-溴異丁醯氧基)十一烷基硫醇與胺基-EG6十一烷基硫醇鹽酸鹽修飾之金基板上，並靜置1小時。其後，利用EtOH洗淨基板，獲得粒子固定化基板。
2-1.聚合物(E102)之合成 [化7] 聚合物配方： [表A-2]
試樣 Mw. 濃度 (mM) 最終液量(mL)
胱胺單體(N-[2-[(2-胺基乙基)二硫基]乙基]-2-甲基-2-丙烯醯胺鹽酸鹽) 256.82 100 1
N-苯基丙烯醯胺 147.17 100 1
NIPAm 113.16 300 1
2-氰基-2-[(十二烷基硫基硫羰基)硫基]丙烷 345.63 12.5 1
AIBN 164.21 6.25 1
將上述配方之化合物放入舒倫克燒瓶(25 mL)中，使該等溶解於DMF(最終液量：1 mL)。最後添加RAFT劑及起始劑，放入攪拌棒後進行脫氣氬氣置換，於油浴(設定溫度：75℃)中進行聚合。(20 h)。聚合後將舒倫克燒瓶冰浴冷卻，藉由送入空氣而使反應停止，將反應溶液添加至大量之二乙醚中，回收所產生之沈澱。向殘渣中添加少量之CH 2Cl 2，進而添加過量之正己烷洗淨沈澱後，進行真空乾燥。
將前項中製作之聚合物、TEA 140 μL(1.0 mmol)溶解於CH 2Cl 2，於冰浴冷卻下進行攪拌。向其中添加甲基丙烯酸N-丁二烯亞胺酯54 mg(0.3 mmol)，並攪拌一夜(14 h)。反應後，向反應溶液中添加正己烷，回收所產生之沈澱。使該沈澱再溶解於少量之CH 2Cl 2，添加過量之正己烷而產生沈澱，回收該沈澱進行真空乾燥，獲得聚合物(E102)。
2-2.聚合物(E102)-粒子核複合體之形成及基板上之固定化 將聚合物(E102)水溶液(2 mg/mL)與表面具有苯環等疏水性基之粒子核分散液以1/1(v/v)進行混合。將該溶液利用DMF稀釋至80倍。將該溶液4 μL滴至僅經2-(2-溴異丁醯氧基)十一烷基硫醇修飾、或其與十一烷基硫醇之混合SAM(Self-Assembly Monlayer，自組單分子膜)修飾之金基板上，並靜置1小時。其後，利用EtOH洗淨基板，獲得粒子固定化基板。
3-1.聚合物(E103)之合成 [化8] 聚合物配方： [表A-3]
試樣 Mw. 濃度(mM) 最終液量(mL)
胱胺單體(N-[2-[(2-胺基乙基)二硫基]乙基]-2-甲基-2-丙烯醯胺鹽酸鹽) 256.82 100 1
N-己基甲基丙烯醯胺 169.26 100 1
NIPAm 113.16 300 1
2-氰基-2-[(十二烷基硫基硫羰基)硫基]丙烷 345.63 12.5 1
AIBN 164.21 6.25 1
將上述配方之化合物放入舒倫克燒瓶(25 mL)中，使該等溶解於DMF(最終液量：1 mL)。最後添加RAFT劑及起始劑，放入攪拌棒後進行脫氣氬氣置換，於油浴(設定溫度：75℃)中進行聚合。(20 h)。聚合後將舒倫克燒瓶冰浴冷卻，藉由送入空氣而使反應停止，將反應溶液添加至大量之二乙醚中，回收所產生之沈澱。向殘渣中添加少量之CH 2Cl 2，進而添加過量之正己烷洗淨沈澱後，進行真空乾燥。
將前項中製作之聚合物、TEA 140 μL(1.0 mmol)溶解於CH 2Cl 2，於冰浴冷卻下進行攪拌。向其中添加甲基丙烯酸N-丁二烯亞胺酯54 mg(0.3 mmol)，並攪拌一夜(14 h)。反應後，向反應溶液中添加正己烷，回收所產生之沈澱。使該沈澱再溶解於少量之CH 2Cl 2，添加過量之正己烷而產生沈澱，回收該沈澱進行真空乾燥，獲得聚合物(E103)。
3-2.聚合物(E103)-粒子核複合體之形成及基板上之固定化 將聚合物(E103)水溶液(2 mg/mL)與表面具有苯環或烷基鏈等疏水性基之粒子核分散液以1/1(v/v)進行混合。將該溶液利用DMF稀釋至80倍。將該溶液4 μL滴至僅經2-(2-溴異丁醯氧基)十一烷基硫醇修飾、或其與十一烷基硫醇之混合SAM修飾之金基板上，並靜置1小時。其後，利用EtOH洗淨基板，獲得粒子固定化基板。
4-1.聚合物(E104)之合成 [化9] 聚合物配方： [表A-4]
試樣 Mw. 濃度 (mM) 最終液量(mL)
胱胺單體(N-[2-[(2-胺基乙基)二硫基]乙基]-2-甲基-2-丙烯醯胺鹽酸鹽) 256.82 100 1
NTA單體(N2,N2-雙(羧甲基)-N6-(2-甲基-1-側氧基-2-丙烯-1-基)-L-離胺酸) 330.33 100 1
NIPAm 113.16 300 1
2-氰基-2-[(十二烷基硫基硫羰基)硫基]丙烷 345.63 12.5 1
AIBN 164.21 6.25 1
將上述配方之化合物放入舒倫克燒瓶(25 mL)中，使該等溶解於DMF(最終液量：1 mL)。最後添加RAFT劑及起始劑，放入攪拌棒後進行脫氣氬氣置換，於油浴(設定溫度：75℃)中進行聚合。(20 h)。 聚合後將舒倫克燒瓶冰浴冷卻，藉由送入空氣而使反應停止，將反應溶液添加至大量之二乙醚中，回收所產生之沈澱。向殘渣中添加少量之CH 2Cl 2，進而添加過量之正己烷洗淨沈澱後，進行真空乾燥。
將前項中製作之聚合物、TEA 140 μL(1.0 mmol)溶解於CH 2Cl 2，於冰浴冷卻下進行攪拌。向其中添加甲基丙烯酸N-丁二烯亞胺酯54 mg(0.3 mmol)，並攪拌一夜(14 h)。反應後，向反應溶液中添加正己烷，回收所產生之沈澱。使該沈澱再溶解於少量之CH 2Cl 2，添加過量之正己烷而產生沈澱，回收該沈澱進行真空乾燥，獲得聚合物(E104)。
4-2.聚合物(E104)-粒子核複合體之形成及基板上之固定化 將聚合物(E104)水溶液(2 mg/mL)與表面具有His標籤等能夠配位鍵結之基之粒子核分散液以1/1(v/v)進行混合。將該溶液利用DMF稀釋至80倍。將經2-(2-溴異丁醯氧基)十一烷基硫醇與羧基-EG6十一烷基硫醇修飾之金基板浸漬於溶解有0.1 M EDC、0.05 M NHS之CH 2Cl 2中，並靜置1小時。利用CH 2Cl 2洗淨反應後之基板，並用氮氣吹乾。於該基板上滴加聚合物(E104)-粒子核混合溶液4 μL，並靜置1小時。其後，利用EtOH洗淨基板，獲得粒子固定化基板。
5-1.聚合物(E105)之合成 [化10] 將聚合物(E101)100 mg、TEA 140 μL(1.0 mmol)溶解於CH 2Cl 2，於冰浴冷卻下進行攪拌。向其中添加EDC 40 mg(0.2 mmol)、NHS 22 mg(0.2 mmol)，進而攪拌一夜。反應後，向反應溶液中添加正己烷，回收所產生之沈澱。使該沈澱再溶解於少量之CH 2Cl 2，添加過量之正己烷而產生沈澱，回收該沈澱進行真空乾燥，獲得聚合物(E101)-NHS(E112)。 將前項中製作之聚合物10 mg、TEA 28 μL溶解於DMF(1 mL)並進行攪拌。向其中添加合成肽(自N末端起結合有6個組胺酸、結合有3個甘胺酸，且於C末端結合有離胺酸者)3 mg，並進而攪拌一夜。反應後添加少量之CH 2Cl 2，其後加入過量之正己烷而產生沈澱。回收沈澱，向其中添加少量之CH 2Cl 2，進而添加過量之正己烷洗淨沈澱後，進行真空乾燥，獲得聚合物(E105)。
5-2.聚合物(E105)-粒子核複合體之形成及基板上之固定化 將聚合物(E105)水溶液(2 mg/mL)與表面具有NTA基等能夠配位鍵結之基之粒子核分散液以1/1(v/v)進行混合。將該溶液利用DMF稀釋至80倍。將經2-(2-溴異丁醯氧基)十一烷基硫醇與胺基-EG6十一烷基硫醇鹽酸鹽修飾之金基板浸漬於溶解有1 mM之N-[5-(4-異硫氰基苄基)醯胺基-1-羧基戊基]亞胺基二乙酸之DMSO中，並靜置1小時。利用DMSO、EtOH洗淨反應後之基板，並用氮氣吹乾。於該基板上滴加聚合物(E105)-粒子核混合溶液4 μL，並靜置1小時。其後，利用EtOH洗淨基板，獲得粒子固定化基板。
6-1.聚合物(E106)之合成 [化11]
將聚合物(E101)100 mg、TEA 140 μL(1.0 mmol)溶解於CH 2Cl 2，於冰浴冷卻下進行攪拌。向其中添加EDC 40 mg(0.2 mmol)、NHS 22 mg(0.2 mmol)，進而攪拌一夜。反應後，向反應溶液中添加正己烷，回收所產生之沈澱。使該沈澱再溶解於少量之CH 2Cl 2，添加過量之正己烷而產生沈澱，回收該沈澱進行真空乾燥，獲得聚合物(E101)-NHS(E112)。
將前項中製作之聚合物10 mg溶解於50 mM碳酸鹽緩衝液(pH值8.5)(1 mL)，並進行攪拌。向其中添加抗生物素蛋白3 mg，並進而攪拌一夜。將反應液裝入100 kDa對應之透析膜中，於磷酸鹽緩衝液(pH值7.4)中進行透析。透析後，利用超濾進行濃縮，獲得目標聚合物(E106)之溶液。
6-2.聚合物(E106)-粒子核複合體之形成及基板上之固定化 將聚合物(E106)水溶液(2 mg/mL)與表面具有生物素或其衍生物之粒子核分散液以1/1(v/v)進行混合。將該溶液利用磷酸鹽緩衝液適當稀釋。將經2-(2-溴異丁醯氧基)十一烷基硫醇與胺基-EG6十一烷基硫醇鹽酸鹽修飾之金基板浸漬於溶解有0.1 M EDC、0.05 M生物素之DMSO中，並靜置1小時。利用DMSO、EtOH洗淨反應後之基板，並用氮氣吹乾。於該基板上滴加聚合物(E105)-粒子核混合溶液40 μL，並靜置1小時。其後，利用磷酸鹽緩衝液洗淨基板，獲得粒子固定化基板。
7-1.聚合物(E107)之合成 [化12] 聚合物配方： [表A-5]
試樣 Mw. 濃度 (mM) 最終液量(mL)
胱胺單體(N-[2-[(2-胺基乙基)二硫基]乙基]-2-甲基-2-丙烯醯胺鹽酸鹽) 256.82 100 1
生物素單體((3aS,4S,6aR)-六氫-2-側氧基-N-[3-[(1-側氧基-2-丙烯-1-基)胺基]丙基]-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-戊醯胺) 354.47 100 1
NIPAm 113.16 300 1
2-氰基-2-[(十二烷基硫基硫羰基)硫基]丙烷 345.63 12.5 1
AIBN 164.21 6.25 1
將上述配方之化合物放入舒倫克燒瓶(25 mL)中，使該等溶解於DMF(最終液量：1 mL)。最後添加RAFT劑及起始劑，放入攪拌棒後進行脫氣氬氣置換，於油浴(設定溫度：75℃)中進行聚合。(20 h)。 聚合後將舒倫克燒瓶冰浴冷卻，藉由送入空氣而使反應停止，將反應溶液添加至大量之二乙醚中，回收所產生之沈澱。向殘渣中添加少量之CH 2Cl 2，進而添加過量之正己烷洗淨沈澱後，進行真空乾燥。
將前項中製作之聚合物、TEA 140 μL(1.0 mmol)溶解於CH 2Cl 2，於冰浴冷卻下進行攪拌。向其中添加甲基丙烯酸N-丁二烯亞胺酯54 mg(0.3 mmol)，並攪拌一夜(14 h)。反應後，向反應溶液中添加正己烷，回收所產生之沈澱。使該沈澱再溶解於少量之CH 2Cl 2，添加過量之正己烷而產生沈澱，回收該沈澱進行真空乾燥，獲得聚合物(E107)。
7-2.聚合物(E107)-粒子核複合體之形成及基板上之固定化 將聚合物(E107)水溶液(2 mg/mL)與表面經抗生物素蛋白修飾之粒子核分散液以1/1(v/v)進行混合。將該溶液利用PBS(Phosphate Buffered Saline，磷酸鹽緩衝液)適當稀釋。將經2-(2-溴異丁醯氧基)十一烷基硫醇與羧基-EG6十一烷基硫醇修飾之金基板浸漬於溶解有0.1 M EDC、0.05 M NHS之CH 2Cl 2中，並靜置1小時。利用CH 2Cl 2洗淨反應後之基板，並用氮氣吹乾。於該基板上滴加1 mg/mL之抗生物素蛋白溶液，並靜置1小時。反應後利用磷酸鹽緩衝液洗淨基板。於該基板上滴加聚合物(E107)-粒子核混合溶液，並靜置1小時。其後，利用磷酸鹽緩衝液洗淨基板，獲得粒子固定化基板。
8-1.聚合物(E108)之合成 [化13] 將聚合物(E3)100 mg、TEA 140 μL(1.0 mmol)溶解於CH 2Cl 2，於冰浴冷卻下進行攪拌。向其中添加EDC 40 mg(0.2 mmol)、3-巰基丙酸22 mg(0.2 mmol)，進而攪拌一夜。反應後，向反應溶液中添加正己烷，回收所產生之沈澱。使該沈澱再溶解於少量之CH 2Cl 2，添加過量之正己烷而產生沈澱，回收該沈澱進行真空乾燥，獲得聚合物(E108)。
8-2.聚合物(E106)-粒子核複合體之形成及基板上之固定化 將聚合物(E108)水溶液(2 mg/mL)與表面具有馬來醯亞胺基、吡啶二硫基等硫醇反應活性基之粒子核分散液以1/1(v/v)進行混合。將該溶液利用DMF適當稀釋。將經2-(2-溴異丁醯氧基)十一烷基硫醇與胺基-EG6十一烷基硫醇鹽酸鹽修飾之金基板浸漬於溶解有0.1 M EDC、0.05 M之3-馬來醯亞胺丙酸或3-(2-吡啶基二硫代)丙酸之DMF中，並靜置1小時。利用EtOH洗淨反應後之基板，並用氮氣吹乾。於該基板上滴加聚合物(E108)-粒子核混合溶液4 μL，並靜置1小時。其後，利用EtOH洗淨基板，獲得粒子固定化基板。
9-1.聚合物(E109)之合成 [化14] 將聚合物(E3)100 mg、TEA 140 μL(1.0 mmol)溶解於CH 2Cl 2，於冰浴冷卻下進行攪拌。向其中添加EDC 40 mg(0.2 mmol)、3-馬來醯亞胺丙酸34 mg(0.2 mmol)，進而攪拌一夜。反應後，向反應溶液中添加正己烷，回收所產生之沈澱。使該沈澱再溶解於少量之CH 2Cl 2，添加過量之正己烷而產生沈澱，回收該沈澱進行真空乾燥，獲得聚合物(E108)。
9-2.聚合物(E109)-粒子核複合體之形成及基板上之固定化 將聚合物(E109)水溶液(2 mg/mL)與表面具有硫醇基之粒子核分散液以1/1(v/v)進行混合。將該溶液利用DMF適當稀釋。將經2-(2-溴異丁醯氧基)十一烷基硫醇與胺基-EG6十一烷基硫醇鹽酸鹽修飾之金基板浸漬於溶解有0.1 M EDC、0.05 M之3-巰基丙酸之DMF中，並靜置1小時。利用EtOH洗淨反應後之基板，並用氮氣吹乾。於該基板上滴加聚合物(E109)-粒子核混合溶液4 μL，並靜置1小時。其後，利用EtOH洗淨基板，獲得粒子固定化基板。
10-1.聚合物(E110)之合成 [化15] 聚合物配方： [表A-6]
試樣 Mw. 濃度 (mM) 最終液量(mL)
胱胺單體(N-[2-[(2-胺基乙基)二硫基]乙基]-2-甲基-2-丙烯醯胺鹽酸鹽) 256.82 100 1
醛單體(4-甲醯基-N-[2-[(1-側氧基-2-丙烯-1-基)胺基]丙基]苯甲醯胺) 258.26 100 1
NIPAm 113.16 300 1
2-氰基-2-[(十二烷基硫基硫羰基)硫基]丙烷 345.63 12.5 1
AIBN 164.21 6.25 1
將上述配方之化合物放入舒倫克燒瓶(25 mL)中，使該等溶解於DMF(最終液量：1 mL)。最後添加RAFT劑及起始劑，放入攪拌棒後進行脫氣氬氣置換，於油浴(設定溫度：75℃)中進行聚合。(20 h)。 聚合後將舒倫克燒瓶冰浴冷卻，藉由送入空氣而使反應停止，將反應溶液添加至大量之二乙醚中，回收所產生之沈澱。向殘渣中添加少量之CH 2Cl 2，進而添加過量之正己烷洗淨沈澱後，進行真空乾燥。
將前項中製作之聚合物、TEA 140 μL(1.0 mmol)溶解於CH 2Cl 2，於冰浴冷卻下進行攪拌。向其中添加甲基丙烯酸N-丁二烯亞胺酯54 mg(0.3 mmol)，並攪拌一夜(14 h)。反應後，向反應溶液中添加正己烷，回收所產生之沈澱。使該沈澱再溶解於少量之CH 2Cl 2，添加過量之正己烷而產生沈澱，回收該沈澱進行真空乾燥，獲得聚合物(E110)。
10-2.聚合物(E110)-粒子核複合體之形成及基板上之固定化 將聚合物(E110)水溶液(2 mg/mL)與表面經胺基修飾之粒子核分散液以1/1(v/v)進行混合。將該溶液利用DMF適當稀釋。於經2-(2-溴異丁醯氧基)十一烷基硫醇與羧基-EG6十一烷基硫醇修飾之金基板上滴加聚合物(E110)-粒子核混合溶液，並靜置1小時。其後，利用EtOH洗淨基板，獲得粒子固定化基板。
11-1.聚合物(E111)之合成 [化16] 聚合物配方： [表A-7]
試樣 Mw. 濃度 (mM) 最終液量(mL)
胱胺單體(N-[2-[(2-胺基乙基)二硫基]乙基]-2-甲基-2-丙烯醯胺鹽酸鹽) 256.82 100 1
Boc-肟單體(11-甲基-5,10-二側氧基-3-氧雜-2,6,9-三氮雜十二碳-11-烯酸1,1-二甲基乙酯) 301.34 100 1
NIPAm 113.16 300 1
2-氰基-2-[(十二烷基硫基硫羰基)硫基]丙烷 345.63 12.5 1
AIBN 164.21 6.25 1
將上述配方之化合物放入舒倫克燒瓶(25 mL)中，使該等溶解於DMF(最終液量：1 mL)。最後添加RAFT劑及起始劑，放入攪拌棒後進行脫氣氬氣置換，於油浴(設定溫度：75℃)中進行聚合。(20 h)。 聚合後將舒倫克燒瓶冰浴冷卻，藉由送入空氣而使反應停止，將反應溶液添加至大量之二乙醚中，回收所產生之沈澱。向殘渣中添加少量之CH 2Cl 2，進而添加過量之正己烷洗淨沈澱後，進行真空乾燥。
將前項中製作之聚合物、TEA 140 μL(1.0 mmol)溶解於CH 2Cl 2，於冰浴冷卻下進行攪拌。向其中添加甲基丙烯酸N-丁二烯亞胺酯54 mg(0.3 mmol)，並攪拌一夜(14 h)。反應後，向反應溶液中添加正己烷，回收所產生之沈澱。使該沈澱再溶解於少量之CH 2Cl 2，添加過量之正己烷而產生沈澱，回收該沈澱，進行真空乾燥。
將所獲得之聚合物溶解於CH 2Cl 2，於冰浴冷卻下進行攪拌。向其中添加含4 N HCl之二㗁烷1 mL，進而攪拌一夜。向反應液中添加正己烷，回收所產生之沈澱。向該沈澱中加入少量之CH 2Cl 2，進而添加過量之正己烷洗淨沈澱，其後進行真空乾燥，獲得聚合物(E111)。
11-2.聚合物(E111)-粒子核複合體之形成及基板上之固定化 將聚合物(E111)水溶液(2 mg/mL)與表面經醛基修飾之粒子核分散液以1/1(v/v)進行混合。將該溶液利用DMF適當稀釋。將經2-(2-溴異丁醯氧基)十一烷基硫醇與羧基-EG6十一烷基硫醇修飾之金基板浸漬於溶解有0.1 M EDC、0.05 M之4-甲醯基苯甲酸之DMF中，並靜置1小時。利用EtOH洗淨反應後之基板，並用氮氣吹乾。於該基板上滴加聚合物(E111)-粒子核混合溶液4 μL，並靜置1小時。其後，利用EtOH洗淨基板，獲得粒子固定化基板。
12-1.聚合物(E112)之合成 [化17] 將聚合物(E101)100 mg、TEA 140 μL(1.0 mmol)溶解於CH 2Cl 2，於冰浴冷卻下進行攪拌。向其中添加EDC 40 mg(0.2 mmol)、NHS 22 mg(0.2 mmol)，進而攪拌一夜。反應後，向反應溶液中添加正己烷，回收所產生之沈澱。使該沈澱再溶解於少量之CH 2Cl 2，添加過量之正己烷而產生沈澱，回收該沈澱進行真空乾燥，獲得聚合物(E112)。
12-2.聚合物(E112)-粒子核複合體之形成及基板上之固定化 將聚合物(E112)水溶液(2 mg/mL)與表面具有胺基之粒子核分散液以1/1(v/v)進行混合。將該溶液靜置一夜後，利用DMF稀釋至80倍。於經2-(2-溴異丁醯氧基)十一烷基硫醇與10-巰基-N,N,N-三甲基-氯化1-癸銨修飾之金基板上滴加聚合物(E112)-粒子核混合溶液4 μL，並靜置1小時。其後，利用EtOH洗淨基板，獲得粒子固定化基板。
13-1.聚合物(E113)之合成 [化18] 聚合物配方： [表A-8]
試樣 Mw. 濃度(mM) 最終液量(mL)
胱胺單體(N-[2-[(2-胺基乙基)二硫基]乙基]-2-甲基-2-丙烯醯胺鹽酸鹽) 256.82 100 1
GEMA 292.28 100 1
NIPAm 113.16 300 1
2-氰基-2-[(十二烷基硫基硫羰基)硫基]丙烷 345.63 12.5 1
AIBN 164.21 6.25 1
將上述配方之化合物放入舒倫克燒瓶(25 mL)中，使該等溶解於DMF(最終液量：1 mL)。最後添加RAFT劑及起始劑，放入攪拌棒後進行脫氣氬氣置換，於油浴(設定溫度：75℃)中進行聚合。(20 h)。 聚合後將舒倫克燒瓶冰浴冷卻，藉由送入空氣而使反應停止，將反應溶液添加至大量之二乙醚中，回收所產生之沈澱。向殘渣中添加少量之CH 2Cl 2，進而添加過量之正己烷洗淨沈澱後，進行真空乾燥。
將前項中製作之聚合物、TEA 140 μL(1.0 mmol)溶解於CH 2Cl 2，於冰浴冷卻下進行攪拌。向其中添加甲基丙烯酸N-丁二烯亞胺酯27 mg(0.15 mmol)，並攪拌一夜(14 h)。反應後，向反應溶液中添加正己烷，回收所產生之沈澱。使該沈澱再溶解於少量之CH 2Cl 2，添加過量之正己烷而產生沈澱，回收該沈澱進行真空乾燥，獲得聚合物(E113)。
13-2.聚合物(E111)-粒子核複合體之形成及基板上之固定化 將聚合物(E113)水溶液(2 mg/mL)與表面經苯基硼酸基修飾之粒子核分散液以1/1(v/v)進行混合。將該溶液利用DMF適當稀釋。將經2-(2-溴異丁醯氧基)十一烷基硫醇與胺基-EG6十一烷基硫醇鹽酸鹽修飾之金基板浸漬於溶解有0.1 M EDC、0.05 M之4-羧基苯基硼酸(或3-氟-4-羧基苯基硼酸)之DMF中，並靜置1小時。利用EtOH洗淨反應後之基板，並用氮氣吹乾。於該基板上滴加聚合物(E113)-粒子核混合溶液4 μL，並靜置1小時。其後，利用EtOH洗淨基板，獲得粒子固定化基板。
14-1.聚合物(E114)之合成 [化19] 聚合物配方： [表A-9]
試樣 Mw. 濃度 (mM) 最終液量(mL)
胱胺單體(N-[2-[(2-胺基乙基)二硫基]乙基]-2-甲基-2-丙烯醯胺鹽酸鹽) 256.82 100 1
4-(2-甲基丙烯醯胺基乙基胺甲醯基)-3-氟苯基硼酸 292.06 100 1
NIPAm 113.16 300 1
2-氰基-2-[(十二烷基硫基硫羰基)硫基]丙烷 345.63 12.5 1
AIBN 164.21 6.25 1
將上述配方之化合物放入舒倫克燒瓶(25 mL)中，使該等溶解於DMF(最終液量：1 mL)。最後添加RAFT劑及起始劑，放入攪拌棒後進行脫氣氬氣置換，於油浴(設定溫度：75℃)中進行聚合。(20 h)。聚合後將舒倫克燒瓶冰浴冷卻，藉由送入空氣而使反應停止，將反應溶液添加至大量之二乙醚中，回收所產生之沈澱。向殘渣中添加少量之CH 2Cl 2，進而添加過量之正己烷洗淨沈澱後，進行真空乾燥。
將前項中製作之聚合物、TEA 140 μL(1.0 mmol)溶解於CH 2Cl 2，於冰浴冷卻下進行攪拌。向其中添加甲基丙烯酸N-丁二烯亞胺酯27 mg(0.15 mmol)，並攪拌一夜(14 h)。反應後，向反應溶液中添加正己烷，回收所產生之沈澱。使該沈澱再溶解於少量之CH 2Cl 2，添加過量之正己烷而產生沈澱，回收該沈澱進行真空乾燥，獲得聚合物(E114)。
14-2.聚合物(E114)-粒子核複合體之形成及基板上之固定化 將聚合物(E114)水溶液(2 mg/mL)與表面經具有順式二醇結構之基修飾之粒子核分散液以1/1(v/v)進行混合。將該溶液利用DMF適當稀釋。將經2-(2-溴異丁醯氧基)十一烷基硫醇與胺基-EG6十一烷基硫醇鹽酸鹽修飾之金基板浸漬於溶解有TEA、α-D-吡喃甘露糖基苯基異硫氰酸酯之DMF中，並靜置1小時。利用EtOH洗淨反應後之基板，並用氮氣吹乾。於該基板上滴加聚合物(E114)-粒子核混合溶液4 μL，並靜置1小時。其後，利用EtOH洗淨基板，獲得粒子固定化基板。
15-1.聚合物(E115)之合成 [化20] 聚合物配方： [表A-10]
試樣 Mw. 濃度 (mM) 最終液量(mL)
胱胺單體(N-[2-[(2-胺基乙基)二硫基]乙基]-2-甲基-2-丙烯醯胺鹽酸鹽) 256.82 100 1
N-丙烯醯基高半胱胺酸硫內酯 171.22 100 1
NIPAm 113.16 300 1
2-氰基-2-[(十二烷基硫基硫羰基)硫基]丙烷 345.63 12.5 1
AIBN 164.21 6.25 1
將上述配方之化合物放入舒倫克燒瓶(25 mL)中，使該等溶解於DMF(最終液量：1 mL)。最後添加RAFT劑及起始劑，放入攪拌棒後進行脫氣氬氣置換，於油浴(設定溫度：75℃)中進行聚合。(20 h)。 聚合後將舒倫克燒瓶冰浴冷卻，藉由送入空氣而使反應停止，將反應溶液添加至大量之二乙醚中，回收所產生之沈澱。向殘渣中添加少量之CH 2Cl 2，進而添加過量之正己烷洗淨沈澱後，進行真空乾燥。
將前項中製作之聚合物、TEA 140 μL(1.0 mmol)溶解於CH 2Cl 2，於冰浴冷卻下進行攪拌。向其中添加甲基丙烯酸N-丁二烯亞胺酯27 mg(0.15 mmol)，並攪拌一夜(14 h)。反應後，向反應溶液中添加正己烷，回收所產生之沈澱。使該沈澱再溶解於少量之CH 2Cl 2，添加過量之正己烷而產生沈澱，回收該沈澱進行真空乾燥，獲得聚合物(E115)。
15-2.聚合物(E115)-粒子核複合體之形成及基板上之固定化 將聚合物(E114)水溶液(2 mg/mL)與表面經胺基修飾之粒子核分散液以1/1(v/v)進行混合。將該溶液利用DMF適當稀釋。將經2-(2-溴異丁醯氧基)十一烷基硫醇與胺基-EG6十一烷基硫醇鹽酸鹽修飾之金基板浸漬於溶解有EDC、3-(2-吡啶基二硫代)丙酸之DMF中，並靜置1小時。利用EtOH洗淨反應後之基板，並用氮氣吹乾。於該基板上滴加聚合物(E115)-粒子核混合溶液4 μL，並靜置1小時。其後，利用EtOH洗淨基板，獲得粒子固定化基板。
16-1.聚合物(E116)之合成 [化21] 聚合物配方： [表A-11]
試樣 Mw. 濃度(mM) 最終液量(mL)
胱胺單體(N-[2-[(2-胺基乙基)二硫基]乙基]-2-甲基-2-丙烯醯胺鹽酸鹽) 256.82 100 1
甲基丙烯酸3-疊氮基丙酯 169.18 100 1
NIPAm 113.16 300 1
2-氰基-2-[(十二烷基硫基硫羰基)硫基]丙烷 345.63 12.5 1
AIBN 164.21 6.25 1
將上述配方之化合物放入舒倫克燒瓶(25 mL)中，使該等溶解於DMF(最終液量：1 mL)。最後添加RAFT劑及起始劑，放入攪拌棒後進行脫氣氬氣置換，於油浴(設定溫度：75℃)中進行聚合。(20 h)。 聚合後將舒倫克燒瓶冰浴冷卻，藉由送入空氣而使反應停止，將反應溶液添加至大量之二乙醚中，回收所產生之沈澱。向殘渣中添加少量之CH 2Cl 2，進而添加過量之正己烷洗淨沈澱後，進行真空乾燥。 將前項中製作之聚合物、TEA 140 μL(1.0 mmol)溶解於CH 2Cl 2，於冰浴冷卻下進行攪拌。向其中添加甲基丙烯酸N-丁二烯亞胺酯27 mg(0.15 mmol)，並攪拌一夜(14 h)。反應後，向反應溶液中添加正己烷，回收所產生之沈澱。使該沈澱再溶解於少量之CH 2Cl 2，添加過量之正己烷而產生沈澱，回收該沈澱進行真空乾燥，獲得聚合物(E116)。
16-2.聚合物(E116)-粒子核複合體之形成及基板上之固定化 將聚合物(E116)水溶液(2 mg/mL)與表面經炔烴基修飾之粒子核分散液以1/1(v/v)進行混合。向其中添加硫酸銅、抗壞血酸鈉，並攪拌1小時。反應後利用離心分離將溶液置換為純水。將該溶液利用DMF適當稀釋。將經2-(2-溴異丁醯氧基)十一烷基硫醇與胺基-EG6十一烷基硫醇鹽酸鹽修飾之金基板浸漬於溶解有EDC、4-(3-丁炔-1-基二硫基)丁酸之DMF中，並靜置1小時。利用EtOH洗淨反應後之基板，並用氮氣吹乾。於該基板上滴加聚合物(E116)-粒子核混合溶液(含硫酸銅及抗壞血酸)4 μL，並靜置1小時。其後，利用EtOH洗淨基板，獲得粒子固定化基板。
17-1.聚合物(E116)之合成 [化22] 將聚合物(E112)、TEA 140 μL(1.0 mmol)溶解於CH 2Cl 2，於冰浴冷卻下進行攪拌。向其中添加炔丙胺11 mg(0.2 mmol)，並攪拌一夜(14 h)。反應後，向反應溶液中添加正己烷，回收所產生之沈澱。使該沈澱再溶解於少量之CH 2Cl 2，添加過量之正己烷而產生沈澱，回收該沈澱進行真空乾燥，獲得聚合物(E117)。
17-2.聚合物(E117)-粒子核複合體之形成及基板上之固定化 將聚合物(E117)水溶液(2 mg/mL)與表面經疊氮基修飾之粒子核分散液以1/1(v/v)進行混合。向其中添加硫酸銅、抗壞血酸鈉，並攪拌1小時。反應後利用離心分離將溶液置換為純水。將該溶液利用DMF適當稀釋。將經2-(2-溴異丁醯氧基)十一烷基硫醇與胺基-EG6十一烷基硫醇鹽酸鹽修飾之金基板浸漬於溶解有EDC、3-[(2-疊氮基乙基)二硫代]丙酸之DMF中，並靜置1小時。利用EtOH洗淨反應後之基板，並用氮氣吹乾。於該基板上滴加聚合物(E117)-粒子核混合溶液(含硫酸銅及抗壞血酸)4 μL，並靜置1小時。其後，利用EtOH洗淨基板，獲得粒子固定化基板。
18-1.聚合物(E201)之合成 [化23] 聚合物配方： [表A-12]
試樣 Mw. 濃度(mM) 最終液量(mL)
醛單體(4-甲醯基-N-[2-[(1-側氧基-2-丙烯-1-基)胺基]丙基]苯甲醯胺) 258.26 100 1
N-(3-(二甲胺基)丙基)甲基丙烯醯胺 170.25 100 1
NIPAm 113.16 300 1
2-氰基-2-[(十二烷基硫基硫羰基)硫基]丙烷 345.63 12.5 1
AIBN 164.21 6.25 1
將上述配方之化合物放入舒倫克燒瓶(25 mL)中，使該等溶解於DMF(最終液量：1 mL)。最後添加RAFT劑及起始劑，放入攪拌棒後進行脫氣氬氣置換，於油浴(設定溫度：75℃)中進行聚合。(20 h)。 聚合後將舒倫克燒瓶冰浴冷卻，藉由送入空氣而使反應停止，將反應溶液添加至大量之二乙醚中，回收所產生之沈澱。向殘渣中添加少量之CH 2Cl 2，進而添加過量之正己烷洗淨沈澱後，進行真空乾燥。
將前項中製作之聚合物、TEA 140 μL(1.0 mmol)溶解於CH 2Cl 2，於冰浴冷卻下進行攪拌。向其中添加N-(2-胺基乙基)甲基丙烯醯胺25 mg(0.2 mmol)，並攪拌一夜(14 h)。反應後，向反應溶液中添加正己烷，回收所產生之沈澱。使該沈澱再溶解於少量之CH 2Cl 2，添加過量之正己烷而產生沈澱，回收該沈澱進行真空乾燥，獲得聚合物(E201)。
18-2.聚合物(E201)-粒子核複合體之形成及基板上之固定化 將聚合物(E201)水溶液(2 mg/mL)與表面具有酸性基之粒子核分散液以1/1(v/v)進行混合。將該溶液利用DMF稀釋至80倍。將該溶液4 μL滴至經2-(2-溴異丁醯氧基)十一烷基硫醇與羧基-EG6十一烷基硫醇修飾之金基板上，並靜置1小時。其後，利用EtOH洗淨基板，獲得粒子固定化基板。
19-1.聚合物(E202)之合成 [化24] 聚合物配方： [表A-13]
試樣 Mw. 濃度 (mM) 最終液量(mL)
4-[(2-甲基-1-側氧基-2-丙烯-1-基)胺基]丁酸 171.19 100 1
N-(3-(二甲胺基)丙基)甲基丙烯醯胺 170.25 100 1
NIPAm 113.16 300 1
2-氰基-2-[(十二烷基硫基硫羰基)硫基]丙烷 345.63 12.5 1
AIBN 164.21 6.25 1
將上述配方之化合物放入舒倫克燒瓶(25 mL)中，使該等溶解於DMF(最終液量：1 mL)。最後添加RAFT劑及起始劑，放入攪拌棒後進行脫氣氬氣置換，於油浴(設定溫度：75℃)中進行聚合(20 h)。聚合後將舒倫克燒瓶冰浴冷卻，藉由送入空氣而使反應停止，將反應溶液添加至大量之二乙醚中，回收所產生之沈澱。向殘渣中添加少量之CH 2Cl 2，進而添加過量之正己烷洗淨沈澱後，進行真空乾燥。
將前項中製作之聚合物、TEA 140 μL(1.0 mmol)溶解於CH 2Cl 2，於冰浴冷卻下進行攪拌。向其中添加EDC 40 mg(0.2 mmol)、NHS 22 mg(0.2 mmol)，進而攪拌一夜。反應後，向反應溶液中添加正己烷，回收所產生之沈澱。使該沈澱再溶解於少量之CH 2Cl 2，添加過量之正己烷而產生沈澱，回收該沈澱，進行真空乾燥。
將前項中製作之聚合物10 mg、TEA 28 μL溶解於DMF(1 mL)並進行攪拌。向其中添加合成肽(自N末端起結合有6個組胺酸、結合有3個甘胺酸，且於C末端結合有離胺酸者)3 mg，並進而攪拌一夜。反應後添加少量之CH 2Cl 2，其後加入過量之正己烷而產生沈澱。回收沈澱，向其中添加少量之CH 2Cl 2，進而添加過量之正己烷洗淨沈澱後，進行真空乾燥。
將前項中製作之聚合物溶解於MeOH中，向其中添加經Ni錯合物化之N2,N2-雙(羧甲基)-N6-(2-甲基-1-側氧基-2-丙烯-1-基)-L-離胺酸並進行攪拌。添加CH 2Cl 2而析出沈澱，回收所析出之沈澱，進行真空乾燥，獲得聚合物(E202)。
19-2.聚合物(E202)-粒子核複合體之形成及基板上之固定化 將聚合物(E202)水溶液(2 mg/mL)與表面具有酸性基之粒子核分散液以1/1(v/v)進行混合。將該溶液利用DMF稀釋至80倍。將該溶液4 μL滴至經2-(2-溴異丁醯氧基)十一烷基硫醇與羧基-EG6十一烷基硫醇修飾之金基板上，並靜置1小時。其後，利用EtOH洗淨基板，獲得粒子固定化基板。
20-1.聚合物(E203)之合成 [化25] 聚合物配方： [表A-14]
試樣 Mw. 濃度 (mM) 最終液量(mL)
N-(3-胺基丙基)甲基丙烯醯胺鹽酸鹽 178.66 100 1
N-(3-(二甲胺基)丙基)甲基丙烯醯胺 170.25 100 1
NIPAm 113.16 300 1
2-氰基-2-[(十二烷基硫基硫羰基)硫基]丙烷 345.63 12.5 1
AIBN 164.21 6.25 1
將上述配方之化合物放入舒倫克燒瓶(25 mL)中，使該等溶解於DMF(最終液量：1 mL)。最後添加RAFT劑及起始劑，放入攪拌棒後進行脫氣氬氣置換，於油浴(設定溫度：75℃)中進行聚合。(20 h)。 聚合後將舒倫克燒瓶冰浴冷卻，藉由送入空氣而使反應停止，將反應溶液添加至大量之二乙醚中，回收所產生之沈澱。向殘渣中添加少量之CH 2Cl 2，進而添加過量之正己烷洗淨沈澱後，進行真空乾燥。
將前項中製作之聚合物、TEA 140 μL(1.0 mmol)溶解於CH 2Cl 2，於冰浴冷卻下進行攪拌。向其中添加4-甲基丙烯醯氧基苯甲酸40 mg(0.2 mmol)，並攪拌一夜(14 h)。反應後，向反應溶液中添加正己烷，回收所產生之沈澱。使該沈澱再溶解於少量之CH 2Cl 2，添加過量之正己烷而產生沈澱，回收該沈澱進行真空乾燥，獲得聚合物(E203)。
20-2.聚合物(E203)-粒子核複合體之形成及基板上之固定化 將聚合物(E203)水溶液(2 mg/mL)與表面具有酸性基之粒子核分散液以1/1(v/v)進行混合。將該溶液利用DMF稀釋至80倍。將該溶液4 μL滴至經2-(2-溴異丁醯氧基)十一烷基硫醇與羧基-EG6十一烷基硫醇修飾之金基板上，並靜置1小時。其後，利用EtOH洗淨基板，獲得粒子固定化基板。
21-1.聚合物(E204)之合成 [化26] 聚合物配方： [表A-15]
試樣 Mw. 濃度 (mM) 最終液量(mL)
GEMA 292.28 100 1
N-(3-(二甲胺基)丙基)甲基丙烯醯胺 170.25 100 1
NIPAm 113.16 300 1
2-氰基-2-[(十二烷基硫基硫羰基)硫基]丙烷 345.63 12.5 1
AIBN 164.21 6.25 1
將上述配方之化合物放入舒倫克燒瓶(25 mL)中，使該等溶解於DMF(最終液量：1 mL)。最後添加RAFT劑及起始劑，放入攪拌棒後進行脫氣氬氣置換，於油浴(設定溫度：75℃)中進行聚合。(20 h)。 聚合後將舒倫克燒瓶冰浴冷卻，藉由送入空氣而使反應停止，將反應溶液添加至大量之二乙醚中，回收所產生之沈澱。向殘渣中添加少量之CH 2Cl 2，進而添加過量之正己烷洗淨沈澱後，進行真空乾燥。 將前項中製作之聚合物、TEA 140 μL(1.0 mmol)溶解於CH 2Cl 2，於冰浴冷卻下進行攪拌。向其中添加4-(2-甲基丙烯醯胺基乙基胺甲醯基)-3-氟苯基硼酸59 mg(0.2 mmol)，並攪拌一夜(14 h)。反應後，向反應溶液中添加正己烷，回收所產生之沈澱。使該沈澱再溶解於少量之CH 2Cl 2，添加過量之正己烷而產生沈澱，回收該沈澱進行真空乾燥，獲得聚合物(E204)。
21-2.聚合物(E204)-粒子核複合體之形成及基板上之固定化 將聚合物(E204)水溶液(2 mg/mL)與表面具有酸性基之粒子核分散液以1/1(v/v)進行混合。將該溶液利用DMF稀釋至80倍。將該溶液4 μL滴至經2-(2-溴異丁醯氧基)十一烷基硫醇與羧基-EG6十一烷基硫醇修飾之金基板上，並靜置1小時。其後，利用EtOH洗淨基板，獲得粒子固定化基板。
22-1.聚合物(E205)之合成 [化27] 聚合物配方： [表A-16]
試樣 Mw. 濃度 (mM) 最終液量(mL)
4-[(2-甲基-1-側氧基-2-丙烯-1-基)胺基]丁酸 171.19 100 1
N-(3-(二甲胺基)丙基)甲基丙烯醯胺 170.25 100 1
NIPAm 113.16 300 1
2-氰基-2-[(十二烷基硫基硫羰基)硫基]丙烷 345.63 12.5 1
AIBN 164.21 6.25 1
將上述配方之化合物放入舒倫克燒瓶(25 mL)中，使該等溶解於DMF(最終液量：1 mL)。最後添加RAFT劑及起始劑，放入攪拌棒後進行脫氣氬氣置換，於油浴(設定溫度：75℃)中進行聚合。(20 h)。 聚合後將舒倫克燒瓶冰浴冷卻，藉由送入空氣而使反應停止，將反應溶液添加至大量之二乙醚中，回收所產生之沈澱。向殘渣中添加少量之CH 2Cl 2，進而添加過量之正己烷洗淨沈澱後，進行真空乾燥。
將前項中製作之聚合物、TEA 140 μL(1.0 mmol)溶解於CH 2Cl 2，於冰浴冷卻下進行攪拌。向其中添加EDC 40 mg(0.2 mmol)、NHS 22 mg(0.2 mmol)，進而攪拌一夜。反應後，向反應溶液中添加正己烷，回收所產生之沈澱。使該沈澱再溶解於少量之CH 2Cl 2，添加過量之正己烷而產生沈澱，回收該沈澱，進行真空乾燥。
將前項中製作之聚合物10 mg溶解於50 mM碳酸鹽緩衝液(pH值8.5)(1 mL)，並進行攪拌。向其中添加抗生物素蛋白3 mg，並進而攪拌一夜。將反應液裝入100 kDa對應之透析膜中，於磷酸鹽緩衝液(pH值7.4)中進行透析。透析後，利用超濾進行濃縮。其後，與生物素單體((3aS,4S,6aR)-六氫-2-側氧基-N-[3-[(1-側氧基-2-丙烯-1-基)胺基]丙基]-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-戊醯胺)鍵結，藉此獲得目標聚合物(E205)。
22-2.聚合物(E205)-粒子核複合體之形成及基板上之固定化 將聚合物(E205)水溶液(2 mg/mL)與表面具有酸性基之粒子核分散液以1/1(v/v)進行混合。將該溶液利用DMF稀釋至80倍。將該溶液4 μL滴至經2-(2-溴異丁醯氧基)十一烷基硫醇與羧基-EG6十一烷基硫醇修飾之金基板上，並靜置1小時。其後，利用EtOH洗淨基板，獲得粒子固定化基板。
23-1.聚合物(E206)之合成 [化28] 聚合物配方： [表A-17]
試樣 Mw. 濃度 (mM) 最終液量(mL)
N-(3-胺基丙基)甲基丙烯醯胺鹽酸鹽 178.66 100 1
N-(3-(二甲胺基)丙基)甲基丙烯醯胺 170.25 100 1
NIPAm 113.16 300 1
2-氰基-2-[(十二烷基硫基硫羰基)硫基]丙烷 345.63 12.5 1
AIBN 164.21 6.25 1
將上述配方之化合物放入舒倫克燒瓶(25 mL)中，使該等溶解於DMF(最終液量：1 mL)。最後添加RAFT劑及起始劑，放入攪拌棒後進行脫氣氬氣置換，於油浴(設定溫度：75℃)中進行聚合。(20 h)。 聚合後將舒倫克燒瓶冰浴冷卻，藉由送入空氣而使反應停止，將反應溶液添加至大量之二乙醚中，回收所產生之沈澱。向殘渣中添加少量之CH 2Cl 2，進而添加過量之正己烷洗淨沈澱後，進行真空乾燥。 將前項中製作之聚合物、TEA 140 μL(1.0 mmol)溶解於CH 2Cl 2，於冰浴冷卻下進行攪拌。向其中添加EDC 38 mg(0.2 mmol)、4-[4-[1-(甲基丙烯醯氧基)乙基]-2-甲氧基-5-硝基苯氧基]丁酸73 mg(0.2 mmol)，於遮光下攪拌一夜。反應後，向反應溶液中添加正己烷，回收所產生之沈澱。使該沈澱再溶解於少量之CH 2Cl 2，添加過量之正己烷而產生沈澱，回收該沈澱進行真空乾燥，獲得聚合物(E206)。
23-2.聚合物(E206)-粒子核複合體之形成及基板上之固定化 將聚合物(E206)水溶液(2 mg/mL)與表面具有酸性基之粒子核分散液以1/1(v/v)進行混合。將該溶液利用DMF稀釋至80倍。將該溶液4 μL滴至經2-(2-溴異丁醯氧基)十一烷基硫醇與羧基-EG6十一烷基硫醇修飾之金基板上，於遮光下靜置1小時。其後，利用EtOH洗淨基板，獲得粒子固定化基板。
24-1.聚合物(E207)之合成 [化29] 聚合物配方： [表A-18]
試樣 Mw. 濃度 (mM) 最終液量(mL)
N-(3-胺基丙基)甲基丙烯醯胺鹽酸鹽 178.66 100 1
N-(3-(二甲胺基)丙基)甲基丙烯醯胺 170.25 100 1
NIPAm 113.16 300 1
2-氰基-2-[(十二烷基硫基硫羰基)硫基]丙烷 345.63 12.5 1
AIBN 164.21 6.25 1
將上述配方之化合物放入舒倫克燒瓶(25 mL)中，使該等溶解於DMF(最終液量：1 mL)。最後添加RAFT劑及起始劑，放入攪拌棒後進行脫氣氬氣置換，於油浴(設定溫度：75℃)中進行聚合。(20 h)。 聚合後將舒倫克燒瓶冰浴冷卻，藉由送入空氣而使反應停止，將反應溶液添加至大量之二乙醚中，回收所產生之沈澱。向殘渣中添加少量之CH 2Cl 2，進而添加過量之正己烷洗淨沈澱後，進行真空乾燥。 將前項中製作之聚合物、TEA 140 μL(1.0 mmol)溶解於CH 2Cl 2，於冰浴冷卻下進行攪拌。向其中添加EDC 38 mg(0.2 mmol)、化合物A(參照下圖)92 mg(0.2 mmol)，於遮光下攪拌一夜。反應後，向反應溶液中添加正己烷，回收所產生之沈澱。使該沈澱再溶解於少量之CH 2Cl 2，添加過量之正己烷而產生沈澱，回收該沈澱進行真空乾燥，獲得聚合物(E207)。 [化30]
24-2.聚合物(E207)-粒子核複合體之形成及基板上之固定化 將聚合物(E207)水溶液(2 mg/mL)與表面具有酸性基之粒子核分散液以1/1(v/v)進行混合。將該溶液利用DMF稀釋至80倍。將該溶液4 μL滴至經2-(2-溴異丁醯氧基)十一烷基硫醇與羧基-EG6十一烷基硫醇修飾之金基板上，於遮光下靜置1小時。其後，利用EtOH洗淨基板，獲得粒子固定化基板。
25-1.聚合物(E301-E312)之合成 [化31] 聚合物配方： [表A-19]
試樣 Mw. 濃度 (mM) 最終液量(mL)
N-(3-胺基丙基)甲基丙烯醯胺鹽酸鹽 178.66 100 1
N-(t-BOC-胺基丙基)甲基丙烯醯胺 242.31 100 1
NIPAm 113.16 300 1
2-氰基-2-[(十二烷基硫基硫羰基)硫基]丙烷 345.63 12.5 1
AIBN 164.21 6.25 1
將上述配方之化合物放入舒倫克燒瓶(25 mL)中，使該等溶解於DMF(最終液量：1 mL)。最後添加RAFT劑及起始劑，放入攪拌棒後進行脫氣氬氣置換，於油浴(設定溫度：75℃)中進行聚合。(20 h)。聚合後將舒倫克燒瓶冰浴冷卻，藉由送入空氣而使反應停止，將反應溶液添加至大量之二乙醚中，回收所產生之沈澱。向殘渣中添加少量之CH 2Cl 2，進而添加過量之正己烷洗淨沈澱後，進行真空乾燥。
將所製作之聚合物、TEA 140 μL(1.0 mmol)溶解於CH 2Cl 2，於冰浴冷卻下進行攪拌。向其中添加甲基丙烯酸N-丁二烯亞胺酯36 mg(0.2 mmol)，並攪拌一夜。反應後，向反應溶液中添加正己烷，回收所產生之沈澱。使該沈澱再溶解於少量之CH 2Cl 2，添加過量之正己烷而產生沈澱，回收該沈澱，進行真空乾燥。
使聚合物溶解於CH 2Cl 2，於冰浴冷卻下進行攪拌。向其中添加含4 N HCl之二㗁烷1 mL，進而攪拌一夜。向反應液中添加正己烷，回收所產生之沈澱。向該沈澱中加入少量之CH 2Cl 2，進而添加過量之正己烷洗淨沈澱，其後進行真空乾燥。
將聚合物、TEA 140 μL(1.0 mmol)溶解於CH 2Cl 2，於冰浴冷卻下進行攪拌。向其中添加右表之任一化合物0.25 mmol、＊EDC 20 mg(0.1 mmol)，並攪拌一夜。反應後，向反應溶液中添加正己烷，回收所產生之沈澱。使該沈澱再溶解於少量之CH 2Cl 2，添加過量之正己烷而產生沈澱，回收該沈澱進行真空乾燥，獲得目標聚合物(E301-E312)。 ＊E304-E309、E311-E312合成時使用 [表A-20]
   導入之官能基 化合物例
E301 羧基
E302 羧酸 活性酯基
E303 金屬錯合物(NTA基)
E304 硫醇基
E305 吡啶二硫基
E306 馬來醯亞胺基
E307 鹵化乙醯胺基
E308 疊氮基
E309 炔烴基
E310 順式二醇基(糖基)
E311 二羥基硼基
E312 硫內酯基
(實施例1-3：聚合物於粒子上之結合) 聚合物(E2-0)-氧化矽奈米粒子複合體(RM)之合成 [化32] 向純水(500 μL)中以氧化矽奈米粒子(200 nm，末端COOH)4.0×10 11粒子/mL、E2-0 2.0 mg/mL、DMT-MM 10 mM之方式進行混合，利用Thermo振盪器於25℃、1,000 rpm、15小時之條件下進行振盪。反應後加入純水500 μL，利用離心分離(25℃、1,000 rpm、15 min)使粒子沈澱，去除上清液900 μL。將該操作共進行5次，對粒子進行純化。對所獲得之粒子粒徑、表面電荷進行DLS測定，將結果示於圖1-6。 平均粒徑(Z-平均值)為232 nm(pdi：0.022)、表面電荷(Z-電位)為+55.3 mV，故維持了粒子之單分散性，並且表面電荷大幅向正變化，因此，確認到聚合物經過修飾。
25-2.聚合物(E301)-粒子核複合體之形成及基板上之固定化 將聚合物(E301)水溶液(2 mg/mL)與表面具有酸性基之粒子核分散液以1/1(v/v)進行混合。將該溶液利用DMF稀釋至80倍。將該溶液4 μL滴至經2-(2-溴異丁醯氧基)十一烷基硫醇與羧基-EG6十一烷基硫醇修飾之金基板上，並靜置1小時。其後，利用EtOH洗淨基板，獲得粒子固定化基板。
(實施例2：測定基材之製作)
[化33]
2-1.實驗 2-1-1.金基材之表面修飾 利用EtOH沖洗金基材(9.8 mm×4.3 mm)後，實施UV-O3處理15 min，對基材表面進行淨化。於EtOH溶劑中以1：1混合2-(2-溴異丁醯氧基)十一烷基硫醇與羧基-EG6十一烷基硫醇，製備1 mM之EtOH溶液，將上述金基材浸漬於該溶液中。於30℃下靜置20小時後利用EtOH、純水洗淨基材，從而於金基材表面形成自組單分子膜(Self-Assembled Monolayer：SAM)。 2-1-2.粒子固定化基材之製作 將氧化矽奈米粒子分散液(粒徑200 nm、粒子濃度：2.0×10 11個/mL)與聚合物E2(1.0 mg/mL)以上述之終濃度於水中進行混合而形成複合體。
利用DMF稀釋上述複合體溶液，以相對於待複合體固定化之基材面積成為表2-1所示之個數之方式進行滴加(4 μL)，於25℃下靜置1小時。依序利用DMF、EtOH、純水洗淨基材，獲得粒子固定化基材。
基材之評價係利用螢光顯微鏡(KEYENCE，BZ-800)實施，使用軟體(雜交細胞計數)進行解析。將各測定條件示於表2-1。
[表2-1]
表2-1實驗條件表
No. 個數 [個/4 μL] 螢光顯微鏡測定條件(曝光時間)
4倍物鏡 22.2倍物鏡 60倍物鏡
1 1×10 7 1.5 sec 0.25 sec 0.02 sec
2 3×10 6 ↑ ↑ ↑
3 1×10 6 ↑ ↑ ↑
4 3×10 5 2 sec ↑ ↑
5 1×10 5 ↑ 0.5 sec ↑
2-1-3.氧化矽奈米粒子壓印聚合物於粒子固定化基材上之合成 以表2-2所示之組成製作預聚物溶液，以冷凍脫氣之方式去除溶氧後，於手套式操作箱內在25℃下進行18小時聚合。將聚合後之基材用純水洗淨。
將上述基材浸漬於100 mM三(2-羧基乙基)膦鹽酸鹽溶液(甲醇：純水＝1：1)，進行5 min超音波處理，藉此去除氧化矽奈米粒子，從而於聚合物薄膜表層形成空孔。
[表2-2]
表2-2預聚物溶液組成
   試樣 濃度
主原料 MPC(2-甲基丙烯醯氧基乙基磷酸膽鹼) 500 mM
起始劑 EBIB(α-溴異丁酸乙酯) 1.25 mM
配體 TPMA(三(2-吡啶基甲基)胺) 0.125 mM
觸媒 CuBr 2 0.0125 mM
還原劑 抗壞血酸 1.25 mM
溶劑 EtOH 270 μL
2-2.結果 2-2-1.粒子固定化基材之製作 將利用螢光顯微鏡獲得之觀察結果示於圖2。於任一條件下，均於基材上成功確認到來自氧化矽奈米粒子之螢光，因此成功確認到於基材上固定化有氧化矽奈米粒子(聚合物複合體)。
又，使用利用60倍物鏡之螢光觀察及雜交細胞計數進行解析，將結果示於圖3。根據圖3得知，有隨著滴加個數之增多，基材上之氧化矽奈米粒子個數增加之傾向。又，於根據圖像可明確判斷為單分散之圖2之No.4、No.5中，幾乎不存在亮點之面積超過2 μm 2者，故具有超過2 μm 2之亮點面積者可判斷為凝集體。藉由以該數值作為邊界值，當為產生超過邊界值2 μm 2之亮點之No.4(3×10 6個/4 μL)以上時，產生了凝集，當為No.5(1×10 6個/4 μL)以下時，未產生凝集，故能夠以數值之形式客觀地表現，又，能夠基於滴至基材之個數來控制基材上之粒子樣態。 (實施例3)利用陰離子性聚合物與陽離子性氧化矽奈米粒子之粒子固定化基材之製作 使導入有胺之陽離子性氧化矽奈米粒子分散液(粒徑200 nm、粒子濃度：2.0×10 11個/mL)與代替E2合成時之陽離子性單體N-(3-二甲胺基丙基)甲基丙烯醯胺之作為陰離子性單體之2-丙烯醯胺-2-甲基丙磺酸、3-丙烯醯胺苯基硼酸、磷酸單丙烯醯基乙酯、2-(三氟甲基)丙烯酸、丙烯酸、甲基丙烯酸等中之任一者進行共聚，將經共聚獲得之陰離子性聚合物(1.0 mg/mL)以上述之終濃度於水中進行混合，而形成複合體。
利用DMF稀釋上述複合體溶液，以相對於待複合體固定化之基材面積成為表2-2所示之個數之方式進行滴加(4 μL)，並於25℃下靜置1小時。依序利用DMF、EtOH、純水洗淨基材，獲得粒子固定化基材。
利用先前之方法對使用該粒子固定化基材所製作之感測器進行評價，藉此證實，基於利用陰離子性聚合物與陽離子性氧化矽奈米粒子獲得之粒子固定化基材亦能製作感測器。 (實施例4：仿B型肝炎粒子之感測) 4.1.使胱胺與聚合官能基利用靜電相互作用吸附而成之氧化矽粒子之製作
[化34]
將若丹明標記氧化矽奈米粒子(無官能基，200 nm)5 mg/mL、胱胺鹽酸鹽500 μM、2-[2-N-(甲基丙烯醯基)胺基乙基二硫基]乙胺(聚合性官能基)500 μM添加至純水500 μL中。其後，進行振盪(25℃，1400 rpm，1 h)，藉此製作使胱胺、聚合官能基以非共價鍵吸附而成之氧化矽粒子。其後，進行1次離心分離(4000 G，10 min)，取上清液400 μL並加入乙醇400 μL，藉此將分散介質置換為乙醇。 4-1-2.感測晶片之製作 ・SAM之製作 利用EtOH洗淨金濺鍍玻璃基材(9.8 mm×4.3 mm)後，進行UV臭氧處理(20 min)，使金基材表面之有機物分解。其後，將基材浸漬於1 mM之11-巰基十一烷酸EtOH溶液後靜置(30℃，18 h)，製作SAM。利用EtOH、純水洗淨基材，用氮氣(N 2)槍乾燥後，浸漬於1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳二醯亞胺鹽酸鹽(EDC)0.2 M、N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)0.05 M之水溶液後靜置(4℃，30 min)，用冷水(4℃)洗淨。用氮氣槍乾燥後，浸漬於溶解有N-(2-胺基乙基)-2-溴-2-甲基-丙醯胺鹽酸鹽5 mM、β-丙胺酸5 mM之NaHCO 3100 mM溶液(pH8.0)後靜置(r.t.，2 h)，對SAM導入溴基、羧基。 4-1-3.氧化矽粒子之固定化 用純水洗淨基材，並用氮氣槍乾燥後，放入PCR管中，加入50 μg/mL胱胺吸附氧化矽、含20 mM之4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三𠯤-2-基)-4-4-甲基嗎啉鹽酸鹽(DMT-MM)之EtOH溶液270 μL後進行振盪(25℃，300 rpm，18 h)，藉此使氧化矽粒子固定化。 4-1-4.MPC薄膜之製作
[化35]
依據表3-1之配方，藉由表面起始原子轉移自由基聚合(SI-ATRP)，於基板上合成聚合物薄膜。於手套式操作箱內準備各試劑與經脫氣之EtOH、純水，使L-抗壞血酸以外之物質溶解於EtOH，使L-抗壞血酸溶解於純水，從而製備聚合溶液。將基材以2片玻璃面相對向之方式放入2 mL管中。聚合係於Ar氛圍下一面以25℃、18小時、500 rpm之條件進行振盪一面進行。
[表3-1]
表3-1 SI-ATRP合成配方
試劑 濃度
2-甲基丙烯醯氧基乙基磷酸膽鹼(MPC) 500 mM
三(2-吡啶基甲基)胺(TPMA) 0.25 mM
CuBr 2 0.025 mM
L-抗壞血酸 2.5 mM
EtOH 675 μL
純水 75 μL
4-1-5.氧化矽粒子之分離
[化36]
聚合後用純水洗淨基材，並用氮氣槍乾燥，與純水1 mL一併放入2 mL管中。藉由以5 min×3次之條件進行超音波洗淨(High，Level 4.5)，而將氧化矽粒子自聚合物薄膜分離。將分離後之基材浸漬於10 mM之三(2-羧基乙基)膦鹽酸鹽(TCEP)水溶液中進行還原(25℃，1 h，1000 rpm)。將含100 μm之Alexa Fluor(註冊商標)647 C 2馬來醯亞胺與100 μm之N-[5-(3'-馬來醯亞胺丙基醯胺)-1-羧基戊基]亞胺基二乙酸二鈉鹽(馬來醯亞胺-C3-NTA)20.5% DMSO磷酸鹽緩衝液(PBS，10 mM磷酸鹽，140 mM之NaCl，pH值7.4)溶液33 μL滴至基材上，然後靜置(r.t.，1 h)。
[化37]
用純水洗淨，並用氮氣槍乾燥後，將4 mM之NiCl 2水溶液35 μL滴至基材上，然後靜置(室溫，15 min)。用純水洗淨，並用氮氣槍乾燥後，滴加100 μM之帶His標籤之蛋白G PBS溶液後靜置(r.t.，30 min)，藉此使帶His標籤之蛋白G固定化。用純水洗淨，並用氮氣槍乾燥後，滴加10 μg/mL之抗HBs Pre-S1抗體之PBS溶液，然後靜置(r.t.，30 min)，藉此將抗體導入至基材。抗HBs Pre-S1係識別B型肝炎病毒表面抗原之Pre-S1區之單株抗體。Pre-S1區於B型肝炎病毒識別肝細胞時發揮重要作用。 4-1-6.作為B型肝炎病毒(HBV)模型之生物奈米膠囊之感測
[化38]
將仿HBV粒子PBS溶液之濃度設為0.01、0.05、0.1、0.5、1、10、100 ng/mL。關於螢光顯微鏡之測定條件，濾光器之激發波長604-644 nm，螢光波長672-712 nm，物鏡為5倍，曝光時間為0.1 sec，光量為25%，光源為水銀燈。測定時使用導入/未導入抗體之基材。又，亦使用預先使抗體導入基材與抗體反應，利用游離抗體預先對膜上之抗原蛋白進行了中和之仿HBV粒子進行測定。經游離抗體中和之仿HBV粒子係將2 μg/mL之仿HBV粒子PBS(10 mM磷酸鹽，140 mM之NaCl，pH值7.4)溶液100 μL與100 μg/mL之抗HBs Pre-S1 PBS(10 mM磷酸鹽，140 mM之NaCl，pH值7.4)溶液於4℃下保溫1 h而製作。將結果彙總於圖4。 4-2.結果 4-2-1.提示出藉由改變胞外體感測空孔之抗體而能夠測定B型肝炎病毒。 (實施例5：仿SARS-CoV-2(COVID-19致病病毒)粒子之感測) 表現S蛋白之胞外體之尺寸與SARS-CoV-2相同，且不具有病毒活性，故用作仿SARS-CoV-2病毒之粒子，藉由附帶SIC自動分注裝置之螢光顯微鏡進行感測。 5-1-1.感測晶片之製作 ・SAM之製作 利用EtOH洗淨金濺鍍玻璃基材(9.8 mm×4.3 mm)後，進行UV臭氧處理(20 min)，使金基材表面之有機物分解。其後，將基材浸漬於0.5 mM之11-巰基十一烷酸、0.5 mM之2-(2-溴異丁醯氧基)十一烷基硫醇EtOH溶液中，然後靜置(30℃，18 h)，製作自組單分子膜(SAM)。利用EtOH、純水洗淨基材，並用氮氣槍乾燥後保存。 5-1-2.氧化矽粒子之固定化 待固定化之氧化矽奈米粒子使用與仿B型肝炎粒子之感測基材相同者。用純水洗淨基材，並用氮氣槍乾燥後，放入PCR管中，添加50 μg/mL之胱胺吸附氧化矽、含20 mM之DMT-MM之EtOH溶液270 μL後進行振盪(25℃，300 rpm，18 h)，藉此使氧化矽粒子固定化。 5-1-3.MPC薄膜之製作 根據以下之配方，藉由表面起始原子轉移自由基聚合(SI-ATRP)，於基板上合成聚合物薄膜。於手套式操作箱內準備各試劑與經脫氣之EtOH、純水，使L-抗壞血酸以外之物質溶解於EtOH，使L-抗壞血酸溶解於純水，從而製備聚合溶液。將基材以2片玻璃面相對向之方式放入2 mL管中。聚合係於Ar氛圍下一面以25℃、18小時、500 rpm之條件進行振盪一面進行。
[表4]
SI-ATRP合成配方
試劑 濃度
MPC 500 mM
TPMA 0.25 mM
CuBr 2 0.025 mM
L-抗壞血酸 2.5 mM
EtOH 675 μL
純水 75 μL
5-1-4.氧化矽粒子之分離 聚合後用純水洗淨基材，並用氮氣槍乾燥，與純水1 mL一併放入2 mL管中。藉由以5 min×3次之條件進行超音波洗淨(High，Level 4.5)，而將氧化矽粒子自聚合物薄膜分離。 5-1-5.螢光分子及抗體之導入 將分離後之基材浸漬於10 mM之TCEP水溶液中進行還原(25℃，1 h，1000 rpm)。將含100 μm之Alexa Fluor(註冊商標)647 C 2馬來醯亞胺與100 μm馬來醯亞胺-C3-NTA 20.5% DMSO之PBS(10 mM磷酸，140 mM之NaCl，pH值7.4)溶液33 μL滴至基材上，然後靜置(r.t.，1 h)。用純水洗淨，並用氮氣槍乾燥後，將4 mM之NiCl 2水溶液35 μL滴至基材上，然後靜置(r.t，15 min)。將全長抗體導入基材用純水洗淨，並用氮氣槍乾燥後，滴加10 μm之帶His標籤之蛋白G PBS(10 mM磷酸，140 mM之NaCl，pH值7.4)溶液後靜置(r.t.，30 min)，藉此使帶His標籤之蛋白G固定化。用純水洗淨，並用氮氣槍乾燥後，滴加0.3 μm之抗SARS-CoV-2刺突蛋白單株抗體(Hakarel lot A-2-5A12)PBS(10 mM磷酸，140 mM之NaCl，pH值7.4)溶液後靜置(r.t.，1 h)，藉此將全長抗體導入至基材。又，對於自製之奈米抗體導入基材，在形成Ni錯合物後滴加0.3 μm之Covid VHH(H1-H4-Cmyc-His)PBS溶液後靜置(r.t.，30 min)，藉此將奈米抗體導入至基材。 5-1-6.吸附實驗 使用附帶SIC自動分注裝置之螢光顯微鏡，進行表現S蛋白之胞外體捕捉實驗。將用於實驗之表現S蛋白之胞外體PBS(10 mM磷酸，140 mM之NaCl，pH值7.4)溶液之濃度設為0、0.01、0.05、0.1、0.5、1、10、100 ng/mL。關於螢光顯微鏡之測定條件，濾光器為Cy5(激發波長604-644 nm，螢光波長672-712 nm)，物鏡為5倍，曝光時間為0.2 sec，光量為12%，光源為水銀燈。於基材中心部之範圍內進行測定。關於自動分注裝置之順序，1.晶片安裝、2.樣品抽吸(100 μL)、3.反應(1 min，25℃)、4.全噴出、5.抽吸10 mM之PBS(140 mM之NaCl，pH值7.4)150 μL、6.保持測定位置(以下重複2→6)。 5-2.結果 5-2-1.根據測定結果得知，相較於使用全長抗體，使用奈米抗體時可感度良好地感測。(圖5) (實施例6：聚合物於粒子上之結合(共價鍵)
[化39]
6.1.氧化矽粒子之修飾及聚合 向乙醇800 μL中添加氧化矽粒子(扁平，紅色，200 nm，50 mg/mL)39.6 μl(1.98 mg)、純水60.4 μl、2M HCl 100 μl、2-溴-2-甲基丙酸3-(三乙氧基矽烷基)丙酯20.6 μl。利用漩渦攪拌器混合後再倒置混合，於25℃下反應19 h。將反應後之氧化矽粒子用純水進行離心洗淨後，使之再分散於乙醇。 將該經Br修飾之氧化矽粒子1 mL(1.98 mg/mL)以成為表5-1之組成之方式進行混合，於25℃下進行ATRP 16.5 h，從而於氧化矽表面合成含一級胺之MPC聚合物刷。將聚合後之聚合物刷修飾氧化矽粒子利用50%乙醇水溶液進行離心洗淨後，利用超音波使之分散。
[表5-1]
MPC 500 mM
甲基丙烯酸2-胺基乙酯鹽酸鹽 250 mM
EBIB 5 mM
TPMA 0.5 mM
CuBr 2 0.05 mM
抗壞血酸 5 mM
溶劑：50%乙醇水溶液
將洗淨後之聚合物刷修飾氧化矽粒子以成為表5-2之組成之方式進行混合，於25℃、1000 rpm、1 h之條件下進行反應，藉此對於氧化矽粒子表面之聚合物刷經由雙硫鍵分別導入有聚合官能基(甲基丙烯醯基)與反應性官能基(羧基)。將反應後之聚合性聚合物刷修飾氧化矽粒子利用50%乙醇水溶液進行離心洗淨。
[表5-2]
3,3'-二硫代二丙酸 15 mM
COOH-SS-甲基丙烯醯胺 15 mM
DMT-MM 30 mM
溶劑：50%乙醇水溶液
6.2.基板上之固定化 ・金基材之表面修飾 利用EtOH沖洗金基材(9.8 mm×4.3 mm)後，實施UV-O3處理15 min，對基材表面進行淨化。
於EtOH溶劑中製備2-(2-溴異丁醯氧基)十一烷基硫醇之1 mM之EtOH溶液，將上述金基材浸漬於該溶液中。於30℃下靜置20小時後利用EtOH、純水洗淨基材，從而於金基材表面形成自組單分子膜(Self-Assembled Monolayer：SAM)。使經聚合起始基修飾之基板與以成為表5-3之組成之方式進行了混合之預聚物溶液接觸，並於25℃下進行ATRP 20 h，從而於金基板表面合成含一級胺之MPC聚合物刷。將聚合後之基板用乙醇與純水洗淨。
[表5-3]
MPC 500 mM
甲基丙烯酸2-胺基乙酯鹽酸鹽 250 mM
EBIB 5 mM
TPMA 0.5 mM
CuBr 2 0.05 mM
抗壞血酸 5 mM
溶劑：50%乙醇水溶液
粒子之固定化 將聚合性氧化矽粒子分散液(3.3 μg/mL)與縮合劑(5 mM、DMT-MM)利用50%乙醇水溶液進行混合，並滴至基材(25℃、1小時)。其後依序利用EtOH、純水洗淨基材，獲得聚合物刷上之羧基與基板表面之胺基經共價鍵結而得之粒子固定化基材。 6.3.粒子變化 於聚合物刷修飾氧化矽粒子分散液(1 mg/mL、50%乙醇水溶液)中調配表5-4之試劑並進行聚合，藉此將氧化矽粒子表面之聚合物刷末端之Br基轉化為疊氮(N 3)基，製作疊氮化聚合物刷修飾氧化矽粒子。聚合後使用純水、甲醇進行離心洗淨。 繼而，於疊氮化聚合物刷修飾氧化矽粒子(1 mg/mL、80 μL)中添加甲醇80 μL與3 mM之DBCO(Dibenzocyclooctyne，二苯丙環辛炔)-胺溶液(DMSO、20 μL)，於25℃下反應1小時，藉此將疊氮基轉化為胺基，製作胺基化聚合物刷修飾氧化矽粒子。反應後使用50%乙醇水溶液進行離心洗淨。藉由使該胺基化聚合物刷修飾氧化矽粒子於縮合劑存在下與表面具有羧基之基材接觸，可獲得共價鍵之粒子固定化基板。
[表5-4]
EBIB TPMA CuBr 2 NaN 3 抗壞血酸
5 mM 0.5 mM 0.05 mM 60 mM 5 mM
(實施例7：聚合物殘留感測器) 7.使用螢光性陽離子聚合物之研究
[化40]
7-1.實驗 7-1-1.金基材之表面修飾 利用EtOH沖洗金基材(9.8 mm×4.3 mm)後，實施UV-O 3處理15 min，對基材表面進行淨化。
於EtOH溶劑中將2-(2-溴異丁醯氧基)十一烷基硫醇與羧基-EG6十一烷基硫醇以1：1進行混合，製備1 mM之EtOH溶液，將上述金基材浸漬於該溶液中。於30℃下靜置20小時後利用EtOH、純水洗淨基材，從而於金基材表面形成自組單分子膜(Self-Assembled Monolayer：SAM)。 7-1-2.粒子固定化基材之製作 將氧化矽奈米粒子分散液(粒徑200 nm、粒子濃度：2.0×10 11個/mL)與聚合物F1(1.0 mg/mL)以上述之終濃度於水中進行混合而形成複合體。
利用DMF稀釋上述複合體溶液，以相對於待複合體固定化之基材面積成為表6-1之方式進行滴加(4 μL)，於25℃下靜置1小時。
依序利用DMF、EtOH、純水洗淨基材，獲得粒子固定化基材。
基材之評價係利用螢光顯微鏡(KEYENCE，BZ-800)實施，使用軟體(雜交細胞計數)進行解析。將各測定條件示於表6-1。
[表6-1]
表6-1實驗條件表(聚合物FI)
No. 個數 [個/4 μL] 螢光顯微鏡測定條件(曝光時間)
綠 紅
粒子固定化後 聚合後 模板去除後 粒子固定化後 聚合後 模板去除後
1 1×10 7 0.1 sec 0.1 sec 0.2 sec 0.01 sec 0.01 sec 0.02 sec
2 3×10 6 ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑
3 1×10 6 ↑ ↑ 0.5 sec ↑ ↑ 0.05 sec
7-1-3.氧化矽奈米粒子壓印聚合物於粒子固定化基材上之合成 以表6-2所示之組成製作預聚物溶液，以冷凍脫氣之方式去除溶氧後，於手套式操作箱內在25℃下進行18小時聚合。將聚合後之基材用純水洗淨。
將上述基材浸漬於甲醇：純水＝1：1之溶液，進行5 min超音波處理，藉此去除氧化矽奈米粒子，從而於聚合物薄膜表層形成空孔。
[表6-2]
表.6-2預聚物溶液組成
   資料 濃度
主原料 MPC(2-甲基丙烯醯氧基乙基磷酸膽鹼) 500 mM
起始劑 EBIB(α-溴異丁酸乙酯) 1.25 mM
配體 TPMA(三(2-吡啶基甲基)胺) 0.125 mM
觸媒 CuBr 2 0.0125 mM
還原劑 抗壞血酸 1.25 mM
溶劑 EtOH 270 μL
7-1-4.直接型分析用感測器基材(直接型感測晶片)之製作
[化41]
經7-1-3於基板上形成聚合物層後，浸漬於50 mM三(2-羧基乙基)膦鹽酸鹽水溶液中，於25℃下反應1 h，藉此使粒子表面陽離子聚合物還原而生成硫醇基。
針對於硫醇基，滴加100 μm生物素-PEG11-馬來醯亞胺溶液(含10% DMSO之10 mM磷酸鹽緩衝液(pH值7.4))，於25℃下反應1小時，藉此由生物素進行了修飾。將反應後之基材用純水洗淨。
對經生物素修飾之基材滴加1 μm鏈黴抗生物素蛋白溶液(含140 mM之NaCl之10 mM磷酸鹽緩衝液(pH值7.4)：PBS)，於25℃下反應1小時，藉此由鏈黴抗生物素蛋白進行了修飾。將反應後之基材用PBS洗淨。
對經鏈黴抗生物素蛋白修飾之基材滴加0.1 μM抗體-生物素偶聯物溶液(PBS)，於25℃下反應1小時，藉此獲得具有抗體與源自陽離子聚合物之螢光分子之分析用感測器基材(直接型感測晶片)。將反應後之基材用PBS洗淨。 7-1-5.分析用感測器基材(直接型感測晶片)之評價 將7-1-4中獲得之感測晶片安裝於深江化成製造之扁平型移液管吸頭內，利用附帶螢光顯微鏡之自動分注裝置測定基材表面之螢光強度變化。 1.晶片安裝 2.重複10次150 μL PBS之抽吸、噴出，洗淨基材、晶片內部 3.抽吸樣品(源自PC3之胞外體)100 μL 4.反應1 min(25℃) 5.噴出樣品 6. 抽吸10 mM之PBS(140 mM之NaCl，pH值7.4)150 μL 7.測定(物鏡×5、cy3濾光器、燈光強度12、曝光時間0.5 sec) 7-2.結果 7-2-1.粒子固定化基材之製作 關於氧化矽奈米粒子與螢光性陽離子聚合物F1之複合體，利用Zeta Sizer對粒徑、表面Z電位實施測定，將測定結果示於表.6-3。於複合體之形成前後，表面Z電位從負值變為正值，因此成功確認到氧化矽奈米粒子與螢光性陽離子聚合物F1形成了複合體，又，根據粒徑及PDI，成功確認到粒子未凝集，無損分散性。
[表6-3]
表6-3利用Zeta Sizer之粒徑、表面Z電位測定結果
測定物 粒徑 PDI 表面Z電位
氧化矽奈米粒子 201.2 nm 0.01824 -29.97 mV
氧化矽奈米粒子+F1複合體 225.8 nm 0.1005 57.94 mV
又，將利用螢光顯微鏡獲得之觀察結果示於圖6-1。於任意樣品中均成功確認到來自氧化矽奈米粒子之綠色螢光及來自螢光性陽離子聚合物之紅色螢光，因此，確認到氧化矽奈米粒子-螢光性陽離子聚合物複合體固定於基材上。 7-2-2.氧化矽奈米粒子去除後之螢光性陽離子聚合物F1確認 將氧化矽奈米粒子-螢光性陽離子聚合物複合體固定化後之基材上之聚合物層聚合後之利用螢光顯微鏡獲得之觀察結果、及聚合後之氧化矽奈米粒子去除後之利用螢光顯微鏡獲得之觀察結果分別示於圖6-2及圖6-3。 根據圖6-2，於聚合後亦在基材上成功確認到來自氧化矽奈米粒子與螢光性陽離子聚合物之螢光，但根據氧化矽奈米粒子去除後之圖6-3，無法確認到來自氧化矽奈米粒子之綠色螢光，但另一方面，成功確認到來自螢光性陽離子聚合物之紅色螢光。據此確認到，於藉由實驗操作去除了氧化矽奈米粒子後，螢光性陽離子聚合物仍殘存於基材上所製作之聚合物層(氧化矽奈米粒子去除後之空孔內)。 7-2-3.直接型分析用感測器基材之評價 根據圖6-4，成功確認到來自氧化矽奈米粒子之綠色螢光及來自陽離子聚合物之紅色螢光，因此，確認到直接型感測晶片於基材上具有該等要素。將使用該基材之胞外體感測實驗之結果示於圖6-5。根據該結果，確認到基於添加胞外體引起之螢光分子(若丹明B)之增強螢光，確認到直接型感測晶片具有胞外體檢測能力。
(實施例8) 8.模板粒子固定化時之非共價鍵型與共價鍵型之比較研究
[化42]
8-1-1.金基材之表面修飾 利用EtOH沖洗金基材(9.8 mm×4.3 mm)後實施UV-O3處理20 min，對基材表面進行淨化。
將1 mM之2-(2-溴異丁醯氧基)十一烷基硫醇溶液(EtOH)與1 mM之羧基-EG6十一烷基硫醇溶液(EtOH)以1：1進行混合，製備該EtOH溶液(終濃度分別為0.5 mM)，將上述金基材浸漬於該溶液中。於30℃下靜置20小時後用EtOH洗淨基材，從而於金基材表面形成自組單分子膜(Self-Assembled Monolayer：SAM)。 8-1-2.粒子固定化基材之製作 8-1-2-1.共價鍵型粒子固定化基材之製作 利用DMF稀釋E3偶聯氧化矽NP氧化矽奈米粒子(粒徑200 nm、粒子濃度：2.0×10 11個/mL)，向其中以達到5 Mm之方式添加DMT-MM而獲得溶液，以相對於基材面積成為表7-1之方式滴加所得之溶液(4 μL)，於25℃下靜置1小時。
依序利用EtOH、純水洗淨基材，獲得粒子固定化基材。
基材之評價係利用螢光顯微鏡(KEYENCE，BZ-800)實施。將各測定條件示於表7-1。 8-2-2.非共價鍵型粒子固定化基材之製作 將氧化矽奈米粒子分散液(粒徑200 nm、粒子濃度：2.0×10 11個/mL)與聚合物E2(1.0 mg/mL)以上述之終濃度於水中進行混合而形成複合體。
利用DMF稀釋上述複合體溶液，以相對於待複合體固定化之基材面積成為表7-2所示之個數之方式進行滴加(4 μL)，於25℃下靜置1小時。
依序利用EtOH、純水洗淨基材，獲得粒子固定化基材。
基材之評價係利用螢光顯微鏡(KEYENCE，BZ-800)實施。將各測定條件示於表.7-2。
[表7-1]
表7-1實驗條件表(共價鍵型)
No. 個數 [個/4 μL] 螢光顯微鏡測定條件(曝光時間)
4倍物鏡 22.2倍物鏡 60倍物鏡
1 1×10 7 1.0 sec 0.2 sec 0.02 sec
2 1×10 6 ↑ ↑ ↑
3 1×10 5 ↑ ↑ ↑
[表7-2]
表7-2實驗條件表(非共價鍵型、聚合物：E2)
No. 個數 [個/4 μL] 螢光顯微鏡測定條件(曝光時間)
4倍物鏡 22.2倍物鏡 60倍物鏡
4 1×10 7 1.0 sec 0.2 sec 0.02 sec
5 1×10 6 ↑ ↑ ↑
6 1×10 5 ↑ ↑ ↑
8-1-3.氧化矽奈米粒子壓印聚合物於粒子固定化基材上之合成 以表.7-3所示之組成製作預聚物溶液與抗壞血酸溶液，以冷凍脫氣之方式去除溶氧後，於手套式操作箱內進行混合，在25℃下進行20小時聚合。將聚合後之基材用純水洗淨。
[表7-3]
表.7-3預聚物溶液組成
   試樣 濃度
主原料 MPC(2-甲基丙烯醯氧基乙基磷酸膽鹼) 500 mM
起始劑 EBIB(α-溴異丁酸乙酯) 1.25 mM
配體 TPMA(三(2-吡啶基甲基)胺) 0.125 mM
觸媒 CuBr 2 0.0125 mM
還原劑 抗壞血酸 1.25 mM
溶劑 EtOH 270 μL
8-1-4.氧化矽粒子之分離 向上述基材(共價鍵型、非共價鍵型)滴加30 mM氟化氫銨水溶液，去除氧化矽奈米粒子。將氧化矽粒子去除後之基材浸漬於50 mM之三(2-羧基乙基)膦鹽酸鹽)溶液(純水：甲醇＝1：1)中，於40℃下反應1 h，藉此，利用還原而於氧化矽粒子去除後之空孔內生成硫醇基。
氧化矽去除後之基材之評價係利用螢光顯微鏡(KEYENCE，BZ-800)實施。將各測定條件示於表7-4、表7-5。
[表7-4]
表7-4實驗條件表(共價鍵型)
No. 個數 [個/4 μL] 螢光顯微鏡測定條件(曝光時間)
4倍物鏡 22.2倍物鏡 60倍物鏡
1 1×10 7 1.0 sec 1 sec 0.2 sec
2 1×10 6 ↑ ↑ ↑
3 1×10 5 ↑ ↑ ↑
[表7-5]
表7-5實驗條件表(非共價鍵型、聚合物E2)
No. 個數 [個/4 μL] 螢光顯微鏡測定條件(曝光時間)
4倍物鏡 22.2倍物鏡 60倍物鏡
4 1×10 7 1.0 sec 1 sec 0.2 sec
5 1×10 6 ↑ ↑ ↑
6 1×10 5 ↑ ↑ ↑
8-1-5.空孔內之後修飾 對於利用還原而於空孔內生成之硫醇基，滴加100 μm生物素-PEG11-馬來醯亞胺溶液(含10%DMSO之10 mM磷酸鹽緩衝液(pH值7.4))，於25℃下反應1小時，藉此由生物素進行了修飾。將反應後之基材用純水洗淨。
對經生物素修飾之基材滴加1 μM鏈黴抗生物素蛋白溶液(含140 mM之NaCl之10 mM磷酸鹽緩衝液(pH值7.4)：PBS)，於25℃下反應1小時，藉此由鏈黴抗生物素蛋白進行了修飾。將反應後之基材用PBS洗淨。
對經鏈黴抗生物素蛋白修飾之基材滴加0.1 μM混合生物素溶液(PBS，抗體-生物素偶聯物：Cy5-PEG-生物素偶聯物＝1：1)，於25℃下反應1小時，藉此獲得導入有抗體與螢光分子之感測晶片。將反應後之基材用PBS洗淨。 8-1-6.感測晶片之評價 將8-1-5中獲得之感測晶片安裝於深江化成製造之扁平型移液管吸頭內，利用附帶螢光顯微鏡之自動分注裝置測定基材表面之螢光強度變化。 1.晶片安裝 2.重複10次150 μL PBS之抽吸、噴出，洗淨基材、晶片內部 3.抽吸樣品(源自PC3之胞外體)100 μL 4.反應1 min(25℃) 5.噴出樣品 6.抽吸10 mM之PBS(140 mM之NaCl，pH值7.4)150 μL 7.測定(物鏡×5、cy5濾光器、燈光強度12、曝光時間0.5 sec) 7-2.結果 8-2-1.粒子固定化基材之製作 將利用螢光顯微鏡獲得之觀察結果示於圖7-1。於任一條件下，均於基板上確認到來自氧化矽奈米粒子之螢光，因此成功確認到於基板上固定化有氧化矽奈米粒子。將氟化氫銨處理後之利用螢光顯微鏡獲得之觀察結果示於圖7-2。於任一條件下，均幾乎未能於基板上確認到來自氧化矽奈米粒子之螢光，故成功確認到利用氟化氫銨處理去除了氧化矽奈米粒子。
將氟化氫銨處理後之利用橢偏儀之膜厚測定結果示於圖7-3。關於共價鍵型，所形成之膜厚為1 nm左右。關於非共價鍵型，測得之膜厚為9-10 nm左右。 8-2-3.空孔內之後修飾 對於利用還原而於空孔內生成之硫醇基，滴加100 μm生物素-PEG11-馬來醯亞胺溶液(含10%DMSO之10 mM磷酸鹽緩衝液(pH值7.4))，於25℃下反應1小時，藉此由生物素進行了修飾。將反應後之基材用純水洗淨。
對經生物素修飾之基材滴加1 μm鏈黴抗生物素蛋白溶液(含140 mM之NaCl之10 mM磷酸鹽緩衝液(pH值7.4)：PBS)，於25℃下反應1小時，藉此由鏈黴抗生物素蛋白進行了修飾。將反應後之基材用PBS洗淨。
對經鏈黴抗生物素蛋白修飾之基材滴加0.1 μm混合生物素溶液(PBS，抗體-生物素偶聯物：Cy5-PEG-生物素偶聯物＝1：1)，於25℃下反應1小時，藉此獲得導入有抗體與螢光分子之感測晶片。將反應後之基材用PBS洗淨。 8-2-4.感測晶片之評價 以下展示使用以非共價鍵型製作之凹型感測晶片進行胞外體之識別能力評價的結果。根據該結果，利用對基材以1×10 6個/4 μL之濃度實施了粒子固定化之感測晶片進行胞外體識別時，螢光分子之螢光強度變化最大，並且，螢光強度變化隨著濃度為1×10 6個/4 μL、1×10 7個/4 μL、1×10 8個/4 μL、1×10 5個/4 μL之順序不斷增大。
當變化最小之1×10 5個/4 μL時，認為基材上之識別空孔之密度低，故感度降低，又，當為1×10 7個/4 μL、1×10 8個/4 μL時，認為螢光背景增大，故相對螢光強度之變化變小。
根據以上情況，藉由控制基材表面之識別空孔密度，成功提昇了胞外體識別能力(檢測感度)。(圖7-4) (實施例9) 使用末端導入有吡啶二硫醚之胺聚合物(PD-NIPAM-胺)之螢光導入 (實驗操作) (SAM於基板上之形成) 將金基板浸漬於0.5 mM之2-(2-溴異丁醯氧基)十一烷基硫醇, 0.5 mM羧基-EG6十一烷基硫醇EtOH溶液中(30℃，20 h)，形成SAM。 (粒子之製備) 與導入有COOH之氧化矽粒子(粒子核、200 nm)水懸浮液附著之聚合物
[化43]
以與水溶液之終濃度分別成為1.67 mg/mL與0.1 mg/mL之方式進行混合，立即利用DMF稀釋250倍，將溶液4 μL滴至基板(3.2×10 6個/4 μL)(25℃，1 h)。 (聚合物基質之合成) 利用EtOH洗淨核殼粒子經固定化之基板之後，使用下表之原料，藉由原子轉移自由基聚合形成薄膜(40℃，18 h)。
[表8]
MPC：EBIB＝800：1
MPC 500 mM
α-溴異丁酸乙酯 0.625 mM
TPMA 0.0625 mM
CuBr 2 6.25 μM
L-抗壞血酸 0.625 mM
EtOH 270 μL
(粒子核之去除) 利用乙醇、純水洗淨後，將乙酸與乙醇以1：1進行混合，將基板浸漬於所得之溶液中，置於超音波清潔器(Bransonic)中5分鐘。 (共聚而成之聚合物之去除) 浸漬於將100 mM TCEP水溶液與甲醇以1：1進行混合而成之溶液中，利用Thermo振盪器於40℃、1 h、1000 rpm之條件下進行攪拌。 (生物素與PD-NIPAM-胺之導入) 將含100 μm生物素-PEG11-馬來醯亞胺之PB(10%DMSO)與0.15 mg/mL之PD-NIPAM-胺水溶液以1：1進行混合，將所得之溶液30 μL滴至基板。(25℃，1 h)
[化44]
(螢光分子(ATTO647)於PD-NIPAM-胺中之導入) 將含100 μM之ATTO 647 NHS的0.1 M碳酸氫鈉緩衝液pH值8.0(10%DMSO)30 μL滴至基板(25℃，1 h)。 (鏈黴抗生物素蛋白之導入) 滴加含0.1 μM鏈黴抗生物素蛋白之PBS 30 μL(25℃，30 min)。 (生物素化抗體(抗CD9抗體)之導入) 製備含0.1 μM生物素-PEG12-抗CD9之PBS(25℃，30 min)，將基板保管於上述PBS中。利用附帶SIC自動分注裝置之螢光顯微鏡，按以下之條件進行螢光測定。 螢光顯微鏡 相機：Zyla4.2 濾光器：Cy5 物鏡：×5 曝光時間：0.5 sec 光量：12% 光源：水銀燈 自動分注裝置之順序 1.晶片安裝 2.進行10次抽吸PBS 150 μL後噴出之操作 3.抽吸樣品(源自PC3之胞外體)100 μL 4.反應1 min(25℃) 5.全噴出 6.抽吸10 mM之PBS(140 mM之NaCl，pH值7.4)150 μL 7.保持測定位置；重複3～7 (生物素-PEG12-抗CD9與生物素化兔IgG之比較) 將生物素-PEG12-抗CD9與生物素化兔IgG之比較結果彙總於圖8。
(研究) 於導入有識別源自PC3之胞外體之表面抗原CD9的抗CD9抗體之情形時，與胞外體濃度依存性地觀察到螢光應答，但於導入有不識別源自PC3之胞外體之表面抗原的兔IgG之情形時，未發現與胞外體濃度依存性之應答。其表明，於所形成之分子壓印支架(例如凹部或凸部)內配置有結合性分子與訊號物質，結合性分子選擇性地捕捉靶物質，並且訊號物質讀出該捕捉行為。
(實施例10：His標籤聚合物與氧化矽奈米粒子之複合化) [化45] [表B]
試樣 Mw. 濃度. (mM) 最終液量 (mL) 重量 (mg)
N-丙烯醯基高半胱胺酸硫內酯 171.22 100 1 17
(3-(二甲胺基)丙基)甲基丙烯醯胺 170.25 200 1 35
NIPAm 113.16 700 1 79
2-氰基-2-[(十二烷基硫基硫羰基)硫基]丙烷 345.63 10 1 3.5
AIBN 164.21 5 1 0.8
將上述配方之化合物放入舒倫克燒瓶(25 mL)中，使該等溶解於DMF(最終液量：1 mL)。最後添加RAFT劑及起始劑。放入攪拌棒後進行脫氣氬氣置換，於油浴(設定溫度：70℃)中進行聚合(17 h)。(攪拌速度300 rpm) 聚合後將舒倫克燒瓶冰浴冷卻，藉由送入空氣而使反應停止。將反應溶液添加至大量之二乙醚中，回收所產生之沈澱。利用二乙醚洗淨沈澱，進行真空乾燥。 將所獲得之聚合物5 mg、His標籤(具有自N末端起結合有6個組胺酸、結合有3個甘胺酸，且於C末端結合有離胺酸者中C末端之羧基經醯胺化之結構者)4 mg、吡啶基二硫代乙基-PEG3-甲基丙烯醯胺3.5 mg、TEA 2.8 μL溶解於DMF(0.3 mL)，並攪拌9小時。向反應液中添加CH 2Cl 2、正己烷，回收所產生之沈澱，進行真空乾燥而獲得聚合物(E11His)。
iii)E11His 於經2-(2-溴異丁醯氧基)十一烷基硫醇與NTA-SAM形成試劑(formation reagent)修飾之金基板上滴加4 mM NiCl 2水溶液後靜置(室溫，15 min)，然後用純水洗淨基板。將氧化矽奈米粒子(200 nm，COOH末端)與E11His水溶液之混合溶液(氧化矽濃度2.0×10 11粒子/mL、聚合物濃度1 mg/mL)利用DMF稀釋至4、400倍。將該等溶液4 μL滴至與NiCl 2反應後之金基板上，並靜置1小時。其後利用EtOH洗淨表面，用螢光顯微鏡進行觀察。將結果示於圖9。
(實施例11：陽離子氧化矽奈米粒子＋陰離子聚合物Ex8) 1.陰離子聚合物Ex8之合成方法 [化46] 將表C之配方之化合物放入舒倫克燒瓶(25 mL)中，使該等溶解於DMF(最終液量：1 mL)。最後添加RAFT劑及起始劑，放入攪拌棒後進行脫氣氬氣置換，於油浴(設定溫度：70℃)中進行聚合。(16 h)。 聚合後將舒倫克燒瓶冰浴冷卻，藉由送入空氣而使反應停止，將反應溶液添加至大量之二乙醚中，回收所產生之沈澱。利用二乙醚洗淨所回收之沈澱後進行真空乾燥，獲得聚合物。 將所獲得之聚合物、TEA 70 μL(0.5 mmol)溶解於CH 2Cl 2，於冰浴冷卻下進行攪拌，向其中添加甲基丙烯酸N-丁二烯亞胺酯54 mg(0.3 mmol)，並攪拌一夜。其後，向反應溶液中添加正己烷，回收所產生之沈澱。使該沈澱再溶解於少量之CH 2Cl 2，添加過量之正己烷而產生沈澱，回收該沈澱進行真空乾燥，獲得目標聚合物(Ex8)。 產量：120 mg [表C]
試樣 Mw. 濃度. (mM) 最終液量(mL)
N-(3-胺基丙基)甲基丙烯醯胺鹽酸鹽 178.66 100 1
4-[(2-甲基-1-側氧基-2-丙烯-1-基)胺基]丁酸 171.19 200 1
異丙基丙烯醯胺(NIPAm) 113.16 700 1
2-氰基-2-[(十二烷基硫基硫羰基)硫基]丙烷 345.63 10 1
AIBN 164.21 5 1
2.氧化矽奈米粒子與聚合物之複合 將氧化矽(紅色，扁平，200 nm，50 mg/mL)1.98 mg(39.6 μL)與純水60.4 μL(共100 μL)進行混合，添加至預先裝在1.5 mL微量離心管中之EtOH 800 μL中，然後進而添加2 M之HCl 100 μL、APTES 15 μL，於25℃下利用Thermo振盪器以1000 rpm反應20 h。反應後利用乙醇進行離心洗淨(5000 rpm，10 min×3)。 將所製作之氧化矽奈米粒子分散液(NH 2末端，200 nm、4.0×10 11粒子/mL、50 mM碳酸鹽緩衝液(pH值8.0))20 μL與Ex8碳酸鹽緩衝液溶液(2 mg/mL)20 μL進行混合，於25℃下靜置15分鐘。
3.DLS測定 將2之複合體用純水稀釋100倍，使用DLS測定粒徑及Z-電位。
4.基板上之固定化 將2之複合體利用DMF稀釋至80倍。於經2-(2-溴異丁醯氧基)十一烷基硫醇：胺基-EG6十一烷基硫醇(1：1 vol)修飾之金基板上滴加4 μL，在25℃下靜置1 h。其後，利用EtOH洗淨表面，用螢光顯微鏡及SEM觀察表面(圖10)。 [化47] 根據利用DLS獲得之粒徑測定結果及Z-電位測定之結果提示出，陰離子性聚合物吸附於氧化矽奈米粒子，從表面帶正電之狀態變為帶負電之狀態。又，粒徑未發生較大變化，據此表明，於聚合物吸附後亦保持了分散性。 [表D]
   氧化矽奈米粒子 Ex8複合後
粒徑(nm) 221.5 251.7
Z-電位(mV) 34.4 -14.4
(結果) 根據圖10之觀察結果，觀察到來自氧化矽奈米粒子之螢光亮點單分散、未凝集且以單層進行分佈。據此表明，即便使陰離子聚合物Ex8與陽離子氧化矽奈米粒子複合，亦與陽離子聚合物Ex8和陰離子氧化矽奈米粒子之情形相同，能夠以單分散、未凝集且單層地於基板固定粒子。
(實施例12：陽離子性奈米粒子＋陰離子聚合物) [化48]
(所使用之氧化矽奈米粒子) ・E2-0偶聯紅色-COOH氧化矽(RM)200 nm 4.0×10 11個/ml
(聚合物溶液) ・聚合物終濃度0.87 mg/mL(10 mM PB，pH值7.47)
(陰離子氧化矽) ・將氧化矽奈米粒子分散液與聚合物AN-1進行混合，形成複合體。 (氧化矽終濃度1.0×10 11個/ml、聚合物終濃度0.435 mg/mL(5 mM PB)) 將上述複合體溶液利用DMF稀釋4、40、400、4000倍，對於待複合體固定化之基材滴加4 μL，於25℃下靜置1小時。利用乙醇洗淨基材，獲得粒子固定化基材。
(聚合物基質合成) 藉由ATRP形成薄膜(25℃，20 h)。
(粒子核之去除元) 將50%乙酸/MeOH 300 μL加入1.5 mL管中，逐個基板地進行浸漬，進行8分鐘超音波處理後，用純水洗淨。
(S-S還原切斷) 添加至50 mM之三(2-羧基乙基)膦鹽酸鹽50%MeOH水溶液中，於40℃下反應1 h。將反應後之基材用純水洗淨。
(螢光色素之導入) 將50 μm之Alexa 647-C2-馬來醯亞胺、50 μm馬來醯亞胺-C3-NTA(5%DMSO 10 mM PB(7.4))溶液30 μL滴至基板，於25℃下靜置1 h進行反應，然後用純水洗淨。 安裝於深江化成製造之扁平型移液管吸頭內，利用附帶螢光顯微鏡之自動分注裝置測定基材表面之螢光強度變化。 順序 1.晶片安裝/PBS抽吸(150 μL)，獲取抗體固定化前之圖像 2.Ni錯合物之形成 抽吸4 mM之NiCl 2(水溶液)100 μL，反應5 min(25℃) 清洗   純水×4次，抽吸150 μL後噴出 3.帶His標籤之蛋白G固定化 抽吸1 μM帶His標籤之蛋白G(PBS，abcam)100 μL，反應10 min(25℃) 清洗 0.01% tween(註冊商標)20 PBS×2次、PBS×2次 抽吸150 μL後噴出 4.抗體固定化 抽吸100 nM之抗CD9(市售品)(PBS)100 μL，反應10 min(25℃) 清洗 0.01% tween(註冊商標)20 PBS×2次、PBS×2次 抽吸150 μL後噴出 5.測定背景(F0：0.1%BSA，100 mM之PB(pH值7.0)，0.15 M之NaCl)5次 6.胞外體吸附 調整為0、3、30、300、1000 fM之SKBR3培養上清液胞外體(0.1%BSA，100 mM PB(pH值7.0)，0.15 M之NaCl) 抽吸樣品(源自SKBR3之胞外體)100 μL，反應5 min(25℃) 圖像獲取 螢光顯微鏡 相機：Zyla4.2 濾光器：Cy5 (激發波長604-644 nm，螢光波長672-712 nm) 物鏡：×5 曝光時間：0.5 sec 光量：12% 光源：水銀燈 抽吸0.01% tween(註冊商標)20 PBS 150 μL後噴出 重複1～6
(結果) 針對於陽離子表面之基材使用陰離子聚合物修飾氧化矽粒子所製作之感測晶片，亦成功確認到藉由添加10 fM之源自SK-BR3細胞株之胞外體，有約5%之相對螢光強度變化。
(實施例13：生物降解性奈米粒子：聚乳酸/乙醇酸共聚物(PGLA)) [化49]
(SAM於基板上之形成) 將金基板浸漬於0.5 mM之2-(2-溴異丁醯氧基)十一烷基硫醇, 0.5 mM之羧基-EG6十一烷基硫醇EtOH溶液中，形成SAM。(30℃，20 h)
(粒子之製備) 對螢光性羧基化PGLA奈米粒子(200 nm)水懸浮液進行1 min超音波(Lv2)後，以奈米粒子與E2聚合物水溶液之終濃度成為2×10 11粒子/mL與1 mg/mL之方式進行混合，利用EtOH稀釋80倍，將所得之溶液4 μL滴至基板(1.0×10 7粒子/4 μL)，於25℃下靜置1 h後，利用EtOH洗淨3次。
(SEM觀察、螢光觀察) 以E2聚合物水溶液成為1 mg/mL之方式進行混合後，利用EtOH進行稀釋，將所得之溶液4 μL滴至基材(1.0×10 7粒子/4 μL)，於25℃下靜置1 h後，利用EtOH洗淨3次 於EtOH中進行基板上之螢光觀察(KEYENCE BZ-X800、激發波長470±20 nm/螢光波長525±25 nm)。其後，進行真空乾燥，金濺鍍後，觀察掃描式電子顯微鏡(SEM)圖像。(圖11)
(結果) 展示出不遜於氧化矽奈米粒子或聚苯乙烯奈米粒子之樣態，得知該方法能夠應用於所有核粒子。
(實施例14：氧化矽奈米粒子＋含有芳香族成分之陽離子聚合物E2P20) 1.E2P20合成方法 [化50] 含有芳香族成分(苯基)之陽離子聚合物E2P20係以如下方式進行合成。 將上述配方之化合物放入舒倫克燒瓶(25 mL)中，使該等溶解於DMF(最終液量：2 mL)。最後添加RAFT劑及起始劑。放入攪拌棒後進行脫氣氬氣置換，於油浴(設定溫度：75℃)中進行聚合(24 h)。(攪拌速度300 rpm) 聚合後將舒倫克燒瓶冰浴冷卻，藉由送入空氣而使反應停止。將反應溶液添加至大量之二乙醚中，回收所產生之沈澱。利用二乙醚洗淨沈澱，進行真空乾燥。 將前項中製作之聚合物、TEA 42 μL溶解(或分散)於CH 2Cl 2中，並進行攪拌。向其中添加甲基丙烯酸N-丁二烯亞胺酯37 mg並攪拌一夜。反應後，向反應溶液中添加正己烷，回收所產生之沈澱。向沈澱中加入MeOH、CH 2Cl 2、正己烷，回收所產生之沈澱，進行真空乾燥，獲得目標聚合物(E2P20)。 產量：110 mg [表E]
試樣 Mw. 濃度 (mM) 最終液量 (mL) 重量 (mg) 液量 (μL)
Cys-甲基丙烯醯胺 256.82 100 2 51.364 -
N-(3-(二甲胺基)丙基)甲基丙烯醯胺 170.25 100 2 34.050 36.223
N-苯基丙烯醯胺 147.18 100 2 29.436   
N-異丙基丙烯醯胺(NIPAm) 113.16 200 2 45.264 -
2-氰基-2-[(十二烷基硫基硫羰基)硫基]丙烷 345.63 12.5 2 8.641 -
AIBN 164.21 6.25 2 2.053 -
2.氧化矽奈米粒子與聚合物之複合 將氧化矽奈米粒子水分散液(COOH末端，200 nm，Lot.0921940-03、4.0×10 11粒子/mL)40 μL與E2P20水溶液(2 mg/mL)40 μL進行混合，於25℃下靜置15分鐘，形成氧化矽奈米粒子與E2P20之複合體。
3.DLS測定 將氧化矽奈米粒子與E2P20之複合體用純水稀釋100倍，使用DLS測定粒徑及Z-電位。
4.基板上之固定化 將氧化矽奈米粒子與E2P20之複合體用DMF稀釋至80倍，於經2-(2-溴異丁醯氧基)十一烷基硫醇：羧基-EG6十一烷基硫醇(1：1)修飾之金基板上滴加4 μL，於25℃下靜置1 h。其後利用EtOH洗淨表面，利用螢光顯微鏡及SEM觀察表面。 根據利用DLS獲得之粒徑測定結果及Z-電位測定之結果提示出，陽離子性聚合物吸附於氧化矽奈米粒子，從表面帶負電之狀態變為帶正電之狀態。又，粒徑未發生較大變化，據此表明，於聚合物吸附後亦保持了分散性。 [表F]
   氧化矽奈米粒子 E2P20複合後
粒徑(nm) 210.1 223.2
Z-電位(mV) -41.2 45.8
(結果) 根據圖12-1所示之觀察結果，觀察到來自氧化矽奈米粒子之螢光亮點單分散、未凝集且以單層進行分佈。據此表明，E2中導入有芳香族成分(苯基)之E2P20與E2之情形相同，當與氧化矽奈米粒子複合化而固定於基板上時，單分散且未凝集，能夠以單層固定於基板。
(實施例15：聚苯乙烯奈米粒子＋含有芳香族成分之陽離子聚合物E2P20) 使用聚苯乙烯奈米粒子代替實施例14中之氧化矽奈米粒子，使之與含有芳香族成分之陽離子聚合物E2P20複合化。 [化51] 將聚苯乙烯(PS)奈米粒子(250 nm，COOH末端，2.0×10 12粒子/mL)20 μL與E2P20水溶液(2 mg/mL)20 μL進行混合，將該溶液利用DMF稀釋至40、400、4000、40000倍。將該等溶液4 μL滴至經2-(2-溴異丁醯氧基)十一烷基硫醇與羧基-EG 6十一烷基硫醇修飾之金基板上，並靜置1小時。其後利用EtOH洗淨表面，並用螢光顯微鏡進行觀察。(圖12-2)
(結果) 觀察到與氧化矽奈米粒子之情形相同，即便使用聚苯乙烯奈米粒子，不論滴加之粒子數如何，螢光亮點單分散且未凝集，以單層進行了分佈。據此表明，即便於陽離子聚合物中導入芳香族成分，亦能夠以單分散、未凝集且單層地固定粒子。
(實施例16：具有負電荷核之核之粒子之製作) 1.DEAED修飾氧化矽奈米粒子之製作 對氧化矽奈米粒子(2.0×10 11粒子/mL)進行超音波處理(High，Level 4.5，5 min)，與二乙胺基乙基-聚葡萄糖(Diethylaminoethyl-Dextran，DEAED)(1.0 mg/mL)以上述濃度作為終濃度在水中進行混合。對其實施超音波處理(High，Level 4.5，5 min)，藉由靜電相互作用對粒子最表面修飾DEAED。將多餘之游離DEAED藉由離心分離(5000 rpm，5 min)去除。 2.CMD之修飾 對DEAED修飾氧化矽奈米粒子(2.0×10 11粒子/mL)進行超音波處理(High，Level 4.5，5 min)，使之分散，與羧基甲基-聚葡萄糖(Carboxymethyl-Dextran，CMD)(1.0 mg/mL)以上述濃度作為終濃度在水中進行混合。對其實施超音波處理(High，Level 4.5，5 min)，藉由靜電相互作用對粒子最表面修飾CMD。將多餘之游離CMD藉由離心分離(5000 rpm，5 min)去除。 3.E2B之修飾 對CMD修飾粒子(2.0×10 11粒子/mL)進行超音波處理(High，Level 4.5，5 min)，使之分散，與陽離子聚合物即E2(1.0 mg/mL)以上述濃度作為終濃度在水中進行混合。對其實施超音波處理(High，Level 4.5，5 min)，藉由靜電相互作用對粒子最表面修飾E2。 →針對每一步驟，藉由DLS測定，對粒徑及表面Z電位進行測定。 DLS測定係以各粒子濃度成為10 8粒子/mL級之方式用純水稀釋後進行測定。 (裝置：Zetasizer Advanced Ultra(Malvern公司製造)) (具有負電荷核之核之粒子之評價) 將利用DLS之表面Z電位之測定結果示於圖13，得知，每一聚合物修飾步驟，表面Z電位之正負均會反轉，獲得了核粒子上堆積複數種電荷不同之聚合物而成之粒子。 (基板上之固定化) SAM於基板上之形成 製備將1 mM之2-(2-溴異丁醯氧基)十一烷基硫醇溶液(EtOH)與1 mM羧基-EG6十一烷基硫醇溶液(EtOH)以1：1混合而成之EtOH溶液(終濃度分別為0.5 mM)，將上述金基材浸漬於該溶液中。於30℃下靜置20小時後利用EtOH洗淨基材，從而於金基材表面形成自組單分子膜(Self-Assembled Monolayer：SAM)。 粒子之固定化 將經複數種聚合物被覆之粒子之原液(25 mg/mL，3×10 12粒子/mL)利用DMF進行稀釋以使之達到1×10 7粒子/4 μL，並於基板上滴加4 μL。 於25℃下靜置1小時，使粒子固定於基板上之後，利用EtOH洗淨基板。
(聚合、核粒子去除) 聚合 以表G所示之配方製作預聚物溶液，於脫氣後在氬氣氛圍下分注至裝有基板之PCR中，於25℃、20 h、500 rpm之條件下進行聚合。 表G聚合物基質配方： [表G]
化合物 總量
MPC：2-(甲基丙烯醯氧基)乙基磷酸膽鹼 500 mM
TPMA：三(2-吡啶基甲基)胺 1 mM
CuBr2 1 mM
L-抗壞血酸 0.5 mM
EtOH 270 μL
水洗 聚合後，取出基板放於培養皿上，加入過量之純水，緩慢攪拌一夜，去除多餘之MPC聚合物。
圖14表示固定化後進行聚合後之螢光顯微鏡圖像。 得知，與使用單一聚合物之情形相同，無凝集且均勻地固定化後進行了聚合。
核粒子去除 將基板放入至1.5 mL微量離心管中，分注洗淨液(含1 M之NaCl之50 mM碳酸鹽緩衝液(pH值9.0))500 μL，於80℃、1 h、250 rpm之條件下平穩地進行攪拌，去除粒子。其後，用純水洗淨基板。 對聚合後及核粒子去除後之基板表面利用螢光顯微鏡(BZ-800)進行觀察。觀察條件設為：物鏡倍率4倍、濾光器：TRITC、曝光時間1秒及物鏡倍率60倍、濾光器：TRITC、曝光時間0.02秒。 其結果確認到，經複數種聚合物被覆之粒子亦無凝集地固定於基板上，又，用清潔液自基板上去除了核粒子。(圖15)
(實施例17：螢光分子與錯合物形成部位於粒子去除後之空孔中之導入) (陽離子聚合物E2之還原及洗淨) 對核粒子去除後之基板滴加0.5 mM之TCEP-HCl水溶液30 μL，於25℃下靜置10 min，將雙硫鍵還原。其後，進行2次將基板浸漬於純水中洗淨。 繼而，將還原後之基板放入至1.5 mL微量離心管中，分注清潔液(含1 M NaCl之50 mM碳酸鹽緩衝液(pH值9.0))500 μL，於80℃、0.5 h、250 rpm之條件下平穩地進行攪拌，去除殘存於基板上之陽離子聚合物。其後，用純水洗淨基板。
(螢光分子與錯合物形成部位於生成之硫醇基中之導入) 將50 μm之Alexa 647-C2-馬來醯亞胺、50 μM馬來醯亞胺-C3-NTA(5%DMSO 10 mM之PB(7.4))溶液20 μL滴至基板，於遮光下在25℃下靜置1 h，藉由硫醇基與馬來醯亞胺基之反應，而於基板上導入有螢光分子與錯合物形成部位。其後，進行2次將基板浸漬於DMSO中洗淨，並進行2次浸漬於純水中之洗淨。
(空孔內之抗體導入及胞外體檢測) (NTA-Ni錯合物) 對基板滴加4 mM之NiCl 2水溶液20 μL，於遮光下在25℃下靜置15 min，形成NTA-Ni錯合物。其後，進行2次將基板浸漬於純水中洗淨。
(帶His標籤之蛋白G之結合) 對基板滴加含1 μM帶His標籤之蛋白G之10 mM PBS(pH值7.4)20 μL，於遮光下在25℃下靜置1 h，藉此形成與NTA-Ni之錯合物，藉此導入帶His標籤之蛋白G。其後，進行2次將基板浸漬於PBS中洗淨。
(抗CD9之結合) 對基板滴加含0.3 μM抗CD9之10 mM PBS(pH值7.4)20 μL，於遮光下在25℃下靜置1 h，藉此將抗體導入至帶His標籤之蛋白G。其後，進行2次將基板浸漬於PBS中洗淨。 吸附實驗
將基板插入至深江化成製造之扁平移液管吸頭，使用附帶自動分注裝置之螢光顯微鏡，藉由螢光測定實施胞外體之檢測實驗。關於螢光顯微鏡之測定條件，濾光器設為Cy5，物鏡設為5倍，曝光時間設為0.5秒，光量設為12%，光源設為水銀燈。又，將試樣溶解於10 mM磷酸鹽緩衝液(140 mM之NaCl，pH值7.4)中，調整為特定之濃度。
(結果) 確認到相對於源自PC3之胞外體濃度1 fM，有5%左右之相對螢光強度變化。得知，即便修飾物質核係使用複數種聚合物來製作，亦顯示出與使用單一聚合物之情形相同之應答。
(比較例1：國際公開第2018/221271號及Toshifumi Takeuchi et al., J. Am. Chem. Soc., 2020年03月10日，Vol.142，Page.6617-6624之條件下之氧化矽奈米粒子凝集固定化) 1.His標籤與硫醇基向氧化矽奈米粒子之導入 將螢光性氧化矽奈米粒子(紅色-COOH，200 nm，Lot.0442240-01)用水調整為25 mg/mL(3.0×10 12粒子/mL)。向氧化矽奈米粒子水懸浮液1 mL中添加50 mM之His標籤(具有自N末端起結合有6個組胺酸、結合有3個甘胺酸，且於C末端結合有離胺酸者中C末端之羧基經醯胺化之結構)水溶液10 μL與50 mM之2-胺基乙硫醇-HCl水溶液10 μL、50 mM之DMT-MM水溶液10 μL，使用Thermo振盪器，於25℃下以1000 rpm反應19小時，從而對氧化矽奈米粒子導入His標籤與硫醇基。 2.基板之製作 將金基板浸漬於0.5 mM之2-(2-溴異丁醯氧基)十一烷基硫醇、0.5 mM胺基-EG6十一烷基硫醇之EtOH溶液中，對基板表面導入胺基與溴基(30℃，20 h)。 3.於基板上導入NTA而形成鎳錯合物 對導入有胺基與溴基之基板滴加5 mM之異硫氰基苄基-NTA之DMSO溶液80 μL，於25℃下靜置2小時。分別利用DMSO洗淨2次、用純水洗淨2次，進行N 2乾燥。滴加4 mM之NiCl 2水溶液30 μL，於25℃下靜置15分鐘，用純水洗淨3次，形成NTA之Ni錯合物。 4.導入有His標籤與硫醇基之氧化矽奈米粒子之固定化 將導入有His標籤與硫醇基之氧化矽奈米粒子按照表中所示之濃度，以磷酸鹽緩衝生理鹽水(PBS)作為溶劑，向上述基板滴加50 μL，於25℃下靜置1小時。利用PBS進行3次基板之洗淨，用螢光顯微鏡(Keyence BZ-800)及SEM觀察基板表面。(圖16) [表H]
操作 粒子濃度 (mg/mL) 溶劑種類 滴加量(μL) 滴加粒子數
1.0-PBS 1.0 PBS 50 6.0×10 9粒子/50 μL
5.1-PBS 5.1 PBS 50 3.1×10 10粒子/50 μL
根據圖16之觀察結果，亦局部發現單個氧化矽粒子，但觀察到大部分凝集之情況。據此表明，當對氧化矽奈米粒子修飾His標籤後再固定於基板時，未能單分散且未凝集、以單層進行固定化。
(比較例2：於未使用粒子之情況下製作之感測器之感度) [化52] (SAM於基板上之形成) 對金基材(9.8 mm×4.3 mm)實施UV-O 3處理20 min，對基材表面進行淨化。於EtOH溶劑中將2-(2-溴異丁醯氧基)十一烷基硫醇與羧基-EG6十一烷基硫醇以1：1進行混合，製備1 mM之EtOH溶液，將上述金基材浸漬於該溶液中。於30℃下靜置20小時後利用EtOH洗淨基材，從而於金基材表面形成自組單分子膜(Self-Assembled Monolayer：SAM)。將聚合物E2水溶液(1 mg/mL)利用DMF稀釋80倍，對形成有SAM之基材滴加4 μL，於25℃下靜置1小時。用乙醇洗淨基材。
(聚合物基質合成) 製作預聚物溶液與抗壞血酸溶液，以冷凍脫氣之方式去除溶氧後，於手套式操作箱內進行混合，在25℃下進行20小時聚合。將聚合後之基材用純水洗淨。 [表I]
ATRP配方
MPC 500 mM
α-溴異丁酸乙酯 1.25 mM
TPMA 0.125 mM
CuBr 2 0.0125 mM
L-抗壞血酸 1.25 mM
EtOH 270 μL
(乙酸處理) 放入50%MeOH-50%乙酸溶液中，進行5 min超音波處理後用純水洗淨。
(S-S還原切斷) 將0.5 mM之三(2-羧基乙基)膦鹽酸鹽)水溶液添加至Thermo振盪器中，於40℃下預熱5 min後放入乙酸處理後之基材，於40℃下反應1 min。將反應後之基材用純水洗淨。
(螢光、NTA導入) 滴加含50 μM之馬來醯亞胺-C3-NTA-50 μM Alexa 647-C2-馬來醯亞胺之20%DMSO之10 mMPB(pH值7.4)溶液30 μL，於25℃下靜置1 h進行反應，然後用DMSO與純水洗淨。
(帶His標籤之蛋白G、抗體導入) 將4 mM之NiCl 2水溶液30 μL滴至基材上，然後靜置(25℃，15 min)。將反應後之基材用純水洗淨。滴加1 μM之帶His標籤之蛋白G之PBS溶液30 μL，於25℃下靜置1小時，藉此使帶His標籤之蛋白G固定化。將帶His標籤之蛋白G固定化後之基材用PBS洗淨。 滴加0.1 μM之抗CD9之PBS溶液30 μL，於25℃下靜置1小時，藉此對基材導入抗體。將抗體導入後之基材用PBS洗淨。 安裝於深江化成製造之扁平型移液管吸頭內，利用附帶螢光顯微鏡之自動分注裝置測定基材表面之螢光強度變化。 將PC3胞外體粒子PBS溶液之濃度設為0.03、0.3、3、30 fM。 1.晶片安裝 2.抽吸PBS 150 μL，進行F0測定×5 3.抽吸樣品(源自PC3之胞外體)100 μL 4.反應5 min(25℃) 5.全噴出 6.抽吸10 mM PBS(140 mM之NaCl，pH值7.4)150 μL 7.自動測定 螢光顯微鏡 相機：Zyla4.2 濾光器：Cy5 (激發波長604-644 nm，螢光波長672-712 nm) 物鏡：×5 曝光時間：0.5 sec 光量：12% 光源：水銀燈 8.重複3～7
(結果) 將結果示於圖17。於未使用氧化矽粒子核之空孔未形成之基材中，未產生對於胞外體之應答。
(實施例18：動物診斷例) 採集經獸醫確診之癌或內臟疾病之狗或貓之血液，測定胞外體。痊癒後再次測定胞外體，觀察其差異，藉此對是否能夠檢測狗或貓之癌或內臟疾病進行研究。 本發明之分析用感測器之用途 人以外之用途 1.包含寵物(貓、狗、鳥類等)動物之癌症之疾病之檢查 2.家畜(牛、馬、豬、雞等)所攜帶之感染症致病病毒或感染性蛋白質(朊病毒等)、其他病原性/感染性因子之檢測 3.有害動物(鳥類、蝙蝠、狐、貓鼬、浣熊等)所攜帶之感染症致病病毒或感染性蛋白質(朊病毒等)、其他病原性/感染性因子之檢測 4.水產品之品質或新鮮度檢查 5.農產品之品質或新鮮度檢查 6.植物或樹木等之病原菌、病毒檢查
(實施例19：臨床應用例) 於得到臨床實驗施行醫院之臨床研究審查委員會核准之臨床研究中，在患者同意之基礎上，癌症檢測之有無係藉由觀察全摘除手術前後之感測器應答之差異，對能否利用本感測器檢測出癌症進行研究。繼續進行觀察，對能否檢查癌症之轉移或復發進行研究。藥物療法之治療效果係針對能否以給藥前後之感測器應答之差異進行評價來進行研究。生活習慣疾病係針對能否基於攝取食物與感測器應答之關係來診斷進行研究。又，對能否根據感測器應答推定癌細胞表面抗原之存在而進行伴隨式診斷進行研究。進而，對能否基於感測器應答對使用細胞之治療中之細胞實施品質管理進行研究。 本發明之分析用感測器之用途 癌症之檢查 癌症手術時之摘除殘留檢查 癌症之轉移或復發之檢查 藥物療法之治療效果 生活習慣疾病之檢查 給藥目的之伴隨式診斷 細胞工學中之細胞品質管理
(附記) 如上所述，使用本發明之較佳實施方式對本發明進行了例示，但應理解，本發明僅由申請專利範圍來解釋其範圍。於本說明書中，關於所引用之專利、專利申請案及其他文獻，應理解，應與其內容本身被具體記載於本發明同樣地，將其內容作為本發明之參考援引。 [產業上之可利用性]
本發明中提供之技術能夠應用於以使用分子壓印之空孔形成作為基礎技術之一切感測晶片之製作，對於感測晶片之大量生產而言不可或缺，可利用於採用檢查分析技術之所有領域(包含診斷)。
圖1-1表示聚合物E2之NMR圖。 圖1-2表示聚合物E3之NMR圖。 圖1-3表示聚合物E4之NMR圖。 圖1-4a)～1-4d)表示氧化矽粒子與聚合物E2至E4一體化而成之粒子之DLS測定結果。 圖1-5a)～1-5d)表示氧化矽粒子與聚合物E2至E4一體化而成之粒子之Z-電位測定結果。 圖1-6表示氧化矽粒子與聚合物(E2-0)一體化而成之粒子之DLS測定結果及Z-電位測定結果。 圖2表示實施例2之粒子固定化基材之利用螢光顯微鏡獲得之觀察圖像。 圖3表示使用螢光觀察結果之雜交細胞計數解析結果。 圖4表示分析用感測器與B型肝炎病毒之吸附實驗之結果。 圖5表示分析用感測器與奈米抗體或全長抗體之吸附實驗之結果。 圖6-1表示實施例7之粒子固定化基材之利用螢光顯微鏡獲得之觀察圖像。 圖6-2表示實施例7之基材上之聚合物層聚合後之利用螢光顯微鏡獲得之觀察圖像。 圖6-3表示實施例7之基材之氧化矽奈米粒子去除後之利用螢光顯微鏡獲得之觀察圖像。 圖6-4表示實施例7之基材上之氧化矽奈米粒子及螢光性陽離子聚合物之利用螢光顯微鏡獲得之觀察圖像。 圖6-5表示使用直接型感測晶片之依存於胞外體濃度之螢光強度變化之結果。 圖7-1表示實施例8之粒子固定化基材之利用螢光顯微鏡獲得之觀察圖像。 圖7-2表示氟化氫銨處理後之利用螢光顯微鏡獲得之觀察圖像。 圖7-3表示氟化氫銨處理後之基材之膜厚測定結果。 圖7-4表示使用實施例8之分析用感測器之胞外體檢測結果。 圖8表示使用實施例9之分析用感測器之依存於胞外體濃度之螢光強度變化之結果。 圖9表示His標籤聚合物與氧化矽奈米粒子之複合體經固定化之基板之螢光顯微鏡圖像。 圖10表示陽離子氧化矽奈米粒子與陰離子聚合物Ex8之複合體經固定化之基板之螢光顯微鏡圖像及SEM圖像。 圖11表示使用生物降解性奈米粒子之粒子經固定化之基板之螢光顯微鏡圖像及SEM圖像。 圖12-1表示氧化矽奈米粒子與含有芳香族成分之陽離子聚合物E2P20之複合體經固定化之基板之螢光顯微鏡圖像及SEM圖像。 圖12-2表示聚苯乙烯奈米粒子與含有芳香族成分之陽離子聚合物E2P20之複合體經固定化之基板之螢光顯微鏡圖像。 圖13表示基於DLS之表面Z電位之測定結果。 圖14表示實施例16之固定化並聚合後之螢光顯微鏡圖像。 圖15表示實施例16之核粒子去除後之螢光顯微鏡圖像。 圖16表示導入有His標籤與硫醇基之氧化矽奈米粒子經固定化之基板之螢光顯微鏡圖像及SEM圖像。 圖17表示未使用粒子而製作之感測器之基材表面之螢光強度變化。

Claims (55)

  1. 一種粒子，其係包含 (A)粒子核、及 (B)修飾物質之(C)粒子，且 該粒子核包含(A1)粒子核之核、與(A2)粒子核上之含官能基之部分， 該修飾物質包含(B-1)能夠與該粒子核結合且能形成分子間化學鍵之第一官能基、及(B-2)賦予分析用感測器所需性質之第二官能基，此處，(B-1)之官能基與(B-2)之結合用基相同或不同， 該粒子核與該修飾物質利用該含官能基之部分與該第一官能基之分子間化學鍵而與該粒子核一體化。
  2. 如請求項1之粒子，其用於製造分析用感測器製作用基材。
  3. 如請求項1或2之粒子，其包含一種或複數種上述修飾物質。
  4. 如請求項1至3中任一項之粒子，其中上述修飾物質含有能夠結合於基材之取代基。
  5. 如請求項1至4中任一項之粒子，其中上述修飾物質具有選自由可逆性連結基及聚合性官能基所組成之群中之至少一個基。
  6. 如請求項1至5中任一項之粒子，其中上述修飾物質具有聚合性官能基。
  7. 如請求項1至6中任一項之粒子，其中上述修飾物質進而具有選自由訊號物質之結合用基、訊號物質、及可逆性連結基所組成之群中之至少一個。
  8. 如請求項1至7中任一項之粒子，其中上述修飾物質包含針對靶物質之特異性結合性分子之結合用基及訊號物質之結合用基；針對靶物質之特異性結合性分子之結合用基及訊號物質；或可逆性連結基。
  9. 如請求項1至8中任一項之粒子，其中上述可逆性連結基為二硫基、亞胺鍵基、肟基、腙鍵基、硼酸環狀酯鍵、羧酸酯基、羧酸硫酯基、或抗生物素蛋白-生物素鍵。
  10. 如請求項1至9中任一項之粒子，其中上述針對靶物質之特異性結合性分子之結合用基為胺基、羧基、二羥基硼基、硫醇基、馬來醯亞胺基、羰基、醛基、胺氧基、羥基、醯肼基、生物素基、源自次氮基三乙酸鎳之基、硫醇基或吡啶二硫基。
  11. 如請求項1至10中任一項之粒子，其中上述訊號物質之結合用基為胺基、羧基、二羥基硼基、硫醇基、馬來醯亞胺基、羰基、醛基、胺氧基、羥基、醯肼基、生物素基、源自次氮基三乙酸鎳之基、硫醇基或吡啶二硫基。
  12. 如請求項1至11中任一項之粒子，其中上述訊號物質為螢光分子、含放射性元素之物質、磁性物質、或酵素。
  13. 如請求項1至12中任一項之粒子，其中上述分子間化學鍵為非共價鍵。
  14. 如請求項1至13中任一項之粒子，其中上述非共價鍵為靜電相互作用。
  15. 如請求項1至14中任一項之粒子，其中粒子核包含氧化矽、聚苯乙烯、聚乳酸、聚甲基丙烯酸甲酯、聚乳酸-乙醇酸共聚物、聚葡萄胺糖、氧化鐵、金、銀、鉑、氧化鋁、氧化銅、氧化鈦、氧化鋅、氧化鋯、氧化鈰、氧化鈷、摻錫氧化銦(ITO)、摻銻氧化錫(ATO)、石墨烯、氧化石墨烯、奈米碳管、奈米金剛石、或者氫氧磷灰石或該等之任意組合。
  16. 如請求項1至15中任一項之粒子，其中粒子核包含氧化矽、或聚苯乙烯。
  17. 一種分析用感測器製作用基材之製造套組，其包含如請求項1至16中任一項之粒子、及 基材。
  18. 如請求項17之分析用感測器製作用基材之製造套組，其進而包含聚合物基質之原料。
  19. 一種如請求項1至16中任一項之粒子之用途，用於製造分析用感測器製作用基材。
  20. 一種如請求項1至16中任一項之粒子之製作方法，其包含： A)提供粒子核之步驟； B)提供利用能夠分離之分子間化學鍵而能與該核一體化之修飾物質之步驟；及 C)將該粒子核與該修飾物質供於該粒子核與該修飾物質藉由能夠分離之分子間化學鍵而一體化之條件之步驟。
  21. 一種用於製造分析用感測器製作用基材之方法，其包含： A)提供如請求項1至16中任一項之粒子之步驟； B)將該粒子配置於基材之步驟；及 C)藉由供於該粒子自該基材解離之條件而形成支架之步驟。
  22. 如請求項21之方法，其進而包含對固定有上述粒子之上述基材提供聚合物基質之原料之步驟。
  23. 如請求項22之方法，其進而包含藉由將上述基材供於上述聚合物基質進行聚合之條件，而形成配置有該聚合物基質之基材之步驟。
  24. 一種用於製造分析用感測器之方法，其包含： A)提供如請求項1至16中任一項之粒子之步驟； B)將該粒子配置於基材之步驟； C)藉由供於該粒子自該基材解離之條件而形成支架之步驟；及 D)使測定所需之物質結合於上述支架之步驟。
  25. 如請求項24之方法，其進而包含對配置有上述粒子之上述基材提供聚合物基質之原料之步驟。
  26. 如請求項25之方法，其進而包含藉由將上述基材供於上述聚合物基質進行聚合之條件，而形成配置有該聚合物基質之基材之步驟。
  27. 如請求項21至26中任一項之方法，其中於上述步驟C中，該粒子自該基材解離之條件為切斷可逆性連結基而製作可逆性結合基之條件。
  28. 如請求項21至27中任一項之方法，其中於上述步驟C之後，包含將支架內之上述可逆性結合基轉化為針對靶物質之特異性結合性分子之結合用基或訊號物質之結合用基之步驟。
  29. 一種分析用感測器製作用基材，其具有： A)基材； B)聚合物基質，其配置於該基材上，且該聚合物基質具有至少一部分適配對象分子之支架；及 C)配置於該支架之結合用基。
  30. 一種分析用感測器，其具有： A)基材； B)聚合物基質，其配置於該基材上，且該聚合物基質具有至少一部分適配對象分子之支架；及 C)與成為檢測對象之分子結合之特異性結合性分子之結合用基。
  31. 如請求項29之基材或如請求項30之感測器，其中上述聚合物基質之潔淨度為95%以上。
  32. 如請求項29之基材或如請求項30之感測器，其中上述基材中之該支架之規格值為80%以上。
  33. 如請求項29之基材或如請求項30至32中任一項之感測器，其中於上述基材上結合有源自利用能夠分離之分子間化學鍵而與該核一體化之一種或複數種修飾物質之取代基。
  34. 如請求項29之基材或如請求項30至33中任一項之感測器，其中上述源自修飾物質之取代基為胺基、酸性基、配位鍵性基、羰基、醛基、酮基、二羥基硼基、順式二醇基、硫醇基、生物素基、去硫生物素基、肽配體或可逆性連結基。
  35. 如請求項29之基材或如請求項30至34中任一項之感測器，其中上述胺基為一～四級胺基、脂肪族胺基、芳香族胺基、醯肼、胍、或脒。
  36. 如請求項29之基材或如請求項30至34中任一項之感測器，其中上述酸性基為羧基、磺酸基、或磷酸基。
  37. 如請求項29之基材或如請求項30至34中任一項之感測器，其中上述配位鍵性基為NTA基、或His標籤。
  38. 如請求項29之基材或如請求項30至34中任一項之感測器，其中上述肽配體為麩胱甘肽基、或RGD基。
  39. 如請求項29之基材或如請求項30至34中任一項之感測器，其中上述可逆性連結基為雙硫醚、吡啶雙硫醚、亞胺、肟、腙、硼酸環狀酯、羧酸酯、羧酸硫酯、或矽烷基。
  40. 一種分析用感測器，其具有： A)基材； B)聚合物基質，其配置於該基材上，且該聚合物基質具有至少一部分適配對象分子之支架； C)配置於該支架之源自利用分子間化學鍵而與該核一體化之修飾物質之取代基； D)配置於該支架之訊號物質之結合用基或訊號物質；及 E)與成為檢測對象之分子結合之特異性結合性分子之結合用基。
  41. 一種直接型基材型分析用感測器製作用基材，其係直接型基材型分析用感測器製造用基材，且包含： A)基材、及 B)如請求項1至16中任一項之粒子。
  42. 如請求項41之直接型基材型分析用感測器製作用基材，其進而包含配置於上述基材且配置有該粒子之聚合物基質。
  43. 如請求項41或42之直接型基材型分析用感測器製作用基材，其進而於最表層包含阻斷劑。
  44. 一種直接型基材型分析用感測器，其具有： A)基材、及 B)如請求項1至16中任一項之粒子。
  45. 如請求項44之直接型基材型分析用感測器，其進而具有配置於上述基材且配置有該粒子之聚合物基質。
  46. 如請求項44或45之直接型基材型分析用感測器，其進而於最表層具有阻斷劑。
  47. 如請求項44至46中任一項之直接型基材型分析用感測器，其中於上述粒子上進而具有特異性結合性分子之結合用基、及訊號物質之結合用基或訊號物質。
  48. 一種用於製造直接型分析用感測器製作用基材之方法，其包含： A)提供如請求項1至16中任一項之粒子之步驟、及 B)將該粒子配置於基材之步驟。
  49. 如請求項48之方法，其進而包含對固定有上述粒子之上述基材提供聚合物基質之原料之步驟。
  50. 如請求項49之方法，其進而包含藉由將該基材供於上述聚合物基質進行聚合之條件，而形成配置有該聚合物基質之基材之步驟。
  51. 一種方法，其係用於製造直接型分析用感測器之方法，其包含： A)提供如請求項1至16中任一項之粒子之步驟、及 B)將該粒子配置於基材之步驟。
  52. 如請求項51之方法，其進而包含對固定有上述粒子之該基材提供聚合物基質之原料之步驟。
  53. 如請求項52之方法，其進而包含藉由將該基材供於上述聚合物基質進行聚合之條件，而形成配置有該聚合物基質之基材之步驟。
  54. 如請求項53之方法，其進而包含使測定所需之物質結合於該粒子之步驟。
  55. 如請求項1之粒子，其中上述(A2)含官能基之部分為酸性基，且上述(B-1)第一官能基為鹼性基。
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